一種診斷卵巢癌的磁性納米探針的制備方法及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種診斷卵巢癌的磁性納米探針的制備方法，步驟如下：（1）磁性納米粒子的制備與表征；（2）磁性納米粒子的硅烷化及氨基化修飾與表征；（3）采用氨基硅烷化的磁性納米粒子，經(jīng)戊二醛活化后，與CA125單抗交聯(lián)制備卵巢癌磁性納米探針。同時(shí)，本發(fā)明還公開(kāi)了一種診斷卵巢癌的檢測(cè)方法。本發(fā)明制備的磁性納米探針，磁性粒子體積小可吸附更多抗原或抗體，因磁性微粒子核心為鐵，在磁場(chǎng)中下沉速度快，易進(jìn)行洗滌和固相載體分離；可特異性的捕獲早期卵巢癌患者外周血中的CA125，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對(duì)富集后的樣品進(jìn)行檢測(cè)，構(gòu)建一種基于納米探針在卵巢癌預(yù)警及早期診斷的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】ー種診斷卵巢癌的磁性納米探針的制備方法及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及ー種磁性納米探針的制備和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及ー種腫瘤預(yù)防學(xué)以腫瘤標(biāo)志物CA125磁性納米探針的制備方法，用于卵巢癌的早期診斷。
【背景技術(shù)】
[0002]卵巣癌病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位，早期幾乎沒(méi)有癥狀。由于缺乏有效的早期診斷和篩查方法，80%的卵巣癌確診時(shí)已屬晚期，5年生存率僅30%左右，而早期卵巣癌(I期，II期)患者5年生存率達(dá)90%，提高卵巣癌整體生存率的根本在于早期發(fā)現(xiàn)。因此，尋找有效的早期診斷和預(yù)警方法，是改善卵巣癌總體預(yù)后、降低治療成本、提高生活質(zhì)量的根本途徑。
[0003]腫瘤標(biāo)志物在癌癥臨床診療中具有重要作用，但目前腫瘤標(biāo)志物因?qū)υ缙谠\斷的敏感性低而難以廣泛應(yīng)用，癌癥的早期診斷一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。納米技術(shù)進(jìn)行惡性腫瘤早期診斷和治療是目前生物【技術(shù)領(lǐng)域】中最前沿的研究課題之一。由于腫瘤所特有的病理生理變化，在腫瘤的診斷治療中，納米技術(shù)能更好地檢測(cè)疾病所導(dǎo)致的分子和細(xì)胞改變。利用納米微粒進(jìn)行細(xì)胞分離技術(shù)很可能在腫瘤患者早期的血液中檢查出癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)癌癥的早期診斷和治療。磁性納米粒子(10-100 nm)具有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性和磁場(chǎng)響應(yīng)性等特點(diǎn)，因而納米生物學(xué)領(lǐng)域取得的進(jìn)展將為卵巢癌預(yù)警與早期診斷研究提供新的方法。
[0004]CA125是卵巢上皮性癌首選標(biāo)志物，在胚胎發(fā)育中存在于體腔上皮化生組織，出生后消失。成人及胎兒卵巢上皮不含CA125，卵巢癌細(xì)胞CA125陽(yáng)性。80%晩期卵巢癌患者CA-125值升高，對(duì)晚期卵巢癌的敏感度可達(dá)90%，但對(duì)早期卵巢癌診斷的敏感度較低，僅有50-60%，且在子宮內(nèi)膜異位癥及炎癥中均有升高。CA125被用于作為ー種癌抗原，通過(guò)分析患者外周血腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)以明確早期卵巣癌的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種診斷卵巣癌的磁性納米探針的制備方法。本發(fā)明制備的磁性納米探針，磁性粒子體積小可吸附更多抗原或抗體，因磁性微粒子核心為鐵，在磁場(chǎng)中下沉速度快，易進(jìn)行洗滌和固相載體分離；可特異性的捕獲早期卵巣癌患者外周血中的CA125，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)富集后的樣品進(jìn)行檢測(cè)。
[0006]同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種診斷卵巣癌的檢測(cè)方法，該方法構(gòu)建ー種基于納米探針在卵巣癌預(yù)警及早期診斷的方法。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
一種診斷卵巣癌的磁性納米探針的制備方法，該方法包括如下步驟:
(I)在堿性條件下，采用共沉淀法制備了磁性納米粒子，并利用檸檬酸鈉對(duì)其進(jìn)行修飾，將修飾后的磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑TEOS反應(yīng)，制備得到硅烷化Fe3O4磁性納米粒子； (2)將硅烷化Fe3O4磁性納米粒子與氨基硅烷化試劑APTES反應(yīng)，制備得到氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子，使娃燒化Fe3O4磁性納米粒子表面帶有活性較強(qiáng)的氨基功能基團(tuán)；
