用干姜、穿山龍、雞血藤制成的治療風(fēng)濕痹痛藥的hplc特征圖譜的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用干姜、穿山龍、雞血藤制成的治療風(fēng)濕痹痛藥的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，包括供試品溶液的制備，對照品溶液的制備，藥材溶液的制備，陰性對照品溶液的制備，色譜條件限定，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液各20μl注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得HPLC特征圖譜。本發(fā)明的積極效果是：在同一色譜條件下同時檢測兩味藥材化學(xué)成分，從指紋圖譜的相似度判斷批量之間的質(zhì)量一致性。還可追根溯源，尋找工藝操作中的問題。指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9，能有效的反映成品批與批之間的質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。避免了質(zhì)量控制的單一性和片面性。并具有方便、快捷、穩(wěn)定、精密、重現(xiàn)性好等特點。
【專利說明】用干姜、穿山龍、雞血藤制成的治療風(fēng)濕痹痛藥的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種治療風(fēng)濕痹痛制劑的質(zhì)量控制方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥特征圖譜能全面、綜合的反映所含成分的相對關(guān)系，較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，具有特征明顯、專屬性強、重現(xiàn)性好等特點，隨著中醫(yī)中藥的推廣應(yīng)用，特征圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已成為被國內(nèi)外廣泛接受的一種對中藥質(zhì)量進行評價的技術(shù)。
[0003]此前，用雞血藤、穿山龍、干姜制成的治療風(fēng)濕痹痛藥(商品名稱:骨骼風(fēng)痛片)的質(zhì)量檢測方法，多采用標(biāo)準(zhǔn)號:WS-10720 (2D-0720)-2002-2007中給出的方法，即采用薄層色譜法對干姜、穿山龍進行鑒別，含量測定采用高效液相色譜法對穿山龍薯蕷皂苷進行含量測定。中國專利CN1857705A中公開了一種骨骼風(fēng)痛制劑的質(zhì)量檢測方法，包括采用薄層色譜法對干姜、雞血藤、穿山龍進行鑒別，采用重量法對總皂苷進行含量測定。前述檢測方法存在的不足之處有:
[0004]1、在專利CN1857705A中，含量測定方法采用重量法對水溶性總皂苷的含量進行測定，沒有對其中多味藥材的主要化學(xué)成分進行全面、系統(tǒng)的檢測。
[0005]2、現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量檢測方法不能全面的監(jiān)控原料藥材、中間體、成品的質(zhì)量。
[0006]綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中對骨骼風(fēng)痛制劑的檢測方法存在方法繁瑣、不能快速、全面的對骨骼風(fēng)痛制劑進行檢測和鑒定等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種用雞血藤、穿山龍、干姜制成的治療風(fēng)濕痹痛藥的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，克服現(xiàn)有的檢測方法存在的前述不足。
[0008]本發(fā)明的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法包括:
[0009]1、供試品溶液的制備:取骨骼風(fēng)痛制劑10g，精密稱定，加水50?100ml，充分?jǐn)嚢?，靜止I?3小時后，離心，取上清液過濾，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，80°C水浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用環(huán)己烷振搖提取3次，每次20ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0010]2、對照品溶液的制備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg置25ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0011]3、藥材溶液的制備:分別取雞血藤藥材、干姜藥材各10g，粉碎，分別加水20?30ml，精密稱定重量，超聲提取20?30分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環(huán)己烷振搖提取3次，每次30ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。[0012]4、陰性對照品溶液的制備:按照骨骼風(fēng)痛片的工藝，分別制備缺少雞血藤藥材、干姜藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、干姜陰性樣品各10g，按供試品溶液制備方法制備，即得。
[0013]5、色譜條件:色譜柱GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX250mm);流動相為乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液的混合物，其中乙腈占流動相體積的30-35%，等度洗脫；檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。
[0014]6、測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照溶液各20μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到用雞血藤、穿山龍、干姜制成的治療風(fēng)濕痹痛藥(骨骼風(fēng)痛制劑)的HPLC特征圖譜。
[0015]本發(fā)明的HPLC特征圖譜的最佳構(gòu)建方法如下:(以下技術(shù)方案中所記載的各物質(zhì)的用量或用量范圍，旨在表明各物質(zhì)間的用量比例關(guān)系，并不限定在記載的具體數(shù)量上。)
