兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片及其制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及兔血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA液相懸浮芯片及其制備和應(yīng)用。一種兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片，包括分別和IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)的42號、48號和57號微球。另外，本發(fā)明制備兔IgG、IgM和IgA液相芯片，同步檢測WHBE兔和JW兔血清中IgG、IgM和IgA含量，建立檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA液相懸浮芯片方法。建立檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA液相懸浮芯片的方法，可應(yīng)用于免疫學(xué)和生物診斷試劑盒的研究開發(fā)，對生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其是為生物診斷試劑的研究開發(fā)和生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)材料和新的資源。
【專利說明】兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及兔血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA液相懸浮芯片及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]實(shí)驗(yàn)兔是目前生物醫(yī)藥產(chǎn)品研發(fā)及醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域最常用的實(shí)驗(yàn)動物之一，尤其在生物抗體制備、眼科手術(shù)研究等方面發(fā)揮著大小鼠無法比擬的優(yōu)勢。血清免疫球蛋白Ig水平是反映動物機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，Ig含量的變化與疾病密切相關(guān)，其中IgG、IgM和IgA是介導(dǎo)體液免疫的主要效應(yīng)分子。
[0003]液相懸浮芯片技術(shù)是可對多指標(biāo)同時進(jìn)行定性、定量的新型芯片技術(shù)，但是作為生物信息學(xué)先進(jìn)的操作技術(shù)平臺，液相芯片技術(shù)在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用仍受限制。目前國外已推出了商品化的可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動物研究的液相芯片試劑盒，但只局限于大小鼠的檢測，實(shí)驗(yàn)兔血清指標(biāo)的檢測，無法得到應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服以上問題，本發(fā)明的目的在于提供一種兔血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA液相懸浮芯片。
[0005]一種兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片，包括分別和IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)的42號、48號和57號微球。
[0006]另外，本發(fā)明還提供了一種兔血清免疫球蛋白IgM、IgG、IgA液相懸浮芯片的制備方法。
[0007]兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片的制備方法，包括如下步驟:
[0008]I)取100 μ 142號、48號和57號羧基微球進(jìn)行活化；
[0009]2)活化后的42號、48號和57號微球分別與不同濃度的親和純化的IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)，室溫避光旋轉(zhuǎn)偶聯(lián)2h ；
[0010]3)偶聯(lián)完畢的微球用PBST洗滌，得到兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片。
[0011]其中，步驟I)為取100 μ 142號、48號和57號羧基微球，加80 μ 10.lMNaH2P04、
10μ 150mg/ml S-NHS和10 μ 150mg/ml EDC活化緩沖液，室溫避光慢搖20min進(jìn)行活化；所述步驟3)為偶聯(lián)完畢的微球用0.05%PBST洗滌兩遍后，加lmll%PBSB室溫避光封閉30min，用1%PBSB清洗微球一遍，去除上清，加入150 μ 11%PBSB保存微球，得到兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片。
[0012]另外，本發(fā)明還提供了使用兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的應(yīng)用及用液相懸浮芯片檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的方法。
[0013]兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片的使用方法，包括如下步驟:
[0014](I)以100 μ I/孔1%PBSB潤濕PVDF膜反應(yīng)板，封閉lOmin，每孔分別加入偶聯(lián)兔IgG、IgM和IgA的微球各I X 104個，混合，抽濾棄去上清；[0015](2)反應(yīng)孔加入50 μ 14倍稀釋的兔血清樣品，封膜，恒溫孵育搖床500r/m室溫避光反應(yīng)60min ；
[0016](3) wash buffer 洗 3 次,加入混合的 IgG、IgM 和 IgA 檢測抗體，50 μ I/孔，500r/m 室溫避光反應(yīng) 60min, wash buffer 洗 3 次，加入 Streptavidin-ΡΕ 抗體，50 μ I/ 孔，500r/m反應(yīng)30min，抽濾棄去上清，用125 μ 11%PBSB重懸微球；
[0017](4)在Bio_Plex200液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測，液相懸浮芯片系統(tǒng)開機(jī)后須通過calibration kit和validation kit的激光光路校準(zhǔn),方可檢測。
[0018]所述的方法采用熒光微球和懸浮芯片系統(tǒng)流式技術(shù)。
[0019]所述的檢測對象為WHBE兔血清和JW兔血清。
[0020]所述的兔體重為2-2.5kg。
[0021]本發(fā)明制備兔IgG、IgM和IgA液相芯片，同步檢測WHBE兔和JW兔血清中IgG、IgM和IgA含量，建立檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA液相懸浮芯片方法。建立檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA液相懸浮芯片的方法，可應(yīng)用于免疫學(xué)和生物診斷試劑盒的研究開發(fā)，對生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其是為生物診斷試劑的研究開發(fā)和生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)材料和新的資源。
[0022]本發(fā)明所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中所需要的材料或試齊U，如無特殊說明均為市場購得。實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。所述百分比濃度若無特別說明均為質(zhì)量/體積(w/ν)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]下列實(shí)施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中所需要的材料或試劑，如無特殊說明均為市場購得。實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá)到具體公開的目的，不應(yīng)成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。
[0025]所述百分比濃度若無特別說明均為質(zhì)量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0026]實(shí)施例
[0027]1:材料與方法
[0028]1.1實(shí)驗(yàn)動物JW兔20只，WHBE兔20只，雌雄各半，體重約2-2.5k，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)兔生產(chǎn)基地[SCXK (浙)2009-0042]提供。
[0029]1.2樣品準(zhǔn)備:分別從WHBE兔和JW兔耳中動脈取適量血，置于IOml玻璃管中，4°C, 3000r/m,離心IOmin,分離血清，保存于_20°C。
[0030]1.3實(shí)驗(yàn)試劑:親和純化的IgG捕獲抗體、IgM捕獲抗體、IgA捕獲抗體均購自美國Bethyl公司，biotin標(biāo)記的IgG檢測抗體、IgM檢測抗體、IgA檢測抗體均購自美國Bethyl公司，Streptavidin-ΡΕ 抗體購自美國 Invitrogen 公司，Sulfo-NHS、EDC 購自美國 Thermo公司，Bio-Plex 羧基微球、Bio-Plex calibration kit 和 validation kit 均購自美國Bio-Rad 公司。[0031]1.4實(shí)驗(yàn)儀器:Bio-pleX200液相懸浮芯片系統(tǒng)，臺式冷凍高速離心機(jī)，恒溫孵育搖床，真空抽濾裝置，多功能酶標(biāo)儀。
[0032]1.5兔血清免疫球蛋白IgG、IgM和IgA液相懸浮芯片制備:42號、48號和57號微球分別和IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)，取100 μ 142號、48號和57號羧基微球(1.25 X IO6個 / 種)，加 80 μ 10.1M NaH2PO4 (pH6.2)、10 μ 150mg/ml S-NHS 和 10 μ 150mg/ml EDC 活化緩沖液，室溫避光慢搖20min進(jìn)行活化?；罨蟮?2號、48號和57號微球分別與5、10、15、20和30 μ g的親和純化的IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)，室溫避光旋轉(zhuǎn)偶聯(lián)2h，偶聯(lián)完畢的微球用0.05%PBST (pH7.4)洗滌兩遍后，加lmll%PBSB室溫避光封閉30min。用1%PBSB清洗微球一遍，去除上清，加入150μ 11%PBSB保存微球，可用血球計數(shù)器計算微球的濃度，4°C避光保存偶聯(lián)的微球。即得到兔血清免疫球蛋白IgG、IgM和IgA液相懸浮芯片。
