褪黑素快速檢測方法及其檢測卡和制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種褪黑素快速檢測方法及其檢測卡和制備方法，旨在提供一種使用方便，快速簡便，靈敏度高的檢測食品、保健食品或藥品中摻雜褪黑素的快速檢測方法及其所用檢測卡，其技術(shù)要點(diǎn)：1）對需檢測的產(chǎn)品加有機(jī)溶劑溶解，加緩釋劑稀釋后過濾，收集濾液；2）將步驟1）收集的濾液滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡上，判斷待測樣品為陽性或陰性，若控制C線和檢測T線均顯紫紅色，則陰性；若控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則為陽性；膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明實(shí)驗(yàn)無效；屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】褪黑素快速檢測方法及其檢測卡和制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體的說，是一種褪黑素的快速檢測方法及試劑盒，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]褪黑素又稱松果體素，化學(xué)名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺，是人體大腦內(nèi)松果體分泌的一種吲哚胺類激素。其分泌隨著光照的增加而減少，故又被稱為黑暗荷爾蒙。褪黑素主要用于調(diào)節(jié)人體的清醒和睡眠周期，誘導(dǎo)生理睡眠，以及抗衰老等。
[0003]褪黑素是一種內(nèi)源性激素，有研究表明，大量使用褪黑素可能會(huì)引發(fā)呼吸問題，產(chǎn)生宿醉效應(yīng)，同時(shí)褪黑素會(huì)影響某些鎮(zhèn)靜安眠藥物如氯硝西泮的作用。在歐洲，褪黑素的服用周期、適用人群以及劑量均有嚴(yán)格限制。在美國，褪黑素以膳食補(bǔ)充劑的形式銷售，但其說明書上需明確標(biāo)示含量及使用劑量。在我國，褪黑素僅可作為保健食品，且有明確的使用規(guī)定:日服用劑量為I?3mg，不得添加除維生素B6以外的其他成分，注意事項(xiàng)中應(yīng)注明從事駕駛、機(jī)械作業(yè)或危險(xiǎn)操作者不要在操作前或操作中食用，自身免疫癥(類風(fēng)濕等)及甲亢患者慎用。故當(dāng)需服用褪黑素時(shí)最好遵循醫(yī)囑，以明確使用劑量，兒童使用更需要謹(jǐn)慎。
[0004]但是近年來，一些不法分子利用褪黑素的鎮(zhèn)靜、催眠的良好作用和健康產(chǎn)品成分復(fù)雜的特點(diǎn)，在鎮(zhèn)靜催眠類健康產(chǎn)品中擅自添加褪黑素，服用者在不知情的情況下服用該類產(chǎn)品，易引發(fā)不良后果，給人民群眾的身體健康造成了嚴(yán)重危害。
[0005]目前，在鎮(zhèn)靜安神類中成藥和保健食品中是否摻雜褪黑素的檢測方面主要有以下幾種方法:
[0006]1、理化反應(yīng)的快速篩查方法
[0007]樣品中的待測成分經(jīng)乙酸乙酯提取后，向提取液中加入對二甲氨基肉桂醛鹽酸乙醇溶液，通過觀察溶液顏色的變化來判斷，樣品中是否含有褪黑素化學(xué)成分。若溶液顏色在30秒內(nèi)呈現(xiàn)明顯藍(lán)色至綠色，則提示樣品中可能含有褪黑素成分。
[0008]該方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要昂貴的分析儀器，檢測成本低，可快速、簡便的進(jìn)行檢測，對環(huán)境的要求不高，對操作人員的專業(yè)要求也不高，可滿足現(xiàn)場檢測的需求。但該方法也存在以下缺點(diǎn):
[0009]試劑以對二甲氨基肉桂醛鹽酸乙醇溶液為顯色劑，該試劑的穩(wěn)定較差，長時(shí)間放置容易導(dǎo)致試劑靈敏度不足，需臨用前配制，對于現(xiàn)場檢測來說較為繁瑣。
[0010]試劑中使用的鹽酸乙醇溶液，具有一定的腐蝕性，并且提取劑乙酸乙酯，具有一定的氣味，對于現(xiàn)場操作人員具有一定的危害性。而且方法的靈敏度較低，受樣品本身的顏色干擾較大，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，容易產(chǎn)生誤判。
[0011]2、薄層色譜法
