一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远康臋z測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法及應(yīng)用。該方法包括病毒粒子純化、病毒粒子沉淀特征鑒定、病毒粒子形態(tài)測(cè)定、病毒核酸提取、核酸分子量電泳測(cè)定、電鏡計(jì)數(shù)（包括樣品處理、計(jì)數(shù)）。本發(fā)明檢測(cè)準(zhǔn)確度高，檢測(cè)時(shí)間短，具有良好的特異性和穩(wěn)定性，適用于該病毒的定性和定量的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远康臋z測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲(chóng)病毒生物農(nóng)藥檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種檢測(cè)黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜亩ㄐ远繖z測(cè)方法及應(yīng)用，該方法不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型電子顯微鏡儀器，更重要的是能準(zhǔn)確地對(duì)黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性、定量檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]蟑螂學(xué)名蜚蠊，屬于昆蟲(chóng)綱(Insecta)、直翅目(Blattaria)、蜚蠊科(Blattidae)0蟑螂是一種非常古老的昆蟲(chóng)，早在3億年前就已出現(xiàn)，素有活化石之稱(chēng)。同時(shí)蟑螂又是危害人類(lèi)健康的重要衛(wèi)生害蟲(chóng)之一，其危害不亞于蚊蟲(chóng)、蒼蠅及老鼠的一類(lèi)重要衛(wèi)生害蟲(chóng)，已知蟑螂體內(nèi)外能攜帶霍亂弧菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等多種細(xì)菌和鉤蟲(chóng)、蛔蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)等十種寄生蟲(chóng)卵，可在體內(nèi)貯存多天，并不斷排出體外，污染周?chē)h(huán)境。多年來(lái)防治蟑螂的主要方法是使用化學(xué)農(nóng)藥，造成了蟑螂抗藥性增強(qiáng)，且一年多次用藥，造成環(huán)境污染，現(xiàn)在人民生活水平逐步提高，在家庭滅蟑上都希望采用生物農(nóng)藥，而應(yīng)用微生物防治蟑螂已有很多報(bào)道，其中從自然罹病蟑螂體內(nèi)分離到的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緦?duì)蟑螂有非常好的感染性，死亡率高達(dá)99%。
[0003]黑胸大爐濃核病毒(Periplanetafuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)是武漢大學(xué)胡遠(yuǎn)揚(yáng)教授等人在國(guó)內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，是在國(guó)內(nèi)外第I個(gè)正式分類(lèi)鑒定的蟑螂濃核病毒。該病毒與其他細(xì)小病毒一樣，病毒粒子無(wú)包膜，呈球狀二十面體對(duì)稱(chēng)，直徑22nm基因組為單鏈線狀DNA分子(ssDNA)，沉降系數(shù)為102s，浮力密度為1.42g/ml，可以通過(guò)差速離心和密度梯度離心的方法將其分離提純。病毒粒子的SDS-PAGE顯示由5個(gè)蛋白組成，分子量分別為52KD，56KD，79KD，82KD，105KD。PfDNV基因組全長(zhǎng)為5454bp (PfDNV基因組序列已提交Genbank，編號(hào)為:AFI92260)。基因組正鏈有4個(gè)大的閱讀框(0RF)，負(fù)鏈含有3個(gè)大的閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。ICTV第九次會(huì)議正式將其獨(dú)立列為一個(gè)屬=Pefudens0Virus。黑胸大蠊?jié)夂瞬《究梢痼胧秤麥p退，行動(dòng)遲緩，后體翻仰臥不能自正，直至不動(dòng)而死去。死后蟲(chóng)尸外觀體形體色不變，體軟腐，壓之流出乳白色膿液，無(wú)臭味；此病毒最顯著的病癥是嗉囊特別膨脹，呈白色魚(yú)泡狀的氣囊，氣囊一般伸達(dá)第2-4腹節(jié)，有的甚至占住整個(gè)血腔，將中、后腸擠壓至尾端一側(cè)，囊內(nèi)空而無(wú)物，破之氣消癟縮；其次是中腸稍腫脹，黑褐色，破之，流出黑褐色液體；后腸黑色，滯留有未排出的糞便。目前應(yīng)用黑胸大蠊?jié)夂瞬《局瞥傻臍Ⅲa(chǎn)品有拜樂(lè)生物殺蟑餌劑、方便貼、拜樂(lè)生物殺蟑餌盒等產(chǎn)品。而產(chǎn)品的不斷推出，需要有更快更簡(jiǎn)單的方法對(duì)其有效成分黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性定量檢測(cè)，才能保證產(chǎn)品的質(zhì)量。一直以來(lái)，電鏡計(jì)數(shù)都是病毒定量的傳統(tǒng)方法。
