一種用rbsdv粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用RBSDV粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)是通過研磨RBSDV病樣釋放出病毒粒子，離心獲得病毒的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提純的病毒粒子進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明這個方法不需要提取RBSDV病毒粒子，操作簡便，大大減少了成本，節(jié)省了時間，較原有方法具有更方便、快捷和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可應(yīng)用于分析或篩選RBSDV病毒的互作蛋白。
【專利說明】—種用RBSDV粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本文發(fā)明一種用水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)(virus overlay-protein binding assay, V0PBA)的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)(VOPBA)是一種基于western blotting的分子生物學(xué)方法，可用于檢測蛋白-蛋白之間的相互作用、篩選病毒的互作蛋白等。其實(shí)驗(yàn)過程可以簡單描述為將待檢測的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE或雙向電泳等方法分離后，轉(zhuǎn)移并固定在膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜等)上，將提純的病毒粒子與膜共同孵育，使病毒和互作蛋白結(jié)合，然后用病毒特異性識別物質(zhì)(如抗體)去識別，最后經(jīng)顯色反應(yīng)將互作蛋白在膜上顯示出來。
[0003]病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)是獲取病毒互作蛋白的有效手段。Zhang等利用提純的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)粒子進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，獲取了豬肝臟細(xì)胞中的互作蛋白[I]。Thongtan等利用提純的日本乙腦病毒進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，獲得了微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的可能受體[2]。Li等利用提純的水稻條紋病毒粒子進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，獲取了介體昆蟲灰飛虱中與病毒互作的蛋白[3]。
[0004]水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)為呼腸孤病毒科，斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)病毒?？晌：λ?、玉米、小麥、大麥、高粱及燕麥等20多種禾本科寄主，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響。RBSDV不僅引起水稻黑條矮縮病，同時也是引起玉米粗縮病的病原。近年來，由RBSDV引起的水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病在我國華北、華東等地大規(guī)模流行，造成嚴(yán)重?fù)p失。該病毒主要通過介體昆蟲灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)以增殖型持久性方式傳播。獲取介體灰飛虱中與RBSDV互作的蛋白對研究RBSDV的蟲傳機(jī)制具有重要作用。
[0005]利用傳統(tǒng)的病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)來獲取RBSDV互作蛋白存在一定的缺陷。主要原因是該病毒主要存在于寄主植物葉脈的韌皮部中，很難獲得大量高純度的病毒粒子，而且該病毒粒子的外殼蛋白和表面突起極不穩(wěn)定，在病毒的純化過程中容易丟失，所以一般提純的病毒都是各種亞病毒粒子的混合物，不適宜用病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)來獲取RBSDV互作蛋白。為克服這一局限性，本文發(fā)明了一種用RBSDV粗提液代替提純的病毒粒子進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)來分析病毒互作蛋白的方法。該方法操作簡便，無需提純病毒，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，節(jié)省了提純病毒所需的人力物力。
[0006]參考文獻(xiàn):
[0007]1.Zhang w, Hua X, Shen Q, Yang S, Yin H, et al.1dentification ofgenotype4Hepatitis E virus binding proteins on swine liver cells.Virol J8:482.[0008]2.Thongtan T, Wikan N, Wintachai P, Rattanarungsan C, Srisomsap C, etal.Characterization of putative Japanese encephalitis virus receptor moleculeson microglial cells.J Med Virol84:615-623.[0009]3.Li S，Xiong R，Wang X，Zhou Y Five proteins of Laodelphax striatellusare potentially involved in the interactions between rice stripe virus andvector.PLoS 0ne6:e26585.