(3)氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子經(jīng)戊ニ醛活化后，與CA125單抗交聯(lián)制備磁性納米探針。
[0008]相應(yīng)地，本發(fā)明提供的一種診斷卵巢癌的檢測(cè)方法，建立一種基于磁性納米探針為標(biāo)記雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)CA125的檢測(cè)方法。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
1、制備的卵巢癌納米探針功能性磁性納米顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下方便、快速地進(jìn)行定位、導(dǎo)向及分離。
[0010]2、建立一種基于磁性納米探針為標(biāo)記雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)CA125的檢測(cè)方法；以磁性納米粒子作為固相載體，將磁性納米粒子上的氨基與CA125抗體鏈接，制備成CA125磁性納米探針，將未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)通過(guò)磁性分離除去；制備好的CA125磁性納米探針可以特異性捕獲樣品中的抗原，形成磁性納米微球固相抗原復(fù)合物，通過(guò)磁性分離除去未結(jié)合的物質(zhì)；再加上酶標(biāo)的CA125抗體進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0011]3、生物相容性問(wèn)題以及如何避免包覆的高分子層在使用及儲(chǔ)藏過(guò)程中的分解是功能性磁性納米顆粒在應(yīng)用過(guò)程中需首要解決的問(wèn)題。功能性磁性納米顆粒表面修飾有一定量的OH、NH2, C00H、CHO等功能基團(tuán)，從而可以使特定的生物活性物質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用力偶聯(lián)到磁性納米顆粒表面，多數(shù)生物高分子如多糖，蛋白質(zhì)類(lèi)因其安全無(wú)毒，可降解，同時(shí)具有良好的生物相容性而受到了廣泛關(guān)注，可應(yīng)用于磁性載體的表面修飾反應(yīng)中。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為Fe3O4納米的XRD圖譜；
圖2為硅烷化四氧化三鐵的XRD圖；
圖3為磁性納米粒子的IR表征圖(圖上方為Fe3O4紅外圖譜，圖下方為硅烷化Fe3O4圖
譜)；
圖4為Fe3O4OSiO2磁性納米粒子透射電子顯微鏡(TEM)表征圖；
圖5為卵巢癌腫瘤標(biāo)志物CA125與磁性納米粒子形成的納米探針。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)地描述。
[0014]一種診斷卵巢癌的磁性納米探針的制備方法，該方法包括如下步驟:
(I)在堿性條件下，采用共沉淀法制備了磁性納米粒子，并利用檸檬酸鈉對(duì)其進(jìn)行修飾，將修飾后的磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑TEOS反應(yīng)，制備得到硅烷化Fe3O4磁性納米粒子，即 Fe3O4OSiO2。
[0015](1.1) Fe3O4磁性納米粒子的合成及表征
采用經(jīng)典的化學(xué)共沉淀法合成超順磁流體，其制備原理簡(jiǎn)單，主要是在沉淀劑NH3.H2O的作用下，ニ價(jià)與三價(jià)鐵離子在堿性條件下生成沉淀，或利用氧化-還原反應(yīng)生成Fe304。
[0016]共沉淀反應(yīng)原理方程式如下:Fe2++2Fe3++80H-— Fe304+4H20
在合成過(guò)程中，條件的選擇至關(guān)重要，物料比、堿用量、溫度、晶化溫度、攪拌速度、反應(yīng)時(shí)間等因素均會(huì)影響最終產(chǎn)物納米級(jí)Fe3O4的生成和性質(zhì)。
[0017]具體制備過(guò)程如下:配置Fe2+ (0.011 M)與Fe3+ (0.020 M)混合母液30ml，在磁力攪拌條件下，逐滴加入沉淀劑氨水Iml (氨水適當(dāng)過(guò)量)，溶液顔色由淺黃色逐漸變成黒色，攪拌I h，接著再在90で條件下反應(yīng)I h，待反應(yīng)完成后利用磁鐵將Fe3O4納米粒子進(jìn)行吸附，并用去離子水進(jìn)行清洗3次；將制得的Fe3O4納米粒子復(fù)溶至60 ml、0.3 M的檸檬酸鈉溶液中，加熱至80で，攪拌反應(yīng)I h后，利用磁鐵對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行吸附，并用丙酮清洗，以除去吸附在納米粒子表面的檸檬酸根離子，再次用磁鐵將產(chǎn)物吸附后，對(duì)產(chǎn)物分別進(jìn)行水洗及こ醇洗各三次；將得到的四氧化三鐵保存在10 ml的無(wú)水こ醇中。
[0018]共沉淀法得到的磁性微粒通常粒徑較小(10 nm-100 nm)的Fe3O4,具有較大比表面積和固載量。在外加磁場(chǎng)作用下，分離得到納米級(jí)別的Fe304。利用檸檬酸鈉對(duì)Fe3O4進(jìn)行修飾，粒徑較小但不均勻，但是制備過(guò)程簡(jiǎn)單易操作。
