檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接elisa試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，包括包被酶標(biāo)板、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、顯色液和終止液，包被酶標(biāo)板以重組蛋白Nh作為包被抗原。研究及實(shí)踐證明，本發(fā)明具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡單等特點(diǎn)，易于大范圍推廣使用，具有廣闊的市場(chǎng)前景，可用于流行性腹瀉感染情況的血清學(xué)調(diào)查、抗體監(jiān)測(cè)及疫苗免疫效果的評(píng)估等方面。
【專利說明】檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于ELISA試劑盒【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬流行性腹灣(porcine epidemic diarrhea, PED)由冠狀病毒科的豬流行性腹灣病毒(porcine epidemic diarrhoea virus, PEDV)引起，以發(fā)病豬腹灣、嘔吐、脫水以及哺乳仔豬高致死率為主要特征。該病主要危害哺乳仔豬，2-7日齡仔豬感染率高，主要表現(xiàn)為腹瀉、脫水、嘔吐、精神沉郁。10日齡以內(nèi)仔豬感染出現(xiàn)腹瀉2?4天后，大量死亡，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在上世紀(jì)八、九十年代，歐洲的許多國家，包括英國、荷蘭、法國、t匕利時(shí)、德國和瑞士都有PED的流行。近年來，PEDV在歐洲的流行越來越少；與之相反，在亞洲的許多國家，包括中國、韓國、日本、菲律賓和泰國，PEDV的流行及嚴(yán)重程度遠(yuǎn)大于歐洲。目前，PED已成為我國養(yǎng)豬業(yè)重要的腹瀉病之一。鑒于該病主要危害仔豬，發(fā)病仔豬迅速大量脫水衰竭而死，目前緊急的藥物治療只能減輕或減緩腹瀉癥狀，給仔豬免疫也由于抗體產(chǎn)生時(shí)間較慢達(dá)不到免疫保護(hù)效果，唯有足夠高的母源抗體仔豬提供免疫保護(hù)力，可大大降低仔豬發(fā)病死亡的風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)母豬進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒的抗體水平檢測(cè)具有十分重要的意義。
[0003]由于PEDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)在較長一段時(shí)間內(nèi)未獲成功，應(yīng)用于PED及其抗體檢測(cè)的診斷試劑制備受到了一定的制約。目前，國內(nèi)雖有部分廠家生產(chǎn)了商品化的流行性腹瀉病毒試劑盒，但是大多數(shù)主要以全病毒制備的抗原或抗體為主。制備全病毒抗原存在潛在排散危險(xiǎn)，且全病毒大多是以CV777株弱毒株制備，大部分研究表明我國當(dāng)前流行毒株基因序列與CV777株差異較大，其檢測(cè)效果有待進(jìn)一步分析評(píng)估。因而，急需一種針對(duì)流行毒株的更加安全且易于制備的新型診斷試劑的研制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，用于豬群豬流行性腹瀉病毒抗體水平的檢測(cè)，以判斷豬群豬流行性腹瀉病毒的感染情況和監(jiān)測(cè)免疫效果等。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，包括包被酶標(biāo)板、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、顯色液和終止液，包被酶標(biāo)板以重組蛋白Nh作為包被抗原。
[0006]重組蛋白Nh具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列的基因編碼。
[0007]包被酶標(biāo)板每孔包被重組蛋白Nhl μ g，包被緩沖液采用pH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液，并用5%的脫脂奶粉作為封閉液進(jìn)行封閉。
[0008]陰性對(duì)照血清和陽性對(duì)照血清各2mL ;酶標(biāo)二抗為60mL,由美國Earthox公司生產(chǎn)的山羊抗豬IgG稀釋8000倍而得；濃縮洗滌液為IOX洗滌液，為含0.5%吐溫-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ;樣品稀釋液為含有0.2%牛血清白蛋白和