[0004] 申請(qǐng)人:建立的黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法，旨在對(duì)黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性和定量檢測(cè)，為生產(chǎn)及市場(chǎng)提供簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是在于提供了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高，不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型電子顯微鏡、電泳儀、離心機(jī)等儀器，更重要的是能準(zhǔn)確、快速地對(duì)黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性定量檢測(cè)，可為生產(chǎn)提供可靠的保證產(chǎn)品質(zhì)量的方法。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測(cè)中的應(yīng)用，此方法定性準(zhǔn)確、穩(wěn)定，定量重復(fù)性好。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0008]1.病毒粒子純化
[0009]病毒的純化通過(guò)沉淀法、差異離心法和密度梯度離心法結(jié)合進(jìn)行。具體為:將樣品懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS),勻衆(zhòng)后以5000r/min離心3min。上清液加入硫酸銨至350g/L，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于4°C冰箱內(nèi)靜置12-14小時(shí)，然后以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮,勻衆(zhòng)后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h，取沉淀。勻漿離心后，上清液經(jīng)40%蔗糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經(jīng)過(guò)10%?40%蔗糖線性梯度，以26000r/min 離心 2.5h。
[0010]經(jīng)10%?40%蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線。
[0011]將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒。
[0012]2.病毒粒子的沉降特征
[0013]以家香濃核病毒伊那株(Bombyxmori Densonucleosis Virus, BmDNV Inaisolate)和家香傳染性軟化病毒(Bombyx mori Infectious flacherie Virus BmIFV)作為對(duì)照，將純化的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緲悠废♂?0倍上樣，鋪在10%?40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr,以形成沉降區(qū)帶。部分收集器收集，每管0.75mL，收集50管，分別測(cè)定260nm光吸收值(OD26tl),并對(duì)應(yīng)收集管號(hào)繪制曲線，收集出現(xiàn)光吸收峰的區(qū)帶病毒。測(cè)定收集到的病毒是否符合黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜某两堤匦浴?br> [0014]本病毒沉降系數(shù)為102S,病毒粒子密度為1.45g/cm3。
[0015]3.蟑螂病毒的形態(tài)測(cè)定
[0016]純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一的近似球狀二十面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒(TMV)作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定其直徑應(yīng)該是22nm。
[0017]4.蟑螂病毒核酸檢測(cè)
[0018]a)蟑螂病毒核酸提取
[0019]純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫下置40 - 60min,期間數(shù)次搖動(dòng)。酚處理后以10000r/min離心5min，取水相，重復(fù)兩次，再用等體積的氯仿:異戊醇(24:I)抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2.5倍體積無(wú)水冷乙醇，_20°C靜置4小時(shí)，以15000r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8.0TE緩沖液中，即為蟑螂病毒核酸。
[0020]b)蟑螂病毒核酸電泳檢測(cè)及其分子量
[0021]采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測(cè)其核酸分子量，瓊脂糖濃度為1.9% (用IXTBE配制)。
[0022]電泳時(shí)以Hind III酶切的λ DNA作標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察照相，計(jì)算病毒核酸的大小。
[0023]5.樣品的處理
[0024]制備檢測(cè)病毒懸液，取ImL (精確至0.01mL)試樣，溶解于IOmL蒸餾水中，然后10倍梯度稀釋樣SS1 (1/10) — S2(1/10)，再用I μ L磷鎢酸與I μ L樣品重復(fù)混勻后滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后直接電鏡檢測(cè)計(jì)數(shù)。以電鏡視野中的病毒顆粒不重疊為宜，每網(wǎng)孔中的病毒數(shù)不少于4個(gè)。
[0025]6.計(jì)算有效網(wǎng)孔中病毒的總和P = Ρ!+Ρ2+Ρ3+......+Ρη，重復(fù)3次取平均值。蟑螂
濃核病毒含量X用式(I)進(jìn)行計(jì)算:
[0026]X = PX IOX IOsX 1000
[0027]式中:Ρ—電鏡下統(tǒng)計(jì)的總數(shù)；