[0012]樣品中的待測成分經(jīng)過甲醇提取，所得供試品溶液與對照品溶液在硅膠板上經(jīng)展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈254nm下檢視。在展開劑的作用下，由于不同物質(zhì)的遷移速度不同，不同物質(zhì)在薄層色譜板上的不同位置以斑點(diǎn)的形式出現(xiàn)，根據(jù)待測樣品是否在與對照品相應(yīng)的位置出現(xiàn)斑點(diǎn)這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來判斷待測樣品中是否含有目標(biāo)成分。如果供試品溶液薄層色譜圖與褪黑素對照品相應(yīng)位置出現(xiàn)斑點(diǎn)，則提示樣品中可能含有褪黑素成分。
[0013]薄層色譜法的優(yōu)點(diǎn)是不需要昂貴的分析儀器。該法缺點(diǎn)是:色譜分辨率較低，中成藥成分復(fù)雜，干擾因素多，容易產(chǎn)生誤判。
[0014]色譜展開和晾干所需時(shí)間較長，不足以滿足快速測定的要求。薄層色譜板需要烘干并干燥存放，分離效果受環(huán)境因素影響較大，不適合現(xiàn)場檢測。需要有固定的場所，不合適作流動(dòng)性大的現(xiàn)場檢測。對檢測人員的專業(yè)技術(shù)要求較高，不適合基層人員現(xiàn)場操作。
[0015]3、高效液相色譜法
[0016]高效液相色譜法是常用的現(xiàn)代分析方法，在相同的色譜條件下，不同的物質(zhì)有不同的色譜保留時(shí)間。在相同的色譜條件下褪黑素對照品溶液與樣品提取所得供試品溶液分別進(jìn)樣，根據(jù)色譜保留時(shí)間可判斷待測樣品是否含有褪黑素成分。
[0017]高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)是色譜分離效率高、靈敏度高。但目前也存在以下缺點(diǎn):儀器價(jià)格昂貴，樣品前處理時(shí)間長，色譜柱易受污染，分析成本高；當(dāng)共存成分的色譜峰保留時(shí)間與褪黑素色譜保留時(shí)間接近時(shí)容易造成誤判；儀器對環(huán)境的要求高，需固定放置，不適合現(xiàn)場檢測。
[0018]4、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法
[0019]以高效液相色譜儀作為分離器，質(zhì)譜儀作為分析器的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法適合于成分復(fù)雜、背景干擾嚴(yán)重的樣品分析，這種分析方法可提高檢測結(jié)果的可靠性。但高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是一種分析成本比高效液相色譜更高，操作更加復(fù)雜的分析方法。儀器對環(huán)境的要求更高，需要固定放置，不合適現(xiàn)場檢測。目前這些檢驗(yàn)只能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，不易推廣使用。
[0020]綜上所述，目前在中成藥和保健食品中是否摻雜褪黑素的檢測方面，雖然有適合現(xiàn)場檢測的理化反應(yīng)快速篩查方法發(fā)布，但尚一種靈敏度，操作簡單，進(jìn)行快速篩查褪黑素的方法，對于藥店和基礎(chǔ)藥檢單位，開發(fā)中成藥和保健食品中非法摻雜褪黑素的快速篩查方法，在監(jiān)管現(xiàn)場對樣品進(jìn)行快速分析，為中成藥和保健食品監(jiān)管及時(shí)提供證據(jù)，打擊不法分子的造假行為和保障人民群眾的用藥安全是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021]針對上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便，快速簡便，靈敏度高的檢測食品、保健食品或藥品中摻雜褪黑素的快速篩查方法及其所用檢測卡。
[0022]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的前一技術(shù)方案是這樣的:該褪黑素的快速檢測方法，依次包括下述步驟:
[0023]I)對需檢測的產(chǎn)品加有機(jī)溶劑溶解，加緩釋劑稀釋后過濾，收集濾液；
[0024]2)將步驟I)收集的濾液滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡上，開始計(jì)時(shí)，3?5min后，根據(jù)膠體金試紙條的檢測T線和控制C線的顯色，判斷待測樣品為陽性或陰性；
