一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法【專(zhuān)利摘要】一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步驟：（1）CdTe量子點(diǎn)的制備；（2）用于檢測(cè)反應(yīng)的母液配制；（3）量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法的建立；（4）檢測(cè)大米谷蛋白樣品時(shí)的前處理。本發(fā)明中的制備CdTe量子點(diǎn)的原料價(jià)格較低，量子點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，采用量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量時(shí)用量少，檢測(cè)成本低?！緦?zhuān)利說(shuō)明】一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種測(cè)定大米谷蛋白含量的方法，尤其是涉及一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]大米蛋白被公認(rèn)為優(yōu)質(zhì)食用蛋白，最初Osborne(1924年)根據(jù)溶解性質(zhì)將大米蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中谷蛋白和醇溶蛋白也叫貯藏蛋白，是大米中的主要蛋白成分，谷蛋白占總蛋白的80%以上(OsborneTB.TheVegetableProteins,2nded[Μ].NewYork:Longmans,Green&Co,1924,154.)。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)分析，大米蛋白中只有谷蛋白和球蛋白能被人體消化吸收(KumamaruT,SatohH,LwataN,etal.Mutantsforricestorageproteins[J].THEORAPPLGENET,1988,76:11-16.)，而且，在谷蛋白中，稻米第一限制性氨基酸一賴(lài)氨酸(Lys)含量最高，因而谷蛋白不但本身具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且其在大米中的含量能間接反映大米整體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此，建立一種快速檢測(cè)大米谷蛋白含量的方法可以便捷、準(zhǔn)確、可靠的鑒定大米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，為大米品質(zhì)評(píng)級(jí)、大米食品安全鑒定提供可靠依據(jù)。[0003]現(xiàn)有國(guó)內(nèi)大米蛋白的檢測(cè)方法主要為一凱氏定氮法(KjeldahlMethod),國(guó)外有少量利用考馬斯亮藍(lán)G2250和大米谷蛋白結(jié)合，產(chǎn)物引起染料最大吸收峰，反應(yīng)的速率約2min，產(chǎn)物穩(wěn)定性也較好(約Ih)，但存在靈敏度較低，選擇性較差且檢測(cè)成本高等問(wèn)題，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上還存在很大的局限性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靈敏度和回收率高，選擇性和重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，適于廣泛使用的基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法。[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是，一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法，包括以下步驟:(I)CdTe量子點(diǎn)的制備稱(chēng)取15~30mgTe粉、2(T60mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸餾水，注射器針頭留在玻璃瓶的蓋子上，且針頭不能被玻璃瓶中溶液所掩蓋，低溫2~8°C避光反應(yīng)2飛小時(shí)，獲反應(yīng)前體物質(zhì)；稱(chēng)取20(T260mgCdCl2和28(T360mg2-巰基乙胺，將其溶于160mL蒸餾水，然后采用0.5^1.5moI/L鹽酸將混合溶液pH調(diào)至5飛.5，混合溶液再轉(zhuǎn)入三頸燒瓶中；向三頸燒瓶通入N2，磁力攪拌混合溶液，待混合溶液溫度上升至85、8°C，冷凝回流，反應(yīng)2(T40min后，注入反應(yīng)前體物質(zhì)，反應(yīng)6(Tl20min，獲得CdTe量子點(diǎn)；CdTe量子點(diǎn)的粒徑大小、形態(tài)和性質(zhì)分析:采用高分辨率透射電子顯微鏡(HR-TEM)對(duì)CdTe量子點(diǎn)粒徑大小和形態(tài)進(jìn)行表征；將CdTe量子點(diǎn)分別置于不同pH、溫度和NaCl離子強(qiáng)度條件下，分析CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化；將CdTe量子點(diǎn)分別置于不同pH條件下為3~11(3、4、5、6、7、8、9、10和11);不同溫度條件下為0~55V(01:、251:、351:、451:和55°0;不同恥(:1離子強(qiáng)度條件下為0.1~0.9mol/L(0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L)；(2)用于檢測(cè)反應(yīng)的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，獲得pHll的檢測(cè)反應(yīng)的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，濃度均為0.04mol/L；(3)量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法的建立大米谷蛋白校準(zhǔn)液的制備，即將大米谷蛋白溶于步驟(2)所得母液中，配制成濃度為0.004~0.132mg/L的大米谷蛋白校準(zhǔn)液(0、0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1、0.116和0.132mg/L)，利用不同濃度的大米谷蛋白校準(zhǔn)液與量子點(diǎn)(濃度>0.1g/L)在1OmL棕色瓶避光的條件下反應(yīng)2(T40min，采用熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)365nm，夾縫寬度5nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm，夾縫寬度5nm，根據(jù)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，以此作為大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法；檢測(cè)方法的特異性和回收率分析:分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，將谷蛋白和清蛋白一起添加到步驟(2)所得50mL反應(yīng)的母液中，混合均勻，其余測(cè)定操作程序參考大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，確定各種濃度清蛋白對(duì)谷蛋白測(cè)定結(jié)果的干擾；另外檢驗(yàn)Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、Cr和S042_對(duì)谷蛋白測(cè)定的干擾試驗(yàn)；(4)檢測(cè)大米谷蛋白樣品時(shí)的前處理大米粉碎:每次稱(chēng)取準(zhǔn)備好的原料大米，放入粉碎機(jī)里研磨1-3min，磨成粉末狀后，取50g大米粉末，加pHll的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用離心機(jī)4500~6500r/min離心15^25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)大米谷蛋白含量。[0006]本發(fā)明之基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法，可以簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定大米中的谷蛋白的含量，和現(xiàn)有的凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法相比，能提高靈敏度、回收率和抗干擾能力，縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。[0007]本方法采用CdTe量子點(diǎn)作為熒光探針與大米谷蛋白進(jìn)行反應(yīng)，根據(jù)不同濃度的大米谷蛋白與稍過(guò)量的CdTe量子點(diǎn)反應(yīng)時(shí)，導(dǎo)致CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度有規(guī)律性的變化而建立測(cè)定蛋白的含量方法，與現(xiàn)有技術(shù)中采用的考馬斯亮藍(lán)G2250法相比，具有以下優(yōu)勢(shì):其一、靈敏度高，最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)0.4yg;其二、抗干擾能力強(qiáng)，特別是抗大米中清蛋白的干擾，這樣能有效提高檢測(cè)大米樣品中谷蛋白的準(zhǔn)確度；其三、CdTe量子點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，受環(huán)境溫度的影響小，因此對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求低，而且每次檢測(cè)用量少，一次性制備的量子點(diǎn)可常溫避光長(zhǎng)期貯藏備用；其四、量子點(diǎn)測(cè)定大米谷蛋白含量的操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)間較短(20min),提聞了檢測(cè)的效率。[0008]本發(fā)明中的制備CdTe量子點(diǎn)的原料價(jià)格較低，量子點(diǎn)制備簡(jiǎn)單，采用量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量時(shí)用量少，檢測(cè)成本低?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0009]圖1為本發(fā)明之CdTe量子點(diǎn)高分辨率透射電子顯微鏡(HR-TEM)觀察圖；圖2為pH對(duì)CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響圖；圖3為溫度對(duì)CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響圖；圖4為NaCl濃度對(duì)CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響圖；圖5為不同濃度的谷蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響；注:a—j對(duì)應(yīng)谷蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分布是0,0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1,0.116,0.132mg/L；圖6為量子點(diǎn)快速測(cè)定大米中谷蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。[0010]【具體實(shí)施方式】以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。[0011]實(shí)施例1本實(shí)施例包括以下步驟:(I)CdTe量子點(diǎn)的制備:稱(chēng)取25mgTe粉、40mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸餾水，注射器針頭留在玻璃瓶的蓋子上，且針頭不能被玻璃瓶中溶液所掩蓋，低溫4°C避光反應(yīng)4小時(shí),獲反應(yīng)前體物質(zhì)；稱(chēng)取200mgCdCl2和28011^2-巰基乙胺，將其溶于160mL蒸餾水，然后采用lmol/L鹽酸將混合溶液PH調(diào)至5.5，混合溶液再轉(zhuǎn)入三頸燒瓶中；向三頸燒瓶通入N2，磁力攪拌混合溶液，待混合溶液溫度上升至90°C，冷凝回流，反應(yīng)40min后,注入反應(yīng)前體物質(zhì),反應(yīng)60min,獲得CdTe量子點(diǎn)；CdTe量子點(diǎn)粒徑大小、形態(tài)和性質(zhì)分析采用高分辨率透射電子顯微鏡(HR-TEM)對(duì)CdTe量子點(diǎn)粒徑大小和形態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1，表明CdTe量子點(diǎn)呈現(xiàn)球狀，平均粒徑大小為7nm，粒度分布均勻。將CdTe量子點(diǎn)分別置于不同pH(3、4、5、6、7、8、9、10和11)下測(cè)試熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖2，表明CdTefi子點(diǎn)在堿性條件下熒光特性較好。