一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法。它以斑馬魚為測試生物，將其暴露于典型抗生素廢水中，通過分析典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性、亞急性毒性，定量地測定典型抗生素廢水對斑馬魚的短期或長期毒性效應(yīng)，急性毒性以96小時(shí)半數(shù)致死濃度（96h?LC50）（典型抗生素廢水體積百分比%）描述，亞急性毒性以魚體生化指標(biāo)，如超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、丙二醛（MDA）含量等描述。采用該方法可以對典型抗生素廢水的毒性特征和毒性水平進(jìn)行分析測試和定量描述，解決常規(guī)理化指標(biāo)不能反映的典型抗生素廢水生物毒性，同時(shí)可作為典型抗生素廢水生物毒性監(jiān)測和評價(jià)的指標(biāo)。
【專利說明】—種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素廢水是一類色度高、含難降解和生物毒性物質(zhì)多的高濃度有機(jī)廢水。2010年7月國家環(huán)保部頒布了《制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》，其中規(guī)定了以抗生素等為主的發(fā)酵類制藥工業(yè)企業(yè)水污染物的排放限值、監(jiān)測和監(jiān)控要求。涉及毒性的排放指標(biāo)只有急性毒性指標(biāo)(HgCl2毒性當(dāng)量)，測試方法為發(fā)光細(xì)菌法，該指標(biāo)僅能反映抗生素廢水是否對發(fā)光菌有毒性，但發(fā)光菌為低等生物，其結(jié)果不能代表抗生素廢水對高等生物的影響，為此需要尋找新的方法和指標(biāo)來評價(jià)抗生素廢水的生物毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為解決現(xiàn)在抗生素廢水生物毒性定性和定量評估的問題，提供了一種采用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法。該方法采用急性毒性、亞急性毒性測試，定性和定量兩種指標(biāo)描述典型抗生素廢水的生物毒性，彌補(bǔ)抗生素廢水生物毒性監(jiān)測指標(biāo)的不足。
[0004]本發(fā)明的思路是，采用短期(96小時(shí))暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性，以96h LC50 (典型抗生素廢水的體積百分比％)描述，采用長期(20天)暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標(biāo)表示。
[0005]判斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為:急性毒性測定得到96hLC5tl (典型抗生素廢水的體積百分比％);亞急性毒性為典型抗生素廢水對斑馬魚魚體抗氧化指標(biāo)的影響是否顯著。如果暴露組與空白對照組差異顯著:認(rèn)為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性。暴露組與空白對照組差異不顯著:認(rèn)為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。依據(jù)上述判據(jù)評估典型抗生素廢水對斑馬魚的毒性類型以及毒性水平，從而可以確定典型抗生素廢水的毒性類型(屬于急性毒性還是亞急性毒性)和毒性水平(毒性的顯著性水平)。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0007]—種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，該方法采用斑馬魚體內(nèi)試驗(yàn)方法，分別利用短期(96小時(shí))和長期(20天)暴露方式描述典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性和亞急性毒性，判斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為:急性毒性以96hLC50 (典型抗生素廢水體積百分比％)描述；亞急性毒性以一組抗氧化指標(biāo)描述；
[0008]利用短期(96小時(shí))暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性，急性毒性測定得到96h LC50 (典型抗生素廢水體積百分比％);以96h LC5tl描述急性毒性；
[0009]利用長期(20天)暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標(biāo)表示，然后利用顯著性t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)暴露組與空白對照組間的差異，當(dāng)t < ta(l5(n)，即P > 0.05時(shí)，認(rèn)為無顯著性差異；當(dāng) t0.05 (n) ≤ t〈 to o! (n)， 即0.01 < P≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)t >
t。.01 (η)，
即P ≤ 0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著；[0010]本測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著(0.01<P<0.05或者Ρ〈0.01)，則認(rèn)為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性，若暴露組與空白對照組差異不顯著，則認(rèn)為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。
[0011]所述的利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，它包括以下具體步驟:
[0012](I)準(zhǔn)備測試生物，選用斑馬魚(Zebra Fish)為受試生物，雌雄個(gè)體各半，斑馬魚經(jīng)5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7天，在預(yù)實(shí)驗(yàn)前一天和試驗(yàn)期間不予喂食，避免魚餌對測試結(jié)果產(chǎn)生影響；
[0013](2)準(zhǔn)備測試條件，試驗(yàn)溶液pH值為7.0?8.5 ;總硬度為240?250mg/L (以CaCO3計(jì))，試驗(yàn)溫度為23?25°C ;溶解氧高于5mg/L ;采用自然光照；試驗(yàn)周期為96h (預(yù)實(shí)驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間)或20d (亞急性毒性實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間);試驗(yàn)方式為靜水式(每24h更換一次試液)，每天至少測定I次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量；
[0014](3)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，在50cmX20cmX25cm的玻璃水族缸中，盛放20L試驗(yàn)溶液，分為5?6個(gè)暴露組，暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30% ；土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6% ;鏈霉素廢水暴露濃度組為1%、3.2%、10%、32%、100% ;不設(shè)平行組，每個(gè)暴露組放5尾斑馬魚，連續(xù)實(shí)驗(yàn)96h，每日至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚數(shù)并及時(shí)取出死魚；計(jì)算得出預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)和最高的96h無死亡濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)。
[0015]青霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為20% (青霉素廢水的體積百分比％)和10% (青霉素廢水的體積百分比％)。
[0016]土霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為0.1% (土霉素廢水的體積百分比％)和0.5% (土霉素廢水的體積百分比％)。
[0017]鏈霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為100% (鏈霉素廢水的體積百分比％)和10% (鏈霉素廢水的體積百分比％)。
[0018](4)急性毒性測試方法根據(jù)所述步驟(3)的測試結(jié)果，在24h絕對致死濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)和最高的96h無死亡濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個(gè)暴露組，暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、15.81%、19.88%、24.99% ; 土霉素廢水暴露濃度組為 0.1%、0.15%、0.22%、0.33%、
0.5% ;鏈霉素廢水暴露濃度組為17.78%,23.71%,31.62%,42.17%,56.23%。每個(gè)暴露組設(shè)2個(gè)平行組，并設(shè)置空白對照組，共計(jì)11個(gè)組，每個(gè)暴露組隨機(jī)放入8尾斑馬魚，試驗(yàn)周期為96h，試驗(yàn)結(jié)果以半數(shù)致死濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)表示，每隔24h更換I次試驗(yàn)溶液，采用寇式法和概率單位法兩種方法計(jì)算得出96h LC5tl(典型抗生素廢水的體積百分比％)及其95%的置信限。
[0019]急性毒性測試結(jié)果為:青霉素廢水96h LC50為13.46% (寇式法)和13.66% (概率單位法);土霉素廢水96h LC50為0.22% (寇式法)和0.19% (概率單位法);鏈霉素廢水96hLC50為25.56% (寇式法)和29.51% (概率單位法)。
[0020](5)亞急性毒性測試方法參照步驟(4)的測試結(jié)果設(shè)置亞急性的暴露組，暴露組濃度在1/6 96h LC5tl和1/2 96h LC5tl之間，設(shè)置5個(gè)暴露組，青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為 1/256 96h LC50U/64 96hLC50、l/16 96h LC50U/4 96h LC50,1/2 96h LC500暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。每個(gè)暴露組設(shè)置2個(gè)平行組，I個(gè)空白對照組，共計(jì)16個(gè)組。暴露時(shí)間為20天，選取健康的斑馬魚，雌雄個(gè)體各半，每個(gè)組15尾斑馬魚，每天換水。5個(gè)暴露組分別于第4、8、12、16和20天取生物樣進(jìn)行分析，每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測定POD活性、SOD活性和MDA含量，測試結(jié)果為暴露組與空白對照組相比，POD活性、SOD活性和MDA含量有顯著差異； [0021]所述試驗(yàn)溶液為典型抗生素廢水和除氯自來水的混合溶液。
[0022]測試結(jié)果為對比暴露組與空白對照組的POD活性、SOD活性和MDA含量，利用顯著性t檢驗(yàn),檢驗(yàn)暴露組與空白對照組間的差異，當(dāng)t < ta(l5(n),即P > 0.05時(shí),認(rèn)為無顯著性差異；當(dāng)V

