乙型肝炎表面抗原測定試劑盒以及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，包括試劑M、試劑R1、試劑R2以及校準品，試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，親和素包被磁微粒經診斷試劑防腐劑處理；試劑R1中的組分包括生物素化Anti-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；試劑R2中的組分包括吖啶酯標記的Anti-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；對照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，制備簡單，使用方便，易于儲存，可用于定量測定人體血清（血漿）中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的濃度，HBsAg檢測可用于輔助診斷HBV感染和預防HBV通過血制品傳播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測。
【專利說明】乙型肝炎表面抗原測定試劑盒以及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及乙型肝炎診斷試劑盒，具有設計基于雙抗原化學發(fā)光原理的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一種傳染性疾病。HBV可以通過血液和體液直接傳播，常見的傳播方式包括輸血、注射、傷口接觸、母嬰傳播等；常見的臨床癥狀有不適、發(fā)熱、黃疸、無癥狀肝炎、暴發(fā)性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易發(fā)展成為肝癌，因此，檢測乙型肝炎的工作至關重要。
[0003]目前，常用的檢測方法是免疫學檢測，免疫學檢測時基于抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，其可以利用同位素、酶、化學發(fā)光物質等對被檢測信號進行放大和顯示，因此常被用于檢測蛋白質，激素等微量生物活性物質。免疫學檢測經理了放射免疫檢測、酶聯免疫檢測以及光生物學標記免疫檢測技術三個階段，使免疫學檢測向著敏感性、準確性以及操作簡捷性的方向發(fā)展。
[0004]化學發(fā)光免疫分析是近十年來在世界范圍內發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術。檢測原理是以發(fā)光物質作為信號放大系統(tǒng)并借助其發(fā)光強度直接測定免疫結合。該方法靈敏度高、檢測范圍寬，是免疫學檢測重要的發(fā)展方向。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明解決了現有技術中的不足，提供一種靈敏度高、誤差小、安全快速檢測的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒及檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案為:一種乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，包括試劑M、試劑R1、試劑R2以及校準品，所述試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒經診斷試劑防腐劑處理；所述試劑Rl中的組分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述試劑R2中的組分包括吖啶酯標記的Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述對照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
[0007]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，所述親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內核表面包裹活性基團的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0008]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，試劑Rl和試劑R2中所述磷酸緩沖液的濃度均為0.01M，pH值為7.4。
[0009]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300 防腐劑。
[0010]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括,所述試劑Rl的量為6ml,所述試劑R2的量為12ml,所述試劑M的量為3ml。
[0011]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，所述校準品包括校準品I和校準品2兩組，所述校準品I的量為0.5ml，HBsAg濃度為0.1 IU/ml，所述校準品2的量為0.5ml, HBsAg濃度為30IU/ml。
[0012]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，一種使用該乙型肝炎表面抗原測定試劑盒的檢測方法，包括以下幾步:
[0013](I)在將待測樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進行反應，形成含有抗原-抗體復合體的反應液I ;
[0014](2)在反應液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應液I中的復合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應液2 ；
[0015](3)反應液2置于一個磁場內，檢測其中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去，得到反應液3 ；