[0033]1.6檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA液相懸浮芯片的方法的建立:用上述制備的兔IgG、IgM和IgA液相芯片(兔血清免疫球蛋白IgG、IgM和IgA液相懸浮芯片)，對20個WHBE兔和20個JW兔血清樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)檢測兩次，取平均值。具體操作如下:以100 μ 11%PBSB/孔潤濕PVDF膜反應(yīng)板，封閉lOmin，每孔分別加入偶聯(lián)兔IgG、IgM和IgA的微球各I X 104個，混合，抽濾棄去上清，反應(yīng)孔加入50 μ 14倍稀釋的WHBE兔、JW兔血清樣品，封膜，恒溫孵育搖床500r/m室溫避光反應(yīng)60min, wash buffer洗3次,加入混合的IgG、IgM和IgA檢測抗體，50 μ I/孔，500r/m室溫避光反應(yīng)60min,wash buffer洗3次,加入 Streptavidin-ΡΕ 抗體，50 μ I/孔，500r/m 反應(yīng) 30min,抽濾棄去上清，用 125 μ 11%PBSB重懸微球，在Bio_Plex200液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測。液相懸浮芯片系統(tǒng)開機(jī)后須通過calibration kit和validation kit的激光光路校準(zhǔn),方可檢測。
[0034]2 結(jié)果
[0035]對20個WHBE兔和20個JW兔血清樣品，用液相懸浮芯片技術(shù)進(jìn)行血清免疫球蛋白 IgG、IgM、IgA 檢測，WHBE 兔 IgG、IgM 和 IgA 蛋白含量分別為 13836.83 ±746.44FI，18044.40±606.27FI, 14816.00±687.90FI, Jff 兔 IgG、IgM 和 IgA 蛋白含量分別為14469.85±858.78FI, 18544.80±600.53FI, 14186.68±674.33FI,如表 I 所示，具體見表1_3 ο
[0036]表1兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量
[0037]
【權(quán)利要求】
1.一種兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片，包括分別和兔血清免疫球蛋白IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)的42號、48號和57號微球。
2.兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)取100μ 142號、48號和57號羧基微球進(jìn)行活化； 2)活化后的42號、48號和57號微球分別與不同濃度的親和純化的IgG、IgM和IgA捕獲抗體偶聯(lián)，室溫避光旋轉(zhuǎn)偶聯(lián)2h ； 3)偶聯(lián)完畢的微球用PBST洗滌，得到兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片的制備方法，其特征在于:所述步驟I)為取100 μ 142號、48號和57號羧基微球，加80 μ 10.1M NaH2P04、10 μ 150mg/mlS-NHS和10 μ 150mg/ml EDC活化緩沖液，室溫避光慢搖20min進(jìn)行活化；所述步驟3)為偶聯(lián)完畢的微球用0.05%PBST洗滌兩遍后，加lmll%PBSB室溫避光封閉30min，用1%PBSB清洗微球一遍，去除上清，加入150μ 11%PBSB保存微球，得到兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片。
4.使用兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的應(yīng)用。
5.使用兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片檢測兔血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的方法，包括如下步驟: (1)以IOOy11%PBSB/孔潤濕PVDF膜反應(yīng)板，封閉lOmin，每孔分別加入偶聯(lián)兔IgG、IgM和IgA的微球各I X 104個，混合，抽濾棄去上清； (2)反應(yīng)孔加入50μ 14倍稀釋的兔血清樣品，封膜，恒溫孵育搖床500r/m室溫避光反應(yīng) 60min ； (3)wash buffer洗3次,加入混合的IgG、IgM和IgA檢測抗體，50 μ I/孔，500r/m室溫避光反應(yīng) 60min, wash buffer 洗 3 次，加入 Streptavidin-ΡΕ 抗體，50 μ I/ 孔，500r/m 反應(yīng)30min，抽濾棄去上清，用125 μ 11%PBSB重懸微球； (4)在Bio_Plex200液相懸浮芯片系統(tǒng)上檢測，液相懸浮芯片系統(tǒng)開機(jī)后須通過calibration kit和validation kit的激光光路校準(zhǔn),方可檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片檢測的方法，其特征在于:所述的方法采用熒光微球和懸浮芯片系統(tǒng)流式技術(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用兔血清免疫球蛋白液相懸浮芯片檢測的方法，其特征在于:所述的檢測對象為WHBE兔血清和JW兔血清。
【文檔編號】G01N33/68GK103698534SQ201310674237
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】陳民利, 蔡月琴 申請人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)