05(n) ^ t〈 t0.01 (η)，

即0.01 < P≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)t >
t0.01 (η)，即
P 0.01時(shí),認(rèn)為差異極顯著。
[0023]本發(fā)明測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著(0.01〈Ρ〈0.05或者ρ〈0.01)，則認(rèn)為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性，若暴露組與空白對照組差異不顯著，則認(rèn)為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。
[0024]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的顯著效果為:
[0025]本發(fā)明方法可以對典型抗生素廢水的毒性特征和毒性水平進(jìn)行分析測試和定量描述，解決常規(guī)理化指標(biāo)，如化學(xué)需氧量(C0D)、生化需氧量(BOD)、pH等不能反映的典型抗生素廢水生物毒性，同時(shí)可以作為典型抗生素廢水生物毒性監(jiān)測和評價(jià)的指標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0026]本發(fā)明是一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，它包括以下步驟:
[0027](I)準(zhǔn)備測試生物選用斑馬魚(Zebra Fish)為受試生物，雌雄個(gè)體各半。斑馬魚經(jīng)5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7天，在預(yù)實(shí)驗(yàn)前一天和試驗(yàn)期間不予喂食，避免魚餌對測試結(jié)果產(chǎn)生影響。
[0028](2)準(zhǔn)備測試條件，試驗(yàn)溶液pH值為7.0~8.5 ;總硬度為240~250mg/L (以CaCO3計(jì))，試驗(yàn)溫度為23~25°C ;溶解氧高于5mg/L ;采用自然光照；試驗(yàn)周期為96h (預(yù)實(shí)驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間)或20d (亞急性毒性實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間);試驗(yàn)方式為靜水式(每24h更換一次試液)，每天至少測定I次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量。
[0029]以下所述試驗(yàn)溶液為典型抗生素廢水和除氯自來水的混合溶液。
[0030](3)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法在50cmX 20cmX 25cm的玻璃水族缸中，盛放20L試驗(yàn)溶液，分為5~6個(gè)暴露組，暴露組中典型抗生素廢水的濃度用其體積百分比描述。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30% ;土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6% ;鏈霉素廢水暴露濃度組為1%、3.2%、10%、32%、100% ;不設(shè)平行組，每個(gè)暴露組放5尾斑馬魚，連續(xù)實(shí)驗(yàn)96h，每日至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚數(shù)并及時(shí)取出死魚。計(jì)算得出預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)和最高的96h無死亡濃度(典型抗生素廢水的體積百分比％)。
[0031]預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:青霉素廢水最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為20%和10%。土霉素廢水最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為0.1%和0.5%。鏈霉素廢水最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為100%和10%。
[0032](4)急性毒性測試方法根據(jù)所述步驟(3)的測試結(jié)果，在24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個(gè)暴露組。暴露組中典型抗生素廢水的濃度用其體積百分比描述。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、15.81%、19.88%,24.99%和空白對照組；土霉素廢水暴露濃度組為 0.1%、0.15%、0.22%,0.33%,0.5%和空白對照組；鏈霉素廢水暴露濃度組為17.78%,23.71%、31.62%,42.17%,56.23%和空白對照組。每個(gè)暴露組設(shè)2個(gè)平行組，并設(shè)置空白對照組，共計(jì)11個(gè)組，每個(gè)暴露組隨機(jī)放入8尾斑馬魚，試驗(yàn)周期為96h，試驗(yàn)結(jié)果以半數(shù)致死濃度表示，每隔24h更換I次試驗(yàn)溶液，計(jì)算得出96h LC50 (典型抗生素廢水的體積百分比％)及其95%的置信限。
[0033]急性毒性測試結(jié)果為:青霉素廢水96h LC50為13.46% (寇式法)和13.66% (概率單位法);土霉素廢水96h LC50為0.22% (寇式法)和0.19% (概率單位法);鏈霉素廢水96hLC50為25.56% (寇式法)和29.51% (概率單位法)。