[0028]S—梯度稀釋的次數(shù)。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0030]該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高，不僅可使用目前存在市場(chǎng)上的所有類(lèi)型電子顯微鏡、電泳儀、離心機(jī)等儀器，更重要的是能準(zhǔn)確、快速地對(duì)黑胸大蠊?jié)夂瞬《具M(jìn)行定性定量檢測(cè)，可為生產(chǎn)提供可靠的保證產(chǎn)品質(zhì)量的方法。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為黑胸大蠊?jié)夂瞬《倦婄R示意圖。
【具體實(shí)施方式】`
[0032]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步描述。
[0033]實(shí)施例1:
[0034]一種檢測(cè)黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法，其步驟如下:
[0035]1.病毒粒子純化
[0036]將黑胸大蠊?jié)夂瞬《緲悠?武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司提供)懸浮于磷酸緩沖溶液(PBS)，勻漿后以5000r/min離心3min。上清液加入硫酸銨350g/L (指得是加入硫酸銨后的終濃度)，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于冰箱(4°C)內(nèi)靜置12-14小時(shí)后，以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮,勻衆(zhòng)后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h,取沉淀。勻衆(zhòng)離心后,上清液經(jīng)40%鹿糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經(jīng)過(guò)10%~40%蔗糖線性梯度，以 26000r/min 離心 2.5h。
[0037]經(jīng)10 %~40 %蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線，在26-30管處出現(xiàn)光吸收峰。
[0038]將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒。
[0039]2.病毒粒子的沉降特征
[0040]以家香濃核病毒伊那株(Bombyxmori Densonucleosis Virus, BmDNV Inaisolate)(約6kb,沉降系數(shù)是100)和家蠶傳染性軟化病病毒(Bombyx mori Infectiousflacherie Virus BmIFV)(核酸9650bp，沉降系數(shù)是183)作為對(duì)照，將步驟I中得到的提純病毒稀釋十倍，進(jìn)行上樣，鋪在10%~40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr，以形成沉降區(qū)帶。部分收集器收集，每管0. 75mL，收集50管，分別測(cè)定260nm光吸收值（0D26Q)， 并對(duì)應(yīng)收集管號(hào)繪制曲線，在本實(shí)施例中，在26?33管處出現(xiàn)光吸收峰。本病毒沉降系數(shù) 為102S，病毒粒子密度為1. 45g/cm3。
[0041]3.蟑螂病毒的形態(tài)測(cè)定
[0042]純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一 的近似球狀十二面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒（TMV)作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定其直徑 應(yīng)該是22nm。
[0043]4.蟑螂病毒核酸檢測(cè)
[0044]a)蟑螂病毒核酸提取
[0045]純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫（23±2°C )下置40 — 60min, 期間搖動(dòng)10-15次。酚處理后以10000r/min離心5min，取水相，重復(fù)兩次，再用等體積的 氯仿：異戊醇（24 ：1)抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2. 5倍體積無(wú)水冷乙 醇，-20°C靜置4小時(shí)，以15000r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8. 0TE緩沖液
中，即為蟑螂病毒核酸。
[0046]b)蟑螂病毒核酸電泳檢測(cè)及其分子量
[0047]采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測(cè)其核酸分子量，瓊脂糖濃度為1. 9% (用1XTBE 配制)。
[0048]電泳時(shí)以Hind III酶切的入DNA作標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下 觀察照相，計(jì)算病毒核酸的大小。該病毒的核酸大小5454bp。
[0049]5.樣品的處理
[0050]制備檢測(cè)病毒懸液，取lmL (精確至0. OlmL)試樣,溶解于10mL蒸懼水中，然后10 倍梯度稀釋樣品Si (1/10) —S2 (1/10)，再用luL磷鎢酸與lyL樣品重復(fù)混勻后滴在銅網(wǎng) 上，自然干燥后直接電鏡檢測(cè)計(jì)數(shù)。以電鏡視野中的病毒顆粒不重疊為宜，每網(wǎng)孔中的病毒 數(shù)不少于4個(gè)。
[0051]6.計(jì)算有效網(wǎng)孔中病毒的總和P = P!+P2+P3+......+Pn，重復(fù)3次取平均值。蟑螂
濃核病毒含量x用式（1)進(jìn)行計(jì)算：
