一種檢測人血清中免疫球蛋白n糖鏈結(jié)構(gòu)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，包括以下步驟：人血清中免疫球蛋白的純化，免疫球蛋白上N糖鏈的釋放，釋放后的N糖鏈的純化，以及通過質(zhì)譜技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析。本發(fā)明對糖鏈進行了純化分離，具有更高的準確性，能夠真實的再現(xiàn)疾病導(dǎo)致的細小變化，使N糖鏈的檢測可以成為疾病診斷的實用工具。經(jīng)過可行性驗證，本發(fā)明的每個步驟都是可行的，準確的，對于N糖鏈的分析至關(guān)重要。
【專利說明】一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種糖鏈分析方法，具體涉及一種分析人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白糖基化修飾是特異糖鏈在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中添加到蛋白質(zhì)上形成寡糖鏈的過程，具有酶定向和位點特異性。根據(jù)與糖鏈連接方式不同，蛋白質(zhì)主要有N-連接和O-連接兩種糖基化形式:前者是糖鏈與蛋白Asn-XXX-Ser/Thr序列子(XXX為除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn殘基上的-NH2相連；后者則是糖鏈與蛋白Ser/Thr殘基上的-OH相連。N-連接和O-連接糖蛋白主要定位于細胞膜表面，也可以分泌型蛋白的形式存在。
[0003]免疫球蛋白是可溶性血清糖蛋白，可為高等脊椎動物提供針對已暴露抗原的長期保護。人類免疫球蛋白根據(jù)重鏈性質(zhì)的不同分為IgG、IgM、IgA、IgE、IgD5種。連接在免疫球蛋白上的寡糖分子量很大(每個約2kD)，在不受其所在區(qū)域的限制時柔韌性很大。免疫球蛋白中的聚糖具有多種功能:(I)在維持抗體結(jié)構(gòu)和與血清外源凝集素結(jié)合反應(yīng)中扮演重要角色；(2)維持免疫球蛋白的溶解度、熱穩(wěn)定性和分子構(gòu)象；(3)促進亞細胞間的運輸、分泌和清除；(4)通過Fe和Fe受體間的有效結(jié)合保證免疫球蛋白的功能。
[0004]多年來，人們已對多種蛋白的糖基化修飾進行了廣泛深入的研究，并清楚地認識到蛋白糖基化修飾在很多疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。糖鏈結(jié)構(gòu)信息包括糖鏈的單糖組成、異頭碳構(gòu)型、糖苷鍵的連接位置和糖殘基的序列分析等內(nèi)容。糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)分析包括糖蛋白的提取分離、糖鏈釋放和糖鏈結(jié)構(gòu)鑒定等多個步驟，糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)分析因糖鏈復(fù)雜的不均一性和含量甚微備受挑戰(zhàn)。質(zhì)譜可以對各種糖鏈進行結(jié)構(gòu)分析，是解決糖鏈結(jié)構(gòu)的有效手段。本方法通過MSn技術(shù)可從樣品中選擇母離子進行逐級轟擊分析，不受其他物質(zhì)干擾，所獲得的糖鏈結(jié)構(gòu)信息更加詳盡，功能強大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，提高檢測的特異性、靈敏度和準確率。
[0006]為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈的方法，包括:人血清中免疫球蛋白的純化，免疫球蛋白上N糖鏈的釋放，釋放后的N糖鏈的純化，純化后N糖鏈的標記，以及通過質(zhì)譜MSn技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析。
[0008]所述的人血清中免疫球蛋白的純化步驟具體為:
[0009](I)飽和硫酸銨溶液配制:稱取硫酸銨800g，加入IL蒸餾水，加熱不停攪拌，待完全溶解，冷卻到室溫，加氨水調(diào)節(jié)PH到7.2-7.4，保存于25°C以上的溫度中備用；