[0025]3)步驟2)所述的膠體金檢測試紙上的控制C線和檢測T線均顯紫紅色，則判斷為陰性，即待測樣品中未摻雜褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷為陽性，即待測樣品中含有褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)用新的膠體金檢測試紙重新檢測。
[0026]上述的褪黑素的快速檢測方法步驟I)所述的有機(jī)溶劑為醇類有機(jī)溶劑或氯仿。
[0027]進(jìn)一步的，上述的褪黑素的快速檢測方法，所述的醇類有機(jī)溶劑為乙醇。
[0028]進(jìn)一步的，上述的褪黑素的快速檢測方法，步驟I)所述的緩釋劑為PBS緩沖液。
[0029]本發(fā)明另外一個(gè)技術(shù)方法，是提供一種檢測褪黑素的檢測卡，包括PVC板和PVC板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，其特征在于:所述的金標(biāo)接合墊為吸附褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物的玻璃纖維，在包被膜上依次用褪黑素偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱性檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱性質(zhì)控線C線，兩條線平行排列。
[0030]進(jìn)一步的，上述的檢測卡，所述的包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，所述的兔IgG的用量為0.2~0.9 μ g/cm2 ;所述的褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物的用量為0.09~0.5 μ g/cm2 ;所述的褪黑素單克隆抗原的用量為0.03~0.1 μ g/mm ;所述的羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量為0.03~0.05 μ g/mm。
[0031]本發(fā)明最后一個(gè)技術(shù)方案提供該檢測卡的制備方法，在PVC板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊；
[0032]其中:
[0033]I)包被膜的制備方法是:
[0034]用ρΗ7.4，0.01M PBS緩沖液、10%~20%蔗糖將褪黑素抗原稀釋到0.3~1.0mg/ml,噴至硝酸纖維膜上，每300mm的噴量為30ul,為T線；羊抗兔IgG稀釋到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，為C線，C、T線的間距為4.5mm，烘箱45°C中放置12~18小時(shí)；
[0035]2)金標(biāo)結(jié)合墊的制備方法是:
[0036]用高純水將1%的氯金酸稀釋濃度為0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100mL氯金酸稀釋液一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)充損耗的高純水，得透亮，無雜質(zhì)和漂浮物的膠體金；
[0037]取半徑為15nm~40nm的膠體金顆粒，調(diào)pH值到7.0~7.4,在攪拌下按10 μ g抗體/ml膠體金加入褪黑素單克隆抗體，最后每1ml加入IOOul 10%BSA使其穩(wěn)定，在12000rpm/s離心30min,棄上清液,將沉淀用十分之一初始膠體金體積的0.01MpH8.5的Tris-HCl 緩沖液，1%。~5%。PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重懸；
[0038]將褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl 緩沖液，1%?~5% PVP-40, 5%BSA, 1%?~5% TritonX-100,0.1%?~0.5% NaN3 稀釋至3%~10%，取玻璃纖維，每張涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C保溫18~24小時(shí)；或者把褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物每IOOul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，0.1%。~0.5%。NaN3稀釋至150~300ul，再加20%蔗糖，溶解混勻，用噴金設(shè)備噴至已處理過的聚酯膜或玻璃纖維上；