將CdTe量子點(diǎn)分別置于不同溫度條件下(0、25、35、45和55°C)測(cè)試熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖3，表明CdTe量子點(diǎn)在溫度0-55°C熒光強(qiáng)度高。將CdTe量子點(diǎn)分別置于不同NaCl離子強(qiáng)度條件下(0.1,0.3,0.5,0.7,0.9mol/L)測(cè)試熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明NaCl離子強(qiáng)度在0.1-0.5mol/L內(nèi)對(duì)CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度影響不明顯，NaCl離子強(qiáng)度在0.7~0.5mol/L內(nèi)對(duì)CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度影響較大，因此采用大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)大米谷蛋白含量要求NaCl濃度<0.5mol/L。[0012](2)用于檢測(cè)反應(yīng)的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，獲得pHll的檢測(cè)反應(yīng)的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，濃度均為0.04mol/L。[0013](3)量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法的建立在10個(gè)25mL容量瓶中，編號(hào)為O—9，首先分別添加步驟(2)所制得的反應(yīng)母液2.0mL(含約3μg/L量子點(diǎn))，在編號(hào)O~9的容量瓶中分別加入谷蛋白，并用pH11.0的母液稀釋至刻度，搖勻，最終定容后編號(hào)O~9的容量瓶中谷蛋白濃度分別是，0.000,0.004、0.020,0.036,0.052,0.068,0.084,0.100,0.116,0.132mg/L,在25°C溫度下避光反應(yīng)20min，在激發(fā)波長(zhǎng)365nm(夾縫寬度5nm)，發(fā)射波長(zhǎng)550nm(夾縫寬度5nm)的條件下測(cè)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果如圖4，結(jié)果表明量子點(diǎn)強(qiáng)度隨谷蛋白濃度增加呈現(xiàn)有規(guī)律的增加，且呈線(xiàn)性關(guān)系，結(jié)果如圖5，回歸系數(shù)#為0.9985，說(shuō)明線(xiàn)性關(guān)系良好，建立檢測(cè)谷蛋白的直線(xiàn)回歸方程為7=3143^+187.74。檢測(cè)靈敏度達(dá)4μg，檢測(cè)范圍為0.004~0.132mg/L。[0014]檢測(cè)方法的特異性和回收率分析分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00mg大米谷蛋白和0.05mg、0.50mg和5.00mg大米清蛋白，將谷蛋白和清蛋白一起添加到50mL的母液中，混合均勻，其余測(cè)定操作參考上述大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，確定各種濃度清蛋白對(duì)谷蛋白測(cè)定結(jié)果的干擾。另外檢驗(yàn)Ca2+、Mg2+、Fe3+、Na+、CF和SO/—對(duì)谷蛋白測(cè)定的干擾試驗(yàn)。上述共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾如表1。[0015]【權(quán)利要求】1.一種基于量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)CdTe量子點(diǎn)的制備稱(chēng)取15~30mgTe粉、2(T60mgNaBH4放入小玻璃瓶中，用注射器向小玻璃瓶中注入ImL蒸餾水，低溫2~8°C避光反應(yīng)2飛小時(shí)，獲反應(yīng)前體物質(zhì)；稱(chēng)取20(T260mgCdCl2和28(T360mg2-巰基乙胺，將其溶于160mL蒸餾水，然后采用0.5^1.5moI/L鹽酸將混合溶液pH調(diào)至5飛.5，混合溶液再轉(zhuǎn)入三頸燒瓶中；向三頸燒瓶通入N2，磁力攪拌混合溶液，待混合溶液溫度上升至85、8°C，冷凝回流，反應(yīng)2(T40min后，注入反應(yīng)前體物質(zhì)，反應(yīng)6(Tl20min，獲得CdTe量子點(diǎn)；(2)用于檢測(cè)反應(yīng)的母液配制在IOOmL三酸混合液中，加入84.7mL0.2mol/L的NaOH溶液，獲得pHll的檢測(cè)反應(yīng)的母液；三酸混合液即磷酸、乙酸、硼酸的混合液，濃度均為0.04mol/L；(3)量子點(diǎn)快速測(cè)定大米谷蛋白含量的方法的建立大米谷蛋白校準(zhǔn)液的制備，即將大米谷蛋白溶于步驟(2)所得母液中，配制成濃度為.0.004~0.132mg/L的大米谷蛋白校準(zhǔn)液(0、0.004,0.02,0.036,0.052,0.068,0.084,0.1、.0.116和0.132mg/L)，利用不同濃度的大米谷蛋白校準(zhǔn)液與量子點(diǎn)(濃度>0.1g/L)在IOmL棕色瓶避光的條件下反應(yīng)2(T40min，采用熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)365nm，夾縫寬度5nm，發(fā)射波長(zhǎng)550nm，夾縫寬度5nm，根據(jù)量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，以此作為大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法；(4)檢測(cè)大米谷蛋白樣品時(shí)的前處理大米粉碎:每次稱(chēng)取準(zhǔn)備好的原料大米，放入粉碎機(jī)里研磨1~3min，磨成粉末狀后，取50g大米粉末，加pHll的NaOH溶液浸泡提取2~3h，再用離心機(jī)4500~6500r/min離心15^25min，收集蛋白上清液，采用大米谷蛋白檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)大米谷蛋白含量?！疚臋n編號(hào)】G01N21/64GK103604790SQ201310615554【公開(kāi)日】2014年2月26日申請(qǐng)日期:2013年11月28日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日【發(fā)明者】孫術(shù)國(guó),林親錄,楊濤,徐友志,丁玉琴,羅非君,周慧,翁光輝申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)