[0010](2)將人血清1500r/min離心IOmin,取上清液ImL,然后加入2mLPBS進行稀釋,然后逐滴加入3mL飽和硫酸銨溶液，直至溶液變成白色渾濁液，4°C靜置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速離心機上以5000r/min的速度離心，收集白色沉淀，即為免疫球蛋白粗蛋白，力口入ImLPBS溶液溶解；
[0011](3)準備一根長20cm的SPE柱，底部用尼龍膜封底，用前先用超純水洗凈，然后用PBS潤洗，加入已經(jīng)用水浸泡過夜的S印hadexG25懸濁液，直至高度達到10-15cm，用5倍柱體積量的PBS潤洗柱子，確保柱內(nèi)的雜質(zhì)被沖洗干凈，將溶解的粗蛋白上樣，待液面完全浸入柱內(nèi)之后加入PBS洗脫，并用1.5mL規(guī)格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL,得到總免疫球蛋白，整個流程在4°C的冷庫中進行。
[0012]所述的免疫球蛋白上N糖鏈的釋放步驟具體為:
[0013]量取500微克IgG抗體于離心管中，加入10x5微升變性劑，45微升HPLCwaterJg勻，在金屬浴上加熱100°c IOmin,冷卻至室溫加入5微升10xG7緩沖液，5微升10%NP_40緩沖液，加入I微升PNGaseF酶在37°C下過夜。
[0014]所述的釋放后的N糖鏈的純化步驟具體為:
[0015](I)準備Spe_pakC18預(yù)裝柱:用2ml乙腈潤洗柱子,加入9ml平衡液(添加體積比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液)平衡C18柱子，徹底干燥酶處理以后的樣品，然后以Iml平衡液溶解樣品，并注入到柱子中去，額外加3ml上述平衡液對樣品洗脫，然后收集得到4ml ；
[0016](2)真空干燥上述樣品，在冰浴下加入300微升新鮮配制的NaBH4溶液，然后室溫下靜置過夜，冰浴下加入5滴乙酸終止反應(yīng)，然后升溫至室溫，并加入3ml乙醇，將該樣品真空濃縮干燥；
[0017](3)去除硼酸鹽:加入3ml乙酸:甲醇=1:100溶液，真空濃縮干燥后再加入3ml甲苯，將此過程重復(fù)3次；準備多孔石墨化碳預(yù)裝柱:洗柱子，依次加入下列試劑3ml:a)IMNaOH ;b)HPLC水；c)含有體積比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d)含有體積比0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e) 25%乙腈溶液；f)水，用6-8ml水平衡柱子。切割下來的糖鏈用Iml水溶解后上樣，然后加入8-lOml水洗脫柱子，去除雜質(zhì)和鹽分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脫下中性的糖鏈(如果洗脫的糖是酸性的，需要加3ml體積比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液)。真空干燥樣品，加入甲醇溶解樣品準備質(zhì)譜分析。
[0018]所述的通過質(zhì)譜技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析步驟具體為:
[0019]純化好的N糖鏈加入300 μ L甲醇溶解，注入到質(zhì)譜儀并在正離子條件下檢測；質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)定如下:
[0020]流速:0.50 μ L/min,溫度:230 °C，氦氣流速:2arb，電壓:3.50kV,注入時間:100.00ms，分辨率:m/zl.5，注入體積:2μ L。
[0021]本發(fā)明的有益效果:
[0022]1.質(zhì)譜相對于其他的儀器，具有更好的靈敏度，能全面的分析抗體N糖基化的變化，對于及時檢測病人病變微小的差異，實現(xiàn)對疾病的早期診斷具有重要意義。
[0023]2.對糖鏈進行了純化分離，具有更高的準確性，能夠真實的再現(xiàn)疾病導(dǎo)致的細小變化，使N糖鏈的檢測可以成為疾病診斷的實用工具。
[0024]3.經(jīng)過可行性驗證，本發(fā)明的每個步驟都是可行的，準確的，對于N糖鏈的分析至
關(guān)重要。
【專利附圖】

【附圖說明】[0025]圖1為一級質(zhì)譜下N糖鏈(A)m/z800-1500范圍內(nèi)的N糖鏈(B)m/zl500-2000范圍內(nèi)的N糖鏈。
[0026]具體實施方法