[0016](4)在反應液3中加入含有吖啶酯標記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復合物反應，得到反應液4 ；
[0017](5)將反應液4置于化學發(fā)光測定儀上進行檢測，在磁場中磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去；然后，注入化學發(fā)光激發(fā)液I及化學發(fā)光激發(fā)液2，檢測其化學發(fā)光光子強度；產生的光強度與樣本內乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
[0018]本發(fā)明的一個較佳實施例中，進一步包括，所述化學發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0019]本發(fā)明的解決了現有技術的缺陷，具有以下有益效果:
[0020]1.本發(fā)明涉及的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，制備簡單，使用方便，易于儲存，可用于定量測定人體血清(血漿)中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的濃度，HBsAg檢測可用于輔助診斷HBV感染和預防HBV通過血制品傳播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測。使用該試劑盒來的檢測方法是基于雙抗原化學發(fā)光原理，該方法靈敏度高、誤差小、安全快速。
【具體實施方式】
[0021 ] 為了使本【技術領域】的人員更好地理解本發(fā)明，并使本發(fā)明的上述優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0022]本發(fā)明一種乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，組要組成成分如下:
[0023]試劑Rl:每瓶6ml，內含有生物素化Ant1-HBs，0.0lMpH值7.4磷酸鹽緩沖液，
0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；
[0024]試劑R2:每瓶12ml，內含有吖啶酯標記的Anti_HBs，0.0lMpH值7.4磷酸鹽緩沖液,0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；其中，吖唳酯標記的Ant1-HBs以吖唳酯通過偶聯劑偶聯Ant1-HBs，偶聯劑可以選擇二甲基亞胺或戊二醛或者其他業(yè)內常用的偶聯劑；
[0025]試劑M:每瓶3.0ml,內含親和素包被的磁微粒,經0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑防腐處理；其中，親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內核表面包裹活性基團的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
[0026]校準品(Cal):本發(fā)明實施例中的校準品分為I和2兩組，均內含人源性的乙肝表面抗原(HBsAg),新生牛血清,0.l%Proclin300診斷試劑防腐劑；校準品濃度如下:Call的近似濃度為0.10IU/ml, Cal2的近似濃度為30.00IU/ml。
[0027]本發(fā)明的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒用于測定人血清(血漿)中乙型肝炎表面抗原的濃度，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒顆粒的外殼成分，是乙肝病毒HBV感染的首選免疫學標志物。HBsAg檢測可用于輔助診斷HBV感染和預防HBV通過血制品傳播，也可用于急、慢性乙肝患者的病程監(jiān)測。
[0028]本發(fā)明使用該試劑盒的檢測原理是采用雙抗原化學發(fā)光原理，步驟如下:
[0029]第一步反應:將樣本和生物素化乙肝病毒表面抗體(Ant1-HBs)(試劑Rl)進行反應，如果標本中含有HBsAg，將形成抗原-抗體復合體。
[0030]第二步反應:加入親和素包被的微粒(試劑M)，復合體在生物素和親和素相互作用下形成固相。
[0031]第三步反應:將反應液置于一個磁場內，檢測中的磁微粒將被吸附，通過洗滌，將未結合物沖洗除去。
[0032]第四步反應:加入卩丫唳酯標記的Ant1-HBs (試劑R2),與磁顆粒上的HBsAg復合物反應。
[0033]將反應液置于一個磁場內，檢測中的磁微粒將被吸附，通過洗滌，將未結合物沖洗除去；然后，注入化學發(fā)光激發(fā)液I及化學發(fā)光激發(fā)液2，檢測其化學發(fā)光光子強度；產生的光強度與樣本內HBsAg濃度成正比。樣本內分析物的量由所儲存的多點校準曲線來確定。
[0034]實施例1
[0035]本發(fā)明具體實施例中的具體實驗步驟如下:
[0036]首先，要獲得待測樣品，即血清，按照常規(guī)應用技術采集全血標本，放置半小時以上使凝集，在3000rpm的轉速下離心10分鐘以上，使血清分離完全，血清中不含細胞成分；血漿用肝素鈉、EDTA-K3、枸櫞酸鈉或氟化鈉/草酸鉀抗凝。
[0037]然后，對該待測樣品使用乙型肝炎表面抗原測定試劑盒進行檢測:
[0038](I)在將待測樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進行反應，形成含有抗原-抗體復合體的反應液I ;
[0039](2)在反應液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M,反應液I中的復合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應液2 ；
[0040](3)反應液2置于一個磁場內，檢測其中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去，得到反應液3 ；
[0041](4)在反應液3中加入含有吖啶酯標記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復合物反應，得到反應液4 ；