0.01%疊氮鈉pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL,以稀釋被檢血清和酶標(biāo)二抗；顯色液包括顯色液A和顯色液B，顯色液A:稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，溶于IOOmL的無水乙醇中，雙蒸水定容至IOOOmL ;顯色液B:稱取檸檬酸21g、無水磷酸鈉28.2g，量取0.75%過氧化氫尿素6.4mL,雙蒸水定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)PH值為4.5-5.0。顯色液A和顯色液B均為60mL ；終止液為2M的H2SO4溶液，共30mL。
[0009]重組蛋白Nh按以下操作制備:以豬流行性腹瀉病毒流行毒株為材料，通過RT-PCR擴(kuò)增N基因內(nèi)部主要親水區(qū)序列135-319位氨基酸，并獲得重組質(zhì)粒pMD-Nh ;再將Nh片段亞克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)中獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Nh ;將原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Nh轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主表達(dá)菌BL-21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白Nh ;利用Ni2+親和層析法純化獲到具有生物學(xué)活性的重組蛋白Nh。
[0010]間接ELISA具有操作簡單、特異性及穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前在臨床上廣泛應(yīng)用于各種細(xì)菌、病毒及寄生蟲等病原抗體水平的檢測(cè)。發(fā)明人依據(jù)間接ELISA的原理，建立了預(yù)包被有重組蛋白Nh的酶標(biāo)板的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒:首先，通過篩選抗原性強(qiáng)且保守的豬流行性腹瀉核衣殼蛋白，擴(kuò)增和克隆基因；然后構(gòu)建原核表達(dá)載體，原核表達(dá)融合蛋白；接著通過Western blotting進(jìn)行抗原性分析,篩選表達(dá)量高、抗原性較好的重組蛋白抗原進(jìn)行純化作為包被抗原，最終獲得了靈敏度較高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的間接ELISA試劑盒。
[0011]應(yīng)用本發(fā)明對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒陽性血清、豬圓環(huán)病毒2型陽性血清、口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、偽狂犬病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，說明該試劑盒具有很好的特異性，所用的診斷抗原與其他病原抗體之間無交叉反應(yīng)；血清吸附試驗(yàn)及競爭性抑制試驗(yàn)結(jié)果均表明以本發(fā)明為基礎(chǔ)建立的ELISA方法具有較好的特異性。本發(fā)明在廣西部分城市豬流行性腹瀉病毒抗體的檢測(cè)實(shí)踐中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，其具有特異性強(qiáng)、敏感度高、操作簡單等特點(diǎn)，易于大范圍推廣使用，具有廣闊的市場(chǎng)前景，可用于流行性腹瀉感染情況的血清學(xué)調(diào)查、抗體監(jiān)測(cè)及疫苗免疫效果的評(píng)估等方面。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是豬流行性腹瀉病毒N基因(編碼核衣殼蛋白)擴(kuò)增的電泳圖，圖中:泳道1、2 為 N 基因，泳道 M 為 DNA Marker DL2000。
[0013]圖2是Nh序列(擴(kuò)增核衣殼蛋白內(nèi)部主要親水區(qū)序列)擴(kuò)增的電泳圖，圖中:泳道
1、2為 Nh，泳道 M 為 DNA Marker DL2000。
[0014]圖3是Nh基因插入原核表達(dá)載體pET32a ( + )中得到的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a_Nh的酶切鑒定圖，圖中:泳道1-4為重組質(zhì)粒pET32a-Nh的雙酶切片段，泳道Ml為DNA MarkerDL2000，泳道 M2 為 IKb Ladder。