[0039]3)制樣品墊
[0040] 取玻璃纖維，每張涂布20ml~30ml涂布溶液為0.01MpH7.4的PBS，1%BSA,l%TWEEN-20,0.1%。?0.5% NaN3，置烘箱在 37°C烘干 18 ?24 小時(shí)。
[0041]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0042]1、本發(fā)明操作步驟簡單，檢測速度快，結(jié)果容易觀察，可實(shí)現(xiàn)對大批量樣品的快速篩查，大大降低檢測成本，減少工作量，在食品藥品監(jiān)管中具有實(shí)際意義；
[0043]2、本發(fā)明針對待測樣品成分復(fù)雜問題，對樣品預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，所需樣品量少，僅需提取、稀釋兩步即可完成樣品前處理。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是本發(fā)明提供的檢測試卡結(jié)構(gòu)示意圖；
[0045]圖2是本發(fā)明提供的檢測卡判定結(jié)果為陰性時(shí)示意圖；
[0046]圖3是本發(fā)明提供的檢測卡判定結(jié)果為陽性時(shí)示意圖；
[0047]圖4是本發(fā)明提供的檢測卡判定結(jié)果為無效時(shí)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)。
[0049]實(shí)施例1
[0050]該褪黑素的快速檢測方法，依次包括下述步驟:
[0051]I)對需檢測的產(chǎn)品加醇類有機(jī)溶劑溶解，較優(yōu)的醇類有機(jī)溶劑是乙醇，再加PBS緩釋劑稀釋后過濾，收集濾液；
[0052]其中:不同劑型樣品溶解方法如下:
[0053]硬膠囊:旋開膠囊殼，取約I粒內(nèi)容物。
[0054]軟膠囊:用剪刀剪開膠囊殼，擠出約I粒內(nèi)容物。
[0055]片劑:壓碎成粉末，取約I片量。
[0056]丸劑:取每次服用量的1/2左右，壓碎或剪碎。
[0057]向上述樣品的任意一種樣品加入有機(jī)溶劑，優(yōu)選為乙醇，有機(jī)溶劑的使用量以浸沒待測樣品為宜，本發(fā)明選用I?2mL的使用量，基本上可覆蓋不同劑型樣品的需要。
[0058]為保證提取完全，振搖時(shí)間應(yīng)不少于30秒，以適應(yīng)各種劑型的需要。
[0059]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，滴加至褪黑素膠體金試紙條上的濾液，若有機(jī)溶劑的濃度大于50%，則褪黑素膠體金試紙條不能正常使用，因而需加入ImL以上的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋。同時(shí)，考慮到提取液在過濾過程中需損耗一定的溶液，因此本發(fā)明加PBS緩沖液進(jìn)行稀釋至總體積為10mL，既確保試紙的靈敏度，又保證有足夠的提取液進(jìn)行加樣。
[0060]液體劑型:無需前處理，直接檢測。
[0061]2)將步驟I)收集的濾液滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡上，開始計(jì)時(shí)，3?5min后，根據(jù)膠體金試紙條的檢測T線和控制C線的顯色，判斷待測樣品為陽性或陰性；
[0062]3)步驟2)所述的膠體金檢測試紙上的控制C線和檢測T線均顯紫紅色，則判斷為陰性，即待測樣品中未摻雜褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷為陽性，即待測樣品中含有褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)用新的膠體金檢測試紙重新檢測。
[0063]檢測時(shí)所使用的檢測卡，包括PVC板和PVC板5上依次銜接的樣品墊1、金標(biāo)結(jié)合墊2、包被膜3和吸水墊4組成，參閱圖1，樣品墊I壓在金標(biāo)結(jié)合墊2的1/2~1/3左右，金標(biāo)結(jié)合墊2壓在包被膜3的0.1~0.2cm, T線距離包被膜3下端6mm，C線距離包被膜3上端6mm, C、T間距為4.5mm,吸水墊壓在包被膜0.1~0.2cm處。
[0064]其中:金標(biāo)結(jié)合墊為吸附褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物的玻璃纖維，依次在包被膜上用褪黑素偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱性檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱性質(zhì)控線C線，兩條線平行排列。