[0027]一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈的方法，包括:人血清中免疫球蛋白的純化，免疫球蛋白上N糖鏈的釋放，釋放后的N糖鏈的純化，純化后N糖鏈的標記，以及通過質(zhì)譜MSn技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析。
[0028]所述的人血清中免疫球蛋白的純化步驟具體為:
[0029](I)飽和硫酸銨溶液配制:稱取硫酸鈉(Na2SO4) 208g,及亞硫酸鈉(Na2SO3) 70g,加入蒸餾水約900ml，并加入濃硫酸2ml，使蒸餾水酸化，不停攪拌，待完全溶解后將溶液移入IL容量瓶內(nèi)，用蒸餾水稀釋至IL刻度，保存于25°C以上的溫度中備用；
[0030](2)將人血清1500r/min離心IOmin,取上清液ImL,然后加入2mLPBS進行稀釋,然后逐滴加入3mL飽和硫酸銨溶液，直至溶液變成白色渾濁液，4°C靜置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速離心機上以5000r/min的速度離心，收集白色沉淀，即為免疫球蛋白粗蛋白，力口入ImLPBS溶液溶解；
[0031](3)準備一根長20cm的SPE柱，底部用尼龍膜封底，用前先用超純水洗凈，然后用PBS潤洗，加入已經(jīng)用水浸泡過夜的S印hadexG25懸濁液，直至高度達到10-15cm，用5倍柱體積量的PBS潤洗柱子，確保柱內(nèi)的雜質(zhì)被沖洗干凈，將溶解的粗蛋白上樣，待液面完全浸入柱內(nèi)之后加入PBS洗脫，并用1.5mL規(guī)格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL,得到總免疫球蛋白，整個流程在4°C的冷庫中進行。
[0032]所述的免疫球蛋白上N糖鏈的釋放步驟具體為:
[0033]量取500微克IgG抗體于離心管中，加入10x5微升變性劑，45微升HPLCwater，混勻，在金屬浴上加熱100°c IOmin,冷卻至室溫加入5微升10xG7緩沖液，5微升10%NP_40緩沖液，加入I微升PNGaseF酶在37°C下過夜。
[0034]所述的釋放后的N糖鏈的純化步驟具體為:
[0035](I)準備Spe_pakC18預(yù)裝柱:用2ml乙腈潤洗柱子，加入9ml平衡液(添加體積比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液)平衡C18柱子，徹底干燥酶處理以后的樣品，然后以Iml平衡液溶解樣品，并注入到柱子中去，額外加3ml上述平衡液對樣品洗脫，然后收集得到4ml ；
[0036](2)真空干燥上述樣品，在冰浴下加入300微升新鮮配制的NaBH4溶液，然后室溫下靜置過夜，冰浴下加入5滴乙酸終止反應(yīng)，然后升溫至室溫，并加入3ml乙醇，將該樣品真空濃縮干燥；
[0037](3)去除硼酸鹽:加入3ml乙酸:甲醇=1:100溶液，真空濃縮干燥后再加入3ml甲苯，將此過程重復(fù)3次；準備多孔石墨化碳預(yù)裝柱:洗柱子，依次加入下列試劑3ml:a)IMNaOH ；b) HPLC水；c)含有體積比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d)含有體積比
0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e) 25%乙腈溶液；f)水，用6-8ml水平衡柱子。切割下來的糖鏈用Iml水溶解后上樣，然后加入8-lOml水洗脫柱子，去除雜質(zhì)和鹽分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脫下中性的糖鏈(如果洗脫的糖是酸性的，需要加3ml體積比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液)。真空干燥樣品，加入甲醇溶解樣品準備質(zhì)譜分析。
[0038]所述的通過質(zhì)譜技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析步驟具體為:
[0039]純化好的N糖鏈加入300 μ L甲醇溶解，注入到質(zhì)譜儀并在正離子條件下檢測；質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)定如下:
[0040]流速:0.50 μ L/min,溫度:230 °C，氦氣流速:2arb，電壓:3.50kV,注入時間:100.00ms，分辨率:m/zl.5，注入體積:2μ L。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，包括以下步驟:人血清中免疫球蛋白的純化，免疫球蛋白上N糖鏈的釋放，釋放后的N糖鏈的純化，以及通過質(zhì)譜技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的人血清中免疫球蛋白的純化步驟具體為: (1)飽和硫酸銨溶液配制:稱取硫酸銨800g，加入IL蒸餾水，加熱不停攪拌，待完全溶解，冷卻到室溫，加氨水調(diào)節(jié)PH到7.2-7.4，保存于25°C以上的溫度中備用； (2)將人血清1500r/min離心lOmin，取上清液lmL，然后加入2mLPBS進行稀釋，然后逐滴加入3mL飽和硫酸銨溶液，直至溶液變成白色渾濁液，4°C靜置3h，使蛋白充分沉淀，然后在超速離心機上以5000r/min的速度離心，收集白色沉淀，即為免疫球蛋白粗蛋白，加入ImLPBS溶液溶解； (3)準備一根長20cm的SPE柱，底部用尼龍膜封底，用前先用超純水洗凈，然后用PBS潤洗，加入已經(jīng)用水浸泡過夜的S印hadexG25懸濁液，直至高度達到10-15cm，用5倍柱體積量的PBS潤洗柱子，確保柱內(nèi)的雜質(zhì)被沖洗干凈，將溶解的粗蛋白上樣，待液面完全浸入柱內(nèi)之后加入PBS洗脫，并用1.5mL規(guī)格的EP管收集蛋白，每管收集0.8mL，得到總免疫球蛋白，整個流程在4°C的冷庫中進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的免疫球蛋白上N糖鏈的釋放步驟具體為: 量取500微克IgG抗體于離心管中，加入10x5微升變性劑，45微升HPLC水，混勻，在金屬浴上加熱100°C IOmin,冷卻至室溫加 入5微升10xG7緩沖液，5微升10%NP_40緩沖液，加入I微升PNGaseF酶在37 °C下過夜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的釋放后的N糖鏈的純化步驟具體為: (1)準備Spe-pakC18預(yù)裝柱:用2ml乙腈潤洗柱子,加入9ml平衡液(添加體積比0.1%三氟乙酸的2%乙腈水溶液)平衡C18柱子，徹底干燥酶處理以后的樣品，然后以Iml平衡液溶解樣品，并注入到柱子中去，額外加3ml上述平衡液對樣品洗脫，然后收集得到4ml ； (2)真空干燥上述樣品，在冰浴下加入300微升新鮮配制的NaBH4溶液，然后室溫下靜置過夜，冰浴下加入5滴乙酸終止反應(yīng)，然后升溫至室溫，并加入3ml乙醇，將該樣品真空濃縮干燥； (3)去除硼酸鹽:加入3ml乙酸:甲醇=1:100溶液，真空濃縮干燥后再加入3ml甲苯，將此過程重復(fù)3次；準備多孔石墨化碳預(yù)裝柱:洗柱子，依次加入下列試劑3ml:a) IMNaOH ；b) HPLC水；c)含有體積比0.1%三氟乙酸的80%的乙腈水溶液；d)含有體積比0.05%三氟乙酸的25%的乙腈溶液；e)25%乙腈溶液；f)7jC，用6-8ml水平衡柱子。切割下來的糖鏈用Iml水溶解后上樣，然后加入8-10ml水洗脫柱子，去除雜質(zhì)和鹽分。然后加入3ml25%ACN溶液就可以洗脫下中性的糖鏈(如果洗脫的糖是酸性的，需要加3ml體積比0.1%三氟乙酸的25%乙腈水溶液)。真空干燥樣品，加入甲醇溶解樣品準備質(zhì)譜分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測人血清中免疫球蛋白N糖鏈結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，所述的通過質(zhì)譜技術(shù)進行糖鏈結(jié)構(gòu)信息的解析步驟具體為: 純化好的N糖鏈加入300 μ L甲醇溶解，注入到質(zhì)譜儀并在正離子條件下檢測；質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)定如下:
流速:0.50μ L/min，溫度:230°C，氦氣流速:2arb,電壓:3.50kV，注入時間:100.0Oms,分辨率:m/zl.5，注入體積:2 μ L0
【文檔編號】G01N1/32GK103675085SQ201310659924
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】李云森, 許秀坤, 王征, 王艷萍, 解晴 申請人:北京集智新創(chuàng)科技有限公司