[0015]圖4是重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖，圖中:泳道I為PET32a空載體誘導(dǎo)菌體蛋白，泳道2為Nh未誘導(dǎo)菌體蛋白，泳道3為Nh誘導(dǎo)菌體蛋白，泳道M為預(yù)染蛋白質(zhì) Marker0[0016]圖5是重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析圖，圖中:泳道I為純化后蛋白Nh,泳道2為Nh誘導(dǎo)菌體蛋白，泳道3為pET32a-BL21 (DE3)菌體誘導(dǎo)蛋白，泳道M為預(yù)染蛋白Marker
[0017]圖6是純化后的重組蛋白Nh的抗原性鑒定圖(一抗采用豬流行性腹瀉病毒陽性豬血清)，圖中:泳道I為純化后的重組蛋白Nh (用以作為豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒的包被抗原)，泳道M為預(yù)染分子量蛋白Marker。
[0018]圖7是N蛋白DNAStar-Protean軟件分析圖，圖中:N蛋白序列兩箭頭中間為本試驗(yàn)選擇的Nh蛋白序列。
【具體實(shí)施方式】
[0019]1.Nh序列的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0020]參考楊敏(碩士學(xué)位論文，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006)設(shè)計(jì)的N基因引物擴(kuò)增擴(kuò)增豬流行性腹瀉核衣殼蛋白基因，擴(kuò)增N基的上游引物為:5’ -CCGAGTGCGGTTCTCACAGAT-3’(序列表 SEQ.1D.N0.4)，下游引物為:5’ -CATAGCCAGGATAAGCCGGTC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.5);以豬流行性腹瀉病毒廣西流行毒株為模板PCR擴(kuò)增N基因(圖1，序列表SEQ.1D.N0.3)。PCR反應(yīng)體系為 10 X PCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L, Ex-Taq 聚合酶(5U/ μ L) 0.25 μ L,上下游引物Ν1/Ν2 (25ρπιο1/μ L)各0.5μ L，以無菌ddH20加至25μ L。PCR反應(yīng)程序95°C 5min ；94°C lmin、48°C lmin、72°C lmin30s，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T中獲得克隆質(zhì)粒pMD-N。再設(shè)計(jì)一對(duì)添加酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增 Nb 基因片段的上游引物為:5’ CGC GGATCC GTTGAACCTAACACA-3’(序列表 SEQ.1D.N0.6)；下游引物為:5’ -CCG CTCGAG GTAGCCTGAGGCATC-3’(序列表 SEQ.1D.N0.7);PCR 擴(kuò)增保守且抗原性較強(qiáng)的N蛋白內(nèi)部主要親水區(qū)序列，即Nh (圖2，序列表SEQ.1D.N0.2)。PCR體系為10XPCR Buffer2.5 μ L, dNTPs (IOmM) 0.25 μ L，Ex-Taq 聚合酶(5U/μ L) 0.25 μ L，上下游引物Nhl/Nh2 (25pmol/y L)各0.5μ L，以無菌ddH20加至25μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min，4°C保存。目的基因回收并克隆至PMD-18T中獲得克隆質(zhì)粒pMD-Nh，經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切以及測(cè)序鑒定正確后再將Nh基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，經(jīng)BamH I和Xho I雙酶切以及測(cè)序鑒定正確得到原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Nh (圖3)。
[0021]2.1PTG誘導(dǎo)表達(dá)
[0022]將原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a_Nh轉(zhuǎn)入到宿主表達(dá)菌BL21(DE3)中，將陽性菌株接種于新鮮含有AMP (100μ g/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)，待0D600達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG (終濃度1.0mM), 28°C誘導(dǎo)8h，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot鑒定，結(jié)果表明重組蛋白Nh得到高效表達(dá)(圖4和圖5，序列表SEQ.1D.N0.1)。收集表達(dá)菌株，凍融數(shù)次并進(jìn)行超聲波破碎，離心后分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明重組蛋白Nh為大部分可溶性表達(dá)。用豬流行性腹瀉病毒陽性血清作為一抗，二抗用山羊抗豬IgG抗體，對(duì)重組蛋白的抗原性進(jìn)行分析，結(jié)果表明重組蛋白Nh具有良好的抗原性。