[0065]所述的包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，所述的單克隆-兔IgG的用量為0.2~0.9 μ g/cm2,優(yōu)選0.25~0.45 μ g/cm2,更優(yōu)的選擇為0.3 μ g/cm2,所述的褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物的用量為0.09~0.5 μ g/cm2,優(yōu)選0.15 μ g/mm,所述的羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量為 0.03~0.05 μ g/mm,優(yōu)選0.04 μ g/mm,所述的褪黑素單克隆抗原的用量為0.03~0.1 μ g/mm，優(yōu)選0.05 μ g/mm。
[0066]該檢測卡的制備方法是在PVC板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊；
[0067]其中:
[0068]I)包被膜的制備方法是:
[0069]用ρΗ7.4，0.01M PBS緩沖液、10%~20%蔗糖將褪黑素抗原稀釋到0.3~1.0mg/ml,噴至硝酸纖維膜上，每300mm的噴量為30ul,為T線；羊抗兔稀釋到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，運(yùn)轉(zhuǎn)速度為80毫米/秒，泵壓力IOOPa壓力，移動(dòng)長度290cm為C線，C、T線的間距為4.5mm，放45°C烘箱過夜12~18小時(shí)；
[0070]2)金標(biāo)結(jié)合墊的制備方法是:
[0071]用高純水將1%的氯金酸稀釋成0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100mL 一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)充損失的水份，得到透亮，無雜質(zhì)和漂浮物的膠體金，可保存一個(gè)月不發(fā)生改變。
[0072]取半徑為15nm~40nm的膠體金顆粒，調(diào)pH值到7.0~7.4,在攪拌下按10 μ g抗體/ml膠體金加入褪黑素單克隆抗體,最后每1ml加入100ull0%的BSA使其穩(wěn)定，在12000rpm/s離心30min,棄上清液,將沉淀用十分之一初始膠體金體積的IOOul的0.01MρΗ8.5 的 Tris-HCl 緩沖液，1%。~5%。PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重懸，置 4°C可放2個(gè)月左右；
[0073]把褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物用0.01M pH8.0的Tris-HCl 緩沖液，1%?~5% PVP-40，5%BSA，I %?~5% TritonX-100,0.1%?~0.5% NaN3稀釋至3%~10%，取面積為25*30cm的玻璃纖維，每張涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C放置18~24小時(shí)；或者把褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物每IOOul 用 0.01M ρΗ8.0 的 PBS、5%BSA,0.1%。~0.5%。NaN3 稀釋至 150 ~300ul，再加 20% 蔗糖，溶解混勻，用噴金設(shè)備噴至已處理過的聚酯膜或玻璃纖維上；所用的設(shè)備壓力0.015~
0.02MPa，噴金參數(shù)為0.05~0.2ul/mm，運(yùn)轉(zhuǎn)速度為80毫米/秒，噴至已處理過的聚酯膜或玻璃纖維上，聚酯膜或玻璃纖維處理方法為:把聚酯膜或玻璃纖維放在處理液為3%。?5%o Tris, 5%BSA, 0.1%。?0.5%。NaN3中浸泡2小時(shí)，液體應(yīng)完全沒過聚酯膜或玻璃纖維，置37°C烘箱12?18小時(shí)。
[0074]3)制備樣品墊
[0075]取25*30cm玻璃纖維，每張涂布20ml?30ml涂布溶液為0.0lM pH7.4的PBS，1%BSA, l%TWEEN-20,0.1%。-0.5%。NaN3,置烘箱 37 度 18 ?24 小時(shí)。
[0076]檢測例I