[0042](5)將反應液4置于化學發(fā)光測定儀上進行檢測，在磁場中磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去；然后，注入化學發(fā)光激發(fā)液I及化學發(fā)光激發(fā)液2，檢測其化學發(fā)光光子強度；產生的光強度與樣本內乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
[0043]其中，所述化學發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
[0044]在本發(fā)明的實施例中如果待測樣品是在24小時之內使用，可于2_8°C下保存，如果需要超過24小時的長期存放應該保存在_20°C以下，并且避免樣品反復凍融。
[0045]本發(fā)明實施例中的化學發(fā)光測定儀是EVERESYSA1800 I類，在檢測時，將試劑裝載到化學發(fā)光測定儀試劑倉上，并在軟件操作系統(tǒng)上確定裝載就試劑的名稱；試劑在裝載前，應輕輕混勻，但禁止上下顛倒已打開的試劑；將檢測樣本裝載在樣本倉中，并在軟件操作系統(tǒng)上確定樣本檢測項目；將反應杯裝載滿，也可以根據實驗情況裝載相應數量反應杯；每次檢測樣本量需要50ul，考慮檢測系統(tǒng)死體積因素，應確保樣本量在200ul以上，同時應考慮樣本容器的死腔因素。
[0046]結果計算
[0047]測定儀自動計算得出每份標本的測定濃度(單位為IU/mL)。標本的HBsAg含量< 0.lIU/mL判斷為HBsAg無反應性；標本的HBsAg含量≤0.lIU/mL判斷為HBsAg反應性。
[0048]最低檢測限
[0049]使用上述方法檢測，測得試劑的靈敏度< 0.03IU/mL ;檢測3種亞型國家系列靈敏度參考品，符合標準；檢測3份國家陽性參考品，符合標準。
[0050]檢測范圍
[0051]本檢測方法的檢測范圍為0.1~150IU/mL。
[0052]精密度
[0053]精密度依照美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS) EP5-A方案制定，對5份HBsAg質控品(其中三份血清，二份為校準品)，采用同一批次試劑，每天不同時間各檢測一次，每次雙孔，共進行20天，實驗結果如下表1所示。
[0054]表1實驗結果
【權利要求】
1.一種乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，包括試劑Μ、試劑R1、試劑R2以及校準品，所述試劑M中組分包括親和素包被磁微粒，所述親和素包被磁微粒經診斷試劑防腐劑處理；所述試劑Rl中的組分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐劑；所述試劑R2中的組分包括吖啶酯標記的Ant1-HBs、磷酸鹽緩沖液以及診斷試劑防腐齊IJ;所述對照組包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及診斷試劑防腐劑。
2.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，所述親和素包被磁微粒的親和素為鏈霉親和素、中性親和素或類親和素，所述親和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三鐵為內核表面包裹活性基團的聚合物，所述磁微粒的直徑為1.5um。
3.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，試劑Rl和試劑R2中所述磷酸緩沖液的濃度均為0.0lM, pH值為7.4。
4.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑防腐劑為0.1%的Proclin300防腐劑。
5.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，所述試劑Rl的量為6ml,所述試劑R2的量為12ml,所述試劑M的量為3ml。
6.根據權利要求1所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒，其特征在于，所述校準品包括校準品I和校準品2兩組，所述校準品I的量為0.5ml，HBsAg濃度為0.1 IU/ml，所述校準品2的量為0.5ml, HBsAg濃度為30 IU/ml。
7.一種使用權利要求1-6所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下幾步: (1)在將待測樣品和含有生物素化Ant1-HBs的試劑Rl進行反應，形成含有抗原-抗體復合體的反應液I ; (2)在反應液I中加入含有親和素包被磁微粒的試劑M，反應液I中的復合體在生物素和親和素的相互作用下形成固相，得到了反應液2 ； (3)反應液2置于一個磁場內，檢測其中的磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去，得到反應液3; (4)在反應液3中加入含有吖啶酯標記的Ant1-HBs的試劑R2，吖啶酯標記的Ant1-HBs與磁微粒上的HBsAg復合物反應，得到反應液4 ； (5)將反應液4置于化學發(fā)光測定儀上進行檢測，在磁場中磁微粒將被吸附，通過洗滌液洗滌，將未結合物沖洗除去；然后，注入化學發(fā)光激發(fā)液I及化學發(fā)光激發(fā)液2，檢測其化學發(fā)光光子強度；產生的光強度與樣本內乙型肝炎表面抗原濃度成正比。
8.根據權利要求7所述的乙型肝炎表面抗原測定試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述化學發(fā)光激發(fā)液I中含有過氧化氫，所述化學發(fā)光激發(fā)液2中含有氫氧化鈉，所述洗滌液含有磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號】G01N21/76GK103630531SQ201310652173
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權日:2013年12月6日
【發(fā)明者】陳秀發(fā), 胡慶鋒, 常立峻, 徐海偉, 李勇 申請人:蘇州長光華醫(yī)生物醫(yī)學工程有限公司