[0016]1、供試品溶液的制備:取骨骼風(fēng)痛制劑10g，精密稱定，加水100ml，充分?jǐn)嚢瑁o置2小時后，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，80°C水浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用環(huán)己烷振搖提取3次，每次20ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0017]2、對照品溶液的制備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液。
[0018]3、藥材溶液的制備:分別取雞血藤藥材、干姜藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環(huán)己烷振搖提取3次，每次30ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0019]4、陰性對照品溶液的制備:按照骨骼風(fēng)痛片的工藝，分別制備缺少雞血藤藥材、干姜藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、干姜陰性樣品各10g，按供試品溶液制備方法制備，即得。
[0020]5、色譜條件:色譜柱GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液混合物，其中乙腈含量占流動相體積的32% ;檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。
[0021]6、測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液各20μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到得到用雞血藤、穿山龍、干姜制成的治療風(fēng)濕痹痛藥(骨骼風(fēng)痛制劑)的HPLC特征圖譜。
[0022]其中供試品指紋圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004Α版》進行評價，供試品批與批間的相似度均大于0.90。
[0023]其中所述骨骼風(fēng)痛制劑的HPLC特征圖譜中共有12個特征共有峰，其中歸屬于雞血藤的特征圖譜具有3個特征共有峰:3號峰、7號峰、10號峰；歸屬于干姜的特征圖譜具有6個特征共有峰:1號峰、2號峰、8號峰、9號峰、11號峰、12號峰。
[0024]前述的骨骼風(fēng)痛制劑的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，在280nm波長檢測下利用各標(biāo)準(zhǔn)品對主要峰進行比較確定；7號峰為芒柄花素、12號峰為6-姜酚。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果如下:[0026]該方法采用高效液相色譜法，在同一色譜條件下同時檢測復(fù)方中的兩味藥材化學(xué)成分，從指紋圖譜的相似度判斷骨骼風(fēng)痛制劑批與批之間的質(zhì)量一致性。還可依據(jù)成品、半成品、原料藥材的特征圖譜變化來追根溯源，尋找工藝操作中的問題。
[0027](I)用本發(fā)明所提供的方法構(gòu)建的骨骼風(fēng)痛制劑指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9，能有效的反映成品批與批之間的質(zhì)量，有利于全面監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0028](2)本發(fā)明采用高效液相色譜法，在同一色譜條件下同時檢測復(fù)方中的兩味藥材成分，對有效成分既能定性又能定量，并通過骨骼風(fēng)痛制劑的特征圖譜，獲得原料與成品之間的相關(guān)性，避免了骨骼風(fēng)痛制劑質(zhì)量控制的單一性和片面性。
[0029](3)本發(fā)明具有方便、快捷、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好等特點，可準(zhǔn)確可靠的控制骨骼風(fēng)痛制劑的質(zhì)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1是骨骼風(fēng)痛片的指紋圖譜
[0031]圖2是骨骼風(fēng)痛片的對照圖譜(采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》選擇中位數(shù)法生成)
[0032]圖3是骨骼風(fēng)痛片中雞血藤藥材特征峰歸屬圖譜
[0033]圖4是骨骼風(fēng)痛片中干姜藥材特征峰歸屬圖譜
【具體實施方式】
[0034]實施例1:骨骼風(fēng)痛片特征圖譜方法的建立。
[0035]I儀器:HITACHI高效液相色譜儀，紫外檢測器；Mettler AE240十萬分之一分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；AB204-E電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)等。
[0036]2試劑與試藥
[0037]2.1試劑:乙酸乙酯、環(huán)己烷、磷酸、甲醇等為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。
[0038]2.2試藥:芒柄花素對照品、6-姜酚對照品。骨骼風(fēng)痛片(批號:20120901、20120902、20120903、20120904、20120905、20121001、20121002、20121003、20121004、20121005)由修正藥業(yè)集團通藥制藥股份有限公司提供。
[0039]3方法與結(jié)果
[0040]3.1 色譜條件:色譜柱 GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(32:68);檢測波長:280nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min。
[0041]3.2溶液的制備
[0042]3.2.1供試品溶液的制備:取骨骼風(fēng)痛片10g，精密稱定，加水100ml，充分?jǐn)嚢?，靜置2小時后，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，80°C水浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用環(huán)己烷振搖提取3次，每次20ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0043]3.2.2對照品溶液的制備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液。