[0019]圖1與圖2分別為Fe3O4以及硅烷化四氧化三鐵納米顆粒的X射線衍射(XRD)圖譜，可以看到圖2比圖1在20-30的位置有ー個(gè)隆起的峰。但由于Fe3O4與硅烷化四氧化三鐵結(jié)構(gòu)很相似，它們的XRD峰型沒(méi)有很大區(qū)別，因此，在圖3中采用紅外光譜對(duì)它們的結(jié)構(gòu)
進(jìn)ー步鑒定。
[0020](1.2)硅烷化Fe3O4磁性納米粒子的合成及表征
采用經(jīng)典Stober法,在堿性條件下,利用TEOS對(duì)磁性Fe3O4納米粒子表面進(jìn)行包覆,得到核-殼結(jié)構(gòu)的硅烷化Fe3O4磁性納米粒子。具體方法如下:一定量的磁性Fe3O4納米粒子(2 ml Fe3O4的こ醇溶液)加入至50 mlこ醇-水混合溶劑中(こ醇:水=4:1)，加入I ml氨水，超聲20 min使其充分分散。接著200 ulTEOS緩緩加入至反應(yīng)溶液中，在磁力攪拌下反應(yīng)6 h,600 r/min。最后,將制備的娃燒化Fe3O4磁性納米粒子用無(wú)水こ醇清洗3次。利用透射電子顯微鏡(TEM)以及傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀(FTIR)等對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。結(jié)果如圖3所示，在波段在1100附近，有一個(gè)很明顯的的峰，即S1-O-Si的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)引起特征峰。
[0021]硅烷化四氧化三鐵磁性納米微粒的透射電子顯微鏡如圖4所示，結(jié)果表明單個(gè)粒徑大小平均為100 nm左右。由TEM圖可知，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子被ニ氧化硅很好的包覆在里面。
[0022](2)將硅烷化Fe3O4磁性納米粒子與氨基硅烷化試劑APTES反應(yīng)，制備得到氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子，使硅烷化Fe3O4磁性納米粒子表面帶有活性較強(qiáng)的氨基功能基團(tuán)，該功能基團(tuán)可以連接具有生物活性的物質(zhì)，如生物酶、抗體、抗原等，進(jìn)而制備成具有生物活性的納米探針。
[0023]硅烷化Fe3O4磁性納米粒子的氨基化:采用非水體系進(jìn)行硅烷化Fe3O4磁性納米粒子的氨基化反應(yīng)，制備無(wú)水甲苯待用。具體制備方法如下:將制備的氨基硅烷化四氧化三鐵納米粒子用無(wú)水甲苯清洗3次，加入30 ml無(wú)水甲苯、I ml APTES，超聲20 min后，在磁力攪拌器上進(jìn)行反應(yīng)，條件為在105で下回流反應(yīng)8 h。最后，利用外加磁場(chǎng)，將氨基硅烷化的磁性四氧化三鐵納米粒子從甲苯溶液中分離出來(lái)，并用こ醇溶液對(duì)其清洗5次。
[0024](3)氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子經(jīng)戊ニ醛活化后，與CA125單抗交聯(lián)制備磁性納米探針。
[0025]磁性顆粒的醛基化修飾及卵巢癌納米探針的制備: 采用戊ニ醛對(duì)氨基化的磁性納米粒子進(jìn)行活化，利用戊ニ醛在磁性納米微球與生物活性物質(zhì)之間搭橋形成Shiff建，使帶有氨基官能團(tuán)的載體磁珠與生物活性物質(zhì)中的氨基基團(tuán)直接進(jìn)行縮合形成復(fù)合物。把制備的磁性納米粒子與卵巢癌標(biāo)志物CA125抗體相結(jié)合，制備成卵巣癌磁性納米探針。
[0026]在修飾完APTES之后，將2 ml (10 mM)氨基化的磁性納米粒子用PBS (pH=7.4)溶液充分清洗3次，分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %戊ニ醛的磷酸緩沖溶液(PBS)中，并在室溫下充分震蕩并保持在分散狀態(tài)，反應(yīng)3 h，然后磁性納米粒子采用外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離，再用PBS洗3次。將氨基化磁性粒子懸浮在0.5 ml PBS溶液中，加入不同濃度CA125抗體，4°C反應(yīng)42 h，最后采用外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁性分離，最終獲得CA125抗體復(fù)合磁性納米探針(MNPs-HRP-CA125Ab)，合成示意圖如圖5。制備好的卵巢癌磁性納米探針采用ELISA進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0027]一種診斷卵巢癌的檢測(cè)方法，建立一種基于磁性納米探針為標(biāo)記雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)CA125的檢測(cè)方法。