[0077]市售保健食品某品牌牌美眠褪黑素膠囊(膠囊劑，標(biāo)示服用量為每次2粒，標(biāo)識(shí)“含褪黑素”，功效成分及含量顯示:每IOOg含褪黑素282mg)
[0078]取本品膠囊劑I粒，旋開膠囊殼，取約I粒內(nèi)容物置于樣品管中，加入I?2mL氯仿溶解，大力振搖約Imin后，再加PBS緩釋劑稀釋作為待測液。用一次性小吸管吸取3滴待測液垂直滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡的加樣孔中，開始計(jì)時(shí)，3min后判定結(jié)果為，參閱圖3，膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷待測樣品中含有褪黑素化學(xué)成分，與功效成分及含量提示結(jié)果一致。
[0079]采用高效液相液相色譜法技術(shù)對本實(shí)施例的賽天仙牌美眠褪黑素膠囊進(jìn)行驗(yàn)證檢測，檢測結(jié)果本品每粒含褪黑素1.lmg，與本發(fā)明的檢測方法結(jié)果一致。
[0080]檢測例2
[0081]市售某品牌保健食品A(膠囊劑，標(biāo)示服用量為每次I?4粒，未標(biāo)識(shí)“含褪黑素”)
[0082]取本品膠囊劑I粒，旋開膠囊殼，取約I粒內(nèi)容物置于樣品管中，加入I?2mL乙醇，大力振搖約Imin后，再加PBS緩釋劑稀釋作為待測液。用一次性小吸管吸取3滴待測液垂直滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡的加樣孔中，開始計(jì)時(shí)，3min后判定結(jié)果，參閱圖3:膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷待測樣品中含有非法添加褪黑素化學(xué)成分。
[0083]采用高效液相液相色譜法技術(shù)對本實(shí)施例的市售保健食品A進(jìn)行驗(yàn)證檢測，檢測結(jié)果本品每粒含褪黑素0.9mg，與本發(fā)明的檢測方法結(jié)果一致。
[0084]檢測例3
[0085]市售某品牌保健食品安神補(bǔ)腦液(口服液，標(biāo)示服用量為每次I支，未標(biāo)識(shí)“含褪黑素”)
[0086]用一次性小吸管吸取3滴口服液垂直滴加于褪黑素膠體金層析檢測卡的加樣孔中，開始計(jì)時(shí)，3min后判定結(jié)果，參閱圖2:膠體金檢測試紙上的控制線C、檢測線T均顯紫紅色，則判斷待測樣品中沒有褪黑素化學(xué)成分。若出現(xiàn)圖4所述的情況的，膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明檢測無效。
[0087]采用高效液相液相色譜法技術(shù)對該品牌保健食品安神補(bǔ)腦液進(jìn)行驗(yàn)證檢測，檢測結(jié)果為未檢出褪黑素成分，與本發(fā)明的檢測方法結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.一種褪黑素的快速檢測方法，其特征在于，依次包括下述步驟: 1)對需檢測的產(chǎn)品加有機(jī)溶劑溶解,加緩釋劑稀釋后過濾,收集濾液； 2)將步驟I)收集的濾液滴加在褪黑素膠體金層析檢測卡上，開始計(jì)時(shí)，3~5min后，根據(jù)膠體金試紙條的檢測T線和控制C線的顯色，判斷待測樣品為陽性或陰性； 3)步驟2)所述的膠體金檢測試紙上的控制C線和檢測T線均顯紫紅色，則判斷為陰性，即待測樣品中未摻雜褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C顯紫紅色，檢測線T不顯色，則判斷為陽性，即待測樣品中摻雜有褪黑素化學(xué)成分；膠體金檢測試紙上的控制線C和檢測線T均不顯色，或只出現(xiàn)檢測線T顯色，則說明實(shí)驗(yàn)無效，應(yīng)用新的膠體金檢測試紙重新檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑素的快速檢測方法，其特征在于，步驟I)所述的有機(jī)溶劑為醇類有機(jī)溶劑或氯仿。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的褪黑素的快速檢測方法，其特征在于，所述的醇類有機(jī)溶劑為乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑素的快速檢測方法，其特征在于，步驟I)所述的緩釋劑為PBS緩沖液。