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種用RBSDV病汁液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法。
[0011]具體操作方法如下:
[0012](I)將RBSDV水稻或玉米病樣去根洗凈，切碎后用液氮碾磨，按每Ig病樣加入5ml0.0lM PBST的比例加入PBST溶液，混勻，放置15min，8000g離心lOmin，取上清。此上清即為RBSDV粗提液，放4°C冰箱備用；
[0013](2)將用于分析的蛋白或蛋白混合物進(jìn)行SDS-PAGE或雙向電泳(2D)分離，分離后采用半干轉(zhuǎn)移等方法將蛋白轉(zhuǎn)移到膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜)上；
[0014](3)電轉(zhuǎn)后的膜用0.0lM PBST漂洗兩次，每次5min ；
[0015](4)將膜用3%封閉液(3g脫脂牛奶/IOOml0.0lM PBST緩沖液)37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)；
[0016](5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0017](6)將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜；
[0018](5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0019](7)將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV的抗體中，37°C振蕩2h ；
[0020](8)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ；
[0021](9)將膜浸入3%封閉液稀釋的針對RBSDV抗體的二抗中，37°C振蕩1.5h ；
[0022](10)膜用 0.0lM PBST 漂洗三次，每次 5min ；
[0023](11)將膜浸入與二抗對應(yīng)標(biāo)記的底物顯色液中，37°C反應(yīng)至互作點(diǎn)顯色清晰，迅速用去離子水沖洗，以終止反應(yīng)，室溫晾干膜，拍照記錄。
[0024]本發(fā)明提供了一種用RBSDV粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法。該方法的特征是通過研磨病樣釋放出RBSDV病毒粒子，離心獲得RBSDV的粗提液，以RBSDV的粗提液而不是提純的病毒粒子進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明可用于分析蛋白與病毒的互作關(guān)系，篩選RBSDV的互作蛋白。此方法不需要提取RBSDV病毒粒子，大大減少了成本，節(jié)省了時間，具有操作簡便、快捷的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1采用本發(fā)明篩選灰飛虱中與RBSDV病毒粒子互作的蛋白。圖A為灰飛虱總蛋白經(jīng)雙向電泳分離后考馬斯亮藍(lán)染色圖。圖B為采用本發(fā)明找到的灰飛虱中的蛋白。圖中標(biāo)記的為與RBSDV互作的灰飛虱蛋白。
[0026]圖2米用本發(fā)明分析灰飛風(fēng)蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關(guān)系。圖A為誘導(dǎo)蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后考馬斯亮藍(lán)染色圖。圖B為采用本發(fā)明分析灰飛虱蛋白與RBSDV病毒粒子的互作結(jié)果。M:蛋白Marker，泳道1，空載體pET-32a，泳道2，3，4分別為用pET-32a誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白 actin、RACK、VPl、GAPDH3。
[0027]具體實(shí)施方法[0028]實(shí)例一用RBSDV病汁液進(jìn)行VOPBA篩選介體灰飛虱中的互作蛋白
[0029]RBSDV主要通過介體灰飛虱傳播，為獲取灰飛虱體內(nèi)參與RBSDV傳播的介體因子，采用本發(fā)明尋找介體灰飛虱中的互作蛋白。具體操作方法為dflOg RBSDV水稻病樣用液氮碾磨，加入50mi的0.01M PBST緩沖液，混勻，放置15min后，8000g離心lOmin，取上清，4°C保存?zhèn)溆茫惶崛』绎w虱總蛋白進(jìn)行雙向電泳分離，做2個重復(fù)；將其中一塊凝膠用于考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊凝膠通過半干轉(zhuǎn)移(20V，45min)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上^fPVDF膜用0.01M PBST漂洗兩次，每次5min ;將膜浸于3%封閉液中，37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)；再將膜漂洗三次；將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜；再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV多克隆抗體(I: 2000倍稀釋)中，37°C振蕩2h ;膜用0.01M PBST漂洗三次，每次5min ;將膜浸入3%封閉液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(I: 2000倍稀釋)中，37°C振蕩1.5h;再將膜漂洗三次；將膜浸入HRP標(biāo)記的底物顯色液中，37°C反應(yīng)至互作點(diǎn)顯色清晰，迅速用去離子水沖洗，以終止反應(yīng)，室溫晾干膜，拍照記錄。結(jié)果如圖1所示。圖1A和圖1B中顯示的蛋白點(diǎn)即為采用本發(fā)明找到的互作蛋白。