[0034](5)亞急性毒性測試方法，參照步驟(4)的測試結(jié)果，設(shè)置5個(gè)暴露組，暴露組濃度在1/6 96h LC5tl和1/2 96h LC5tl之間，青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為1/25696h LC50U/64 96h LC50、1/16 96h LC50U/4 96h LC50U/2 96h LC50 0 暴露組中典型抗生素廢水的濃度用其體積百分比描述。每個(gè)暴露組設(shè)置2個(gè)平行組，I個(gè)空白對照組，共計(jì)16個(gè)組。暴露時(shí)間為20天，選取健康的斑馬魚，雌雄個(gè)體各半，每個(gè)組15尾斑馬魚，每天換水。5個(gè)暴露組分別于第4、8、12、16和20天取生物樣進(jìn)行分析，每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測定POD活性、SOD活性和MDA含量。
[0035]測試結(jié)果為對比暴露組與空白對照組的POD活性、SOD活性和MDA含量，利用顯著性t檢驗(yàn),檢驗(yàn)暴露組與空白對照組間的差異，當(dāng)t < ta(l5(n),即P > 0.05時(shí),認(rèn)為無顯著性差異；當(dāng)V

05(n) ^ t〈 t0.01 (η)，

即0.01 < P≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)t >
t0.01 (η)，即
P 0.01時(shí),認(rèn)為差異極顯著。
[0036]本方法認(rèn)為，如果暴露組與空白對照組差異顯著(0.01〈Ρ〈0.05或者P〈0.01 )，則認(rèn)為典型抗生素廢水對斑馬魚有亞急性毒性，若暴露組與空白對照組差異不顯著，則認(rèn)為典型抗生素廢水對斑馬魚無亞急性毒性。
[0037]實(shí)例I
[0038]以下以青霉素廢水為例，說明本發(fā)明提出的毒性測試方法的【具體實(shí)施方式】。
[0039]選用幼齡斑馬魚(Zebra Fish)為測試生物，斑馬魚由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體長為(34.05±0.43)mm，體重為(0.24±0.03) g。實(shí)驗(yàn)用魚經(jīng)5%食鹽水消毒后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，用48h曝氣的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7天，在實(shí)驗(yàn)前一天和試驗(yàn)期間不予喂食，避免魚餌對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。測試條件滿足要求。
[0040](I)預(yù)實(shí)驗(yàn)方法在50cmX20cmX25cm的玻璃水族缸中，盛放20L試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)溶液為青霉素廢水和除氯自來水的混合液。
[0041]預(yù)試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)暴露組，暴露組以試驗(yàn)溶液中所含青霉素廢水的體積百分比表示，暴露組為5%、10%、15%、20%、25%、30%，不設(shè)平行，每個(gè)暴露組放5尾斑馬魚，連續(xù)實(shí)驗(yàn)96h,計(jì)算得出最低的24h絕對致死濃度(青霉素廢水體積百分比％)和最高的96h無死亡濃度(青霉素廢水體積百分比％)。
[0042]預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:青霉素廢水對斑馬魚的預(yù)實(shí)驗(yàn)持續(xù)進(jìn)行96h，得到最低的24h絕對致死濃度為20% ;最高的96h無死亡濃度10%。
[0043](2)急性毒性試驗(yàn)方法根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個(gè)暴露組，暴露組以試驗(yàn)溶液中所含青霉素廢水的體積百分比表示，青霉素廢水對斑馬魚的急性毒性暴露組設(shè)置分別為10%、12.57%、15.81%、19.88%、24.99%，每個(gè)暴露組設(shè)2個(gè)平行組，并設(shè)置I個(gè)空白對照組，每個(gè)暴露組隨機(jī)放入8尾斑馬魚，雌雄個(gè)體各半。試驗(yàn)周期為96h，試驗(yàn)結(jié)果以半數(shù)致死濃度LC50 (青霉素廢水體積百分比％)表示。為防止餌料影響，在試驗(yàn)前一天和試驗(yàn)期間不喂食。
[0044]急性毒性試驗(yàn)結(jié)果:斑馬魚暴露于試驗(yàn)溶液中時(shí)，根據(jù)斑馬魚的死亡率，分別采用寇氏法和概率單位法計(jì)算該試驗(yàn)溶液對斑馬魚的LC50(青霉素廢水體積百分比％)(見表1和表2)。
[0045]表1寇氏法所得青霉素廢水對斑馬魚急性毒性值
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，其特征是， 該方法采用斑馬魚體內(nèi)試驗(yàn)方法，分別利用短期即96小時(shí)和長期即20天的暴露方式描述典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性和亞急性毒性，判斷典型抗生素廢水對斑馬魚是否具有毒性的判據(jù)為:急性毒性以96h LC50描述；亞急性毒性以一組抗氧化指標(biāo)描述； 利用短期暴露方式，測定得到典型抗生素廢水對斑馬魚的急性毒性，急性毒性測定得到96h LC50 ；以96h LC50描述急性毒性； 利用長期暴露方式，亞急性毒性以魚體的一組抗氧化指標(biāo)表示，然后利用顯著性t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)暴露組與空白對照組間的差異，當(dāng)t < ta(l5(n)，即P > 0.05時(shí)，認(rèn)為無顯著性差異；當(dāng) ^0.05 (n) ^ t〈 ^0.01 (η) ?