[0028]基于磁性納米探針為標(biāo)記雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)CA125的檢測(cè):在ELISA測(cè)定過(guò)程中，固相載體作為吸附劑和容器，在反應(yīng)過(guò)程中不參與化學(xué)反應(yīng)，不影響抗原與抗體的結(jié)合及檢測(cè)。最常用的是聚苯こ烯，其具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。為了考察所制備的磁性納米粒子能否提高ELISA的檢測(cè)靈敏度，把磁性納米粒子與CA125抗原特異性結(jié)合，制備成卵巣癌磁性納米粒子，在試驗(yàn)中，卵巣癌磁性納米粒子作為固相載體，不需要把抗原或者抗體再洗脫下來(lái)。通過(guò)包被、加樣、溫育、洗滌、顯色和比色，對(duì)比了加入磁性納米粒子與未加入磁性納米粒子時(shí)，所測(cè)得的CA125抗體的濃度。
[0029]空白對(duì)照實(shí)驗(yàn):
空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以傳統(tǒng)的酶標(biāo)板為固相載體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)。包被板制備:取CA125McAb，采用0.05 M PH 9.6包被液稀釋至濃度為5 ug/ml，取110 ul稀釋好的CA125抗體，于37 V孵育2.5 h，然后拍干，取150 ul 1% BSA 0.0lM PH7.4作為封閉液于室溫下孵育
4.5 h，拍干，37で干燥過(guò)夜。
[0030]標(biāo)準(zhǔn)品制備:抗原逐級(jí)稀釋?zhuān)苽涑?點(diǎn)不同濃度的抗原，根據(jù)所測(cè)得的OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0031]酶結(jié)合物的制備:取標(biāo)記HRP的CA125抗體，按優(yōu)化的濃度用酶標(biāo)稀釋液稀釋。
[0032]取包被好的酶標(biāo)板，加入25 ul標(biāo)準(zhǔn)品和75 ul的酶結(jié)合物，37°C溫育I h，用洗液洗板3-5次，拍干加入50 ul底物A和50 ul底物B，37で溫育10 min用終止液終止，酶標(biāo)儀讀數(shù)，擬合計(jì)算。
[0033]以磁性納米顆粒為固相載體的酶聯(lián)免疫檢測(cè):
取醛基化的氨基磁性納米粒子，與不同濃度的CA125抗體偶聯(lián)與封閉，利用戊ニ醛在磁性納米微球與生物活性物質(zhì)之間搭橋形成shiff建，使帶有氨基官能團(tuán)的載體磁珠與生物活性物質(zhì)中的氨基基團(tuán)直接進(jìn)行縮合形成復(fù)合物。
[0034]納米磁性顆粒與CA125 McAb, coating偶聯(lián)與封閉,優(yōu)化磁性納米顆粒與抗體的比例、抗體與酶標(biāo)抗體濃度。首先，以空白酶標(biāo)板為載體，取偶聯(lián)有抗體的納米磁性顆粒用抗體稀釋液按優(yōu)化的濃度稀釋?zhuān)靠准尤?5 ul，然后加入25 ul標(biāo)準(zhǔn)品和75 ul的酶結(jié)合物，37で溫育I h，用洗液洗板3-5次，吸干。加入50 ul底物A和50 ul底物B，37で溫育10 min用終止液終止，酶標(biāo)儀讀數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CA125與磁性納米粒子制備成CA125磁性納米粒子探針后，所制備的磁性納米探針體積小可吸附更多抗原或抗體，其檢測(cè)的靈敏度比空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)較高，可有效的提高ELISA檢測(cè)靈敏度。
[0035]最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗g和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種診斷卵巣癌的磁性納米探針的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)在堿性條件下，采用共沉淀法制備了磁性納米粒子，并利用檸檬酸鈉對(duì)其進(jìn)行修飾，將修飾后的磁性納米粒子與硅烷偶聯(lián)劑TEOS反應(yīng)，制備得到硅烷化Fe3O4磁性納米粒子; (2)將硅烷化Fe3O4磁性納米粒子與氨基硅烷化試劑APTES反應(yīng)，制備得到氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子，使硅烷化Fe3O4磁性納米粒子表面帶有活性較強(qiáng)的氨基功能基團(tuán)； (3)氨基硅烷化修飾的磁性納米粒子經(jīng)戊二醛活化后，與CA125單抗交聯(lián)制備磁性納米探針。
2.—種診斷卵巣癌的檢測(cè)方法，其特征在于，建立一種基于磁性納米探針為標(biāo)記雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法對(duì) CA125的檢測(cè)方法。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK103604920SQ201310627413
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月2日
【發(fā)明者】周琦, 劉蕊, 夏之寧, 袁犁, 李麗仙, 徐發(fā)良, 鄭曉東 申請(qǐng)人:重慶市腫瘤研究所, 重慶大學(xué)