[0030]實(shí)例二用RBSDV粗提液進(jìn)行VOPBA分析灰飛虱蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關(guān)系
[0031]通過酵母雙雜交方法篩選到灰飛虱中與RBSDV PlO互作的蛋白actin、RACK、VPl和GAPDH3。為分析這些互作蛋白與RBSDV病毒粒子的互作關(guān)系，采用本發(fā)明方法分析它們與病毒的互作關(guān)系。具體操作方法為:將4g RBSDV水稻病樣用液氮碾磨，加入20ml的
0.01MPBST緩沖液，混勻，放置15min后，8000g離心lOmin，取上清，4°C保存?zhèn)溆?；將這些互作蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后利用半干轉(zhuǎn)移(15V，40min)將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將硝酸纖維素膜用0.01M PBST漂洗兩次，每次5min ;將膜浸于3%封閉液中，37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)；再將膜漂洗三次；用RBSDV粗提液覆蓋硝酸纖維素膜，20°C輕搖振蕩過夜；再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV多克隆抗體(I:2000倍稀釋)中，37°C振蕩2h ;再將膜漂洗三次；將膜浸入3%封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗中(以1:2`000倍稀釋)，37°C振蕩1.5h ；再將膜漂洗三次；將膜浸入HRP標(biāo)記的底物顯色液中，37°C反應(yīng)至互作點(diǎn)顯色清晰，迅速用去離子水沖洗，以終止反應(yīng)，室溫晾干膜，拍照記錄。結(jié)果如圖2所示。圖2B中可見與圖2A中表達(dá)蛋白對應(yīng)位置有一特異條帶，表明這些灰飛虱中的互作蛋白與RBSDV病毒粒子有互作關(guān)系。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明公開一種用RBSDV粗提液進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法，其方法如下: (1)將RBSDV水稻或玉米病樣去根洗凈，切碎后用液氮碾磨，按每Ig病樣加入5ml0.0lMPBST的比例加入PBST溶液，混勻，放置15min，8000g離心lOmin，取上清。此上清即為RBSDV粗提液，放4°C冰箱備用； (2)將用于分析的蛋白或蛋白混合物進(jìn)行SDS-PAGE或雙向電泳(2D)分離，分離后采用半干轉(zhuǎn)移等方法將蛋白轉(zhuǎn)移到膜(如硝酸纖維素膜、PVDF膜)上； (3)電轉(zhuǎn)后的膜用0.0lM PBST漂洗兩次，每次5min ； (4)將膜用3%封閉液(3g脫脂牛奶/IOOml0.0lM PBST緩沖液)37°C振蕩2h，以封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)； (5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (6)將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜； (5)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (7)將膜浸入3%封閉液稀釋的RBSDV的抗體中，37°C振蕩2h； (8)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (9)將膜浸入3%封閉液稀釋的針對RBSDV抗體的二抗中，37°C振蕩1.5h ； (10)膜用0.0lM PBST漂洗三次，每次5min ； (11)將膜浸入與二抗對應(yīng)標(biāo)記的底物顯色液中，37°C，反應(yīng)至互作點(diǎn)顯色清晰，迅速用去離子水沖洗，以終止反應(yīng)，室溫晾干膜，拍照記錄。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RBSDV粗提液標(biāo)記進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法，其特征在于步驟第6步“將膜浸入RBSDV粗提液中，20°C輕搖振蕩過夜”。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用RBSDV粗提液標(biāo)記進(jìn)行病毒覆蓋蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法，其特征在于RBSDV病毒粗提液按照步驟I方法制備。
【文檔編號】G01N33/68GK103592443SQ201310610988
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】徐秋芳, 陳晴晴, 周益軍, 倪海平 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院