即0.01 < P≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)t >t0.01 (η)，艮P P € 0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著； 本測試方法為，如果暴露組與空白對照組差異顯著，即0.01<Ρ<0.05或者Ρ〈0.01時(shí)，則認(rèn)為典型抗生素廢水有亞急性生物毒性，若暴露組與空白對照組差異不顯著，則認(rèn)為典型抗生素廢水無亞急性生物毒性。
2.如權(quán)利要求1所述的利用斑馬魚測試典型抗生素廢水毒性的方法，其特征是，它包括以下具體步驟: (1)準(zhǔn)備測試生物，選用斑馬魚為受試生物，雌雄個(gè)體各半，斑馬魚經(jīng)5%食鹽水消毒后，用曝氣48h的脫氯自來水在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)7天，在預(yù)實(shí)驗(yàn)前一天和試驗(yàn)期間不予喂食，避免魚餌對測試結(jié)果產(chǎn)生影響； (2)準(zhǔn)備測試條件，試驗(yàn)溶液pH值為7.0~8.5 ;總硬度以CaCO3計(jì)為240~250mg/L，試驗(yàn)溫度為23~25°C ;溶解氧高于5mg/L ;采用自然光照；試驗(yàn)周期為96h或20d ;試驗(yàn)方式為靜水式，即每24h更換一次試液，每天至少測定I次試驗(yàn)溶液的水溫、硬度、pH值、溶解氧含量； (3)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，在50cmX20cmX25cm的玻璃水族缸中，盛放20L試驗(yàn)溶液，分為5~.6個(gè)暴露組，暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為5%、10%、15%、20%、25%和30% ;土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6% ;鏈霉素廢水暴露濃度組為1%、.3.2%、10%、32%、100% ;不設(shè)平行組，每個(gè)暴露組放5尾斑馬魚，連續(xù)實(shí)驗(yàn)96h，每日至少兩次記錄各容器內(nèi)的死魚數(shù)并及時(shí)取出死魚；計(jì)算得出預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度； 青霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為.20% 和 10% ； 土霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為.0.1% 和 0.5% ； 鏈霉素廢水預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:最低的24h絕對致死濃度和最高的96h無死亡濃度分別為.100% 和 10% ； (4)急性毒性測試方法根據(jù)所述步驟(3)的測試結(jié)果，在24h絕對致死濃度和最高的.96h無死亡濃度之間按等對數(shù)間距設(shè)置5個(gè)暴露組，暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示。三種典型抗生素廢水暴露組分別設(shè)置如下:青霉素廢水暴露濃度組為10%、12.57%、15.81%、19.88%,24.99% ;土霉素廢水暴露濃度組為0.1%、0.15%、.0.22%,0.33%,0.5% ;鏈霉素廢水暴露濃度組為 17.78%,23.71%,31.62%,42.17%,56.23% ;每個(gè)暴露組設(shè)2個(gè)平行組，并設(shè)置空白對照組，共計(jì)11個(gè)組，每個(gè)暴露組隨機(jī)放入8尾斑馬魚，試驗(yàn)周期為96h，試驗(yàn)結(jié)果以半數(shù)致死濃度表示，每隔24h更換I次試驗(yàn)溶液，采用寇式法和概率單位法兩種方法計(jì)算得出96h LC50及其95%的置信限； 急性毒性測試結(jié)果為:青霉素廢水96h LC50為以寇式法計(jì)算的13.46%和以概率單位法計(jì)算的13.66% ;土霉素廢水96h LC50為以寇式法計(jì)算的0.22%和以概率單位法計(jì)算的.0.19% ;鏈霉素廢水96h LC5tl為以寇式法計(jì)算的25.56%和以概率單位法計(jì)算的29.51% ； (5)亞急性毒性測試方法參照步驟(4)的測試結(jié)果設(shè)置亞急性的暴露組，暴露組濃度在1/6 96h LC5tl和1/2 96h LC5tl之間，設(shè)置5個(gè)暴露組，青霉素廢水、土霉素和鏈霉素暴露濃度組均為 1/256 96h LC50U/64 96hLC50、l/16 96h LC50U/4 96h LC50U/2 96h LC50，暴露組濃度以試驗(yàn)溶液中含典型抗生素廢水的體積百分比表示，每個(gè)暴露組設(shè)置2個(gè)平行組，I個(gè)空白對照組，共計(jì)16個(gè)組。暴露時(shí)間為20天，選取健康的斑馬魚，雌雄個(gè)體各半，每個(gè)組15尾斑馬魚,每天換水。5個(gè)暴露組分別于第4、8、12、16和20天取生物樣進(jìn)行分析,每次各暴露組分別取2尾斑馬魚，測定POD活性、SOD活性和MDA含量，測試結(jié)果為暴露組與空白對照組相比，POD活性、SOD活性和MDA含量有顯著差異； 所述試驗(yàn)溶液為典型抗 生素廢水和除氯自來水的混合溶液。
【文檔編號(hào)】G01N33/18GK103616489SQ201310625401
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】沈洪艷, 楊雷, 武晨虹 申請人:河北科技大學(xué)