[0044]3.2.3藥材溶液的制備:分別取雞血藤藥材、干姜藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環(huán)己烷振搖提取3次，每次30ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0045]3.2.4陰性對照品溶液的制備:按照骨骼風(fēng)痛片的工藝，分別制備缺少雞血藤藥材、干姜藥材的陰性樣品。分別取雞血藤陰性樣品、干姜陰性樣品各10g，按供試品溶液制備方法制備，即得。
[0046]3.3 色譜條件:色譜柱 GraceSmart RP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(32:68);檢測波長:280nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min。
[0047]3.4測定:分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液、藥材溶液、陰性對照品溶液20 μ I注入液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到骨骼風(fēng)痛制劑的特征圖譜。
[0048]3.5指紋圖譜的建立
[0049]采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004Α版》對10批骨骼風(fēng)痛片進行相似度評價，見圖1。選擇中位數(shù)法生成對照圖譜，見圖2。結(jié)果表明，10批供試品指紋圖譜與生成的對照圖譜(S)的相似度均大于0.90。相似度比較結(jié)果見表1。
[0050]表1骨骼風(fēng)痛片相似度比較結(jié)果
[0051]
【權(quán)利要求】
1.用干姜、穿山龍、雞血藤制成的治療風(fēng)濕痹痛藥的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，其特征是包括下述步驟: (1)供試品溶液的制備:取骨骼風(fēng)痛制劑10g，精密稱定，加水50~100ml，充分?jǐn)嚢?，靜止I~3小時后，離心，取上清液過濾，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，80°C水浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用環(huán)己烷振搖提取3次，每次20ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (2)對照品溶液的制備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg置25ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (3)藥材溶液的制備:分別取雞血藤藥材、干姜藥材各10g，粉碎，分別加水20~30ml，精密稱定重量，超聲提取20~30分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環(huán)己烷振搖提取3次，每次30ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (4)陰性對照品溶液的制備:按照骨骼風(fēng)痛片的工藝，分別制備缺少雞血藤藥材、干姜藥材的陰性樣品，分別取雞血藤陰性樣品、干姜陰性樣品各10g，按供試品溶液制備方法制備，即得； (5)色譜條件:色譜柱GraceSmartRP18 (5 μ m, 4.6mmX250mm);流動相為乙腈和濃度為0.1%的磷酸水溶液的混合物，其中乙腈占流動相體積的30~35%:，等度洗脫；檢測波長:280nm ;柱溫 40°C ;流速 0.8ml/min。 (6)測定:分別精密吸取步驟(1)所得的供試品溶液和步驟(2)所得的對照品溶液、步驟(3)所得的藥材溶液、步驟(4)所得的陰性對照溶液各20μ I注入步驟(5)所限條件的液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得HPLC特征圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的由干姜、穿山龍、雞血藤制成的治療風(fēng)濕痹痛制劑的HPLC特征圖譜的構(gòu)建方法，其特征是: (1)供試品溶液的制備:取骨骼風(fēng)痛制劑10g，精密稱定，加水100ml，充分?jǐn)嚢?，靜置2小時后，離心，取上清液，濾過，濃縮至20ml，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，80°C水浴蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用環(huán)己烷振搖提取3次，每次20ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (2)對照品溶液的制備:精密稱取芒柄花素、6-姜酚對照品各5mg，分別置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液； (3)藥材溶液的制備:分別取雞血藤藥材、干姜藥材各10g，粉碎，分別加水30ml，精密稱定重量，超聲提取20分鐘，放冷，再精密稱定重量，用水補足減失的重量，濾過，濾液用環(huán)己烷振搖提取3次，每次30ml，合并環(huán)己烷液，80°C水浴蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得； (4)陰性對照品溶液的制備:按照骨骼風(fēng)痛片的工藝，分別制備缺少雞血藤藥材、干姜藥材的陰性樣品，分別取雞血藤陰性樣品、干姜陰性樣品各10g，按供試品溶液制備方法制備，即得； (5)色譜條件:色譜柱GraceSmartRP18 (5 μ m, 4.6mmX 250mm);流動相:乙腈和濃度為.0.1%的磷酸水溶液的混合物,其中乙腈占流動相體積的32%:;檢測波長:280nm ;柱溫40°C;流速 0.8ml/min ； (6)測定:分別精密吸取步驟(1)所得的供試品溶液和步驟(2)所得的對照品溶液、步驟(3)所得的藥材溶液、步驟(4)所得的陰性對照溶液各20μ I注入步驟(5)所限條件的液相色譜儀，照高效液相色譜法`測定，得HPLC特征圖譜。
【文檔編號】G01N30/02GK103675146SQ201310699362
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】徐云, 徐建, 白冰, 付成國, 王婷婷, 徐國強, 任晶, 趙俞 申請人:吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司