[0052]x = PX10X10SX1000
[0053]式中：P—電鏡下統(tǒng)計(jì)的總數(shù)；
[0054]S—梯度稀釋的次數(shù)。
[0055]經(jīng)過(guò)上述步驟測(cè)定后，黑胸大蠊?jié)夂瞬《驹幒繛?. 05X 108個(gè)/ml，
[0056]實(shí)施例2 ：
[0057]—種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远繖z測(cè)方法在蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測(cè)中的應(yīng)用，其 應(yīng)用過(guò)程如下：
[0058]生物殺蟑餌劑的來(lái)源(武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司提供)，≥6000個(gè)/g。
[0059]步驟同實(shí)施例1
[0060]生物殺蟑餌劑內(nèi)含量為7. lX104f/g。
[0061]以上僅為本發(fā)明所列舉的較佳實(shí)施例，并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，所屬技 術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員運(yùn)用本發(fā)明所作的等效修飾或變化，均同理應(yīng)屬于本發(fā)明的專(zhuān)利 保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種黑胸大蠊?jié)夂瞬《径ㄐ远康臋z測(cè)方法，其步驟如下: 1)病毒粒子純化 將樣品懸浮于磷酸緩沖溶液，勻衆(zhòng)后以5000r/min離心3min ;上清液加入硫酸銨至350g/L，硫酸銨水溶液飽和度為55%，放置于4°C冰箱內(nèi)靜置12-14小時(shí)，然后以8000r/min離心50min,沉淀加入PBS重懸浮，勻衆(zhòng)后，以15000r/min離心20min,上清液以40000r/min離心2h，取沉淀；勻漿離心后，上清液經(jīng)40%蔗糖單梯度，以40000r/min離心5h，沉淀懸于PBS中，勻漿，以12000r/min離心20min，得上清，再經(jīng)過(guò)10%~40%蔗糖線性梯度，以26000r/min 離心 2.5h ； 經(jīng)10%~40%蔗糖梯度離心后，用部分收集器收集，每管25滴共收集50管，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每管在260nm處的吸收值，繪制吸收曲線； 將峰值管的收集液洗糖，以40000r/min離心2h，PBS懸浮，即為提純病毒； 2)病毒粒子的沉降特征 以家蠶濃核病毒伊那株和家蠶傳染性軟化病毒作為對(duì)照，將純化的黑胸大蠊?jié)夂瞬《緲悠废♂?0倍上樣，鋪在10%~40%蔗糖線性梯度上層，121700g離心3.5hr，以形成沉降區(qū)帶；部分收集器收集，每管0.75mL,收集50管，分別測(cè)定260nm光吸收值，并對(duì)應(yīng)收集管號(hào)繪制曲線，收集出現(xiàn)光吸收峰的區(qū)帶病毒，測(cè)定病毒的沉降特性； 黑胸大蠊?jié)夂瞬《境两迪禂?shù)為102S，病毒粒子密度為1.45g/cm3 ； 3)蟑螂病毒的形態(tài)測(cè)定 純化的蟑螂病毒粒子用2%磷鎢酸染色，透射電子顯微鏡下檢查，病毒為大小均一的近似球狀二十面體的粒子，加入直徑15nm的煙草花葉病毒作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定其直徑； 4)蟑螂病毒核酸檢測(cè) a)蟑螂病毒核酸提取 純化的蟑螂病毒懸液與等體積TE飽和酚混勻，室溫下置40 - 60min,期間數(shù)次搖動(dòng)；酹處理后以10000r/min離心5min,取水相,重復(fù)兩次,再用等體積的氯仿:異戍醇=24:1抽提，取水相，加1/10體積的3mol/L乙酸鈉，2.5倍體積無(wú)水冷乙醇，_20°C靜置4小時(shí)，以15000 r/min離心lOmin，沉淀真空干燥后，懸浮在pH8.0TE緩沖液中，即為蟑螂病毒核酸； b)蟑螂病毒核酸電泳檢測(cè)及其分子量 采用核酸的瓊脂糖電泳方法檢測(cè)其核酸分子量，用IXTBE配制的瓊脂糖濃度為1.9% ； 電泳時(shí)以Hind III酶切的λ DNA作標(biāo)準(zhǔn)，電泳結(jié)束后用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察照相，計(jì)算病毒核酸的大小； 5)樣品的處理 制備檢測(cè)病毒懸液，取ImL,精確至0.01 mL試樣，溶解于IOmL蒸懼水中，然后10倍梯度稀釋樣品S1 (1/10) — S2 (1/10)，再用I μ L磷鎢酸與I μ L樣品重復(fù)混勻后滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后直接電鏡檢測(cè)計(jì)數(shù)，要求電鏡視野中的病毒顆粒不重疊，每網(wǎng)孔中的病毒數(shù)不少于4個(gè)； 6)計(jì)算有效網(wǎng)孔中病毒的總和P= Ρ!+Ρ2+Ρ3+......+Ρη，重復(fù)3次取平均值，蟑螂濃核病毒含量X用式(I)進(jìn)行計(jì)算:
X = PX 10Χ IOsX 1000式中:P—電鏡下統(tǒng)計(jì)的總數(shù)；S—梯度稀釋的次數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的方法在·蟑螂病毒殺蟑餌劑檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N15/04GK103592209SQ201310627439
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】陳嬌, 尹宜農(nóng) 申請(qǐng)人:武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司