5.一種用于檢測權(quán)利要求1所述的褪黑素的檢測卡，其特征在于，包括PVC板和PVC板上依次銜接的樣品墊、金 標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，其特征在于:所述的金標(biāo)接合墊為吸附褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物的玻璃纖維，依次在包被膜上用褪黑素偶聯(lián)載體蛋白的溶液印制的直線式隱性檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱性質(zhì)控線C線，兩條線平行排列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于，所述的包被膜為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于，所述的兔IgG的用量為0.2~0.9 μ g/cm2
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于，所述的褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物的用量為0.09~0.5 μ g/cm2 ;所述的褪黑素單克隆抗原的用量為0.03~0.1 μ g/mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測卡，其特征在于，所述的羊抗兔IgG的濃度為4mg/ml，所述的羊抗兔IgG的用量為0.03~0.05 μ g/mm。
10.權(quán)利要求5所述的檢測卡的制備方法，其特征在于，在PVC板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊； 其中: 1)包被膜的制備方法是: 用ρΗ7.4，0.01M PBS緩沖液、10%~20%蔗糖將褪黑素抗原稀釋到0.3~1.0mg/ml，噴至硝酸纖維膜上，每300mm的噴量為30ul,為T線；羊抗兔IgG稀釋到0.3mg/ml~0.5mg/ml，每300mm的噴量為30ul，為C線，C、T線的間距為4.5mm，烘箱45°C中放置12~18小時(shí)； 2)金標(biāo)結(jié)合墊的制備方法是: 用高純水將1%的氯金酸稀釋濃度為0.01%，放入磁力攪拌子，置于恒溫磁力攪拌加熱套上煮沸，劇烈沸騰后每100mL氯金酸稀釋液一次性迅速加入0.7ml的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，至顏色保持紅色不再發(fā)生改變停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)充損耗的高純水，得透亮，無雜質(zhì)和漂浮物的膠體金； 取半徑為15nm~40nm的膠體金顆粒,調(diào)pH值到7.0~7.4,在攪拌下按10 μ g抗體/ml膠體金加入褪黑素單克隆抗體,最后每1ml加入IOOul 10%BSA使其穩(wěn)定,在12000rpm/s離心30min，棄上清液，將沉淀用十分之一初始膠體金體積的0.01M pH8.5的Tris-HCl緩沖液，1%。~5% PVP-40, 5%BSA, 0.1%。~0.5%。NaN3 重懸； 將褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物用0.01MpH8.0的Tris-HCl 緩沖液，1%?~5%。PVP-40, 5%BSA, 1%?~5%。TritonX-100,0.1%?~0.5%。NaN3 稀釋至3%~10%，取玻璃纖維，每張涂布20ml~30ml，置烘箱，在37°C保溫18~24小時(shí)；或者把褪黑素單克隆抗體-膠體金復(fù)合物和兔IgG-膠體金復(fù)合物每IOOul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，0.1%。~0.5%。NaN3稀釋至150~300ul，再加20%蔗糖，溶解混勻，用噴金設(shè)備噴至已處理過的聚酯膜或玻璃纖維上； . 3)制樣品墊 取玻璃纖維，每張涂布20ml~30ml涂布溶液為0.01MpH7.4的PBS，1%BSA,.l%TWEEN-20,0.1%。~0.5%。NaN3，置烘箱在 37°C烘干 18 ~24 小時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103969454SQ201310698818
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】石松, 王鐵杰, 王懿, 殷果, 王炳志, 黃凡, 韓東歧, 郭建瓊, 王瑩瑩, 張炎欽 申請人:深圳市藥品檢驗(yàn)所, 廣州達(dá)元食品安全技術(shù)有限公司