[0023]3.重組蛋白的純化
[0024]因重組蛋白Nh融合有多聚組氨酸(6XHis)標(biāo)簽，故采用Ni2+親和層析的方法純化重組蛋白Nh。經(jīng)鑒定重組蛋白Nh為大部分可溶性表達(dá)，故取可溶性上清液過N1-NTA，通過改變緩沖液的PH值來洗去雜蛋白，純化目的蛋白。純化后得到大小為39kDa，條帶單一的目的蛋白，對(duì)純化后的重組蛋白Nh復(fù)性后進(jìn)行Western-blot分析其抗原性，結(jié)果表明純化后的重組蛋白Nh具有良好的抗原性(圖6)。
[0025]4.包被液、洗滌液、稀釋液的配制
[0026]包被液為ρΗ9.6 的 0.05Μ 碳酸鹽緩沖液(Na2CO30.159g，NaHCO30.293g，加滅菌ddH20至1OOmL) ； 10 X洗滌液為含0.5%吐溫-20的0.1M的PBS溶液(pH7.2-7.4);樣品稀釋液為含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%疊氮鈉的0.01M的PBS溶液(pH7.2-7.4)。
[0027]5.顯色液及終止液的配制
[0028]顯色液A:稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，溶于1OOmL的無水乙醇中，雙蒸水定容至1000mL ;顯色液B:稱取檸檬酸21g、無水磷酸鈉28.2g，量取0.75%過氧化氫尿素6.4mL，雙蒸水定容至1000mL,調(diào)節(jié)PH值為4.5-5.0。顯色液A和顯色液B均為60mL。終止液:終止液為2M H2SO4，將11.1mL的濃硫酸緩慢加入水中稀釋，并定容至100mL。
[0029]6.ELISA反應(yīng)條件的確定
[0030]最佳包被濃度和最佳二抗稀釋度的確定。采用方正試驗(yàn)，分別將包被抗原進(jìn)行1:10，1:20, 1:40, 1:80, 1:160 和 1:320 稀釋，酶標(biāo)二抗進(jìn)行 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000和1:16000稀釋，組成方正進(jìn)行ELISA。最終確定最佳抗原包被量為1 μ g，酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1:8000。并對(duì)最佳包被條件、最佳封閉液及封閉條件、待檢血清稀釋倍數(shù)、血清孵育時(shí)間、二抗作用時(shí)間以及底物顯色時(shí)間等作了逐一優(yōu)化，最終確定本研究的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA的最佳反應(yīng)條件為:最佳包被抗原量為1 μ g，37°C濕盒包被2h ；5%的脫脂奶粉，37°C封閉2h ;待檢血清稀釋80倍，37°C孵育Ih ;二抗稀釋度為1:8000，37°C反應(yīng)1h ;底物顯色條件為TMB底物室溫避光顯色I(xiàn)Omin。
[0031]7.豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA陰陽性臨界值的確定
[0032]收集20份豬流行性腹瀉病毒陰性豬血清，用優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件檢測(cè)這20份豬流行性腹瀉病毒陰性血清的OD45tl值。經(jīng)計(jì)算20份陰性血清的0D450值的平均值為0.211，標(biāo)準(zhǔn)差為0.049，所以陰陽性臨界值=陰性血清樣本的平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差=0.211+3X0.049=0.358。故將陰陽性臨界值定為0.358，為了判定方便，把臨界值定為
0.36。即在已優(yōu)化好的ELISA反應(yīng)條件下，P/N值≥2.1，待檢血清樣本0D450值≥0.36即判定為陽性，反之為陰性。
[0033]8.豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA檢測(cè)試劑盒組成:
[0034]1) ELISA板(預(yù)包被重組蛋白Nh):5塊
[0035]2) 10X濃縮洗滌液，規(guī)格為200mL ；
[0036]3)樣品稀釋液，規(guī)格為1OOmL ；
[0037]4)羊抗豬酶標(biāo)二抗(酶標(biāo)抗體)，美國Earthox公司生產(chǎn)的山羊抗豬IgG稀釋8000倍而得，規(guī)格為60mL;
[0038]5 )顯色液A，規(guī)格為60mL ；
[0039]6)顯色液B，規(guī)格為60mL ；
[0040]7 )終止液為2M的H2SO4溶液，規(guī)格為30mL ；
[0041]8)豬流行性腹瀉陰陽性對(duì)照血清各2mL。
[0042]9.豬流行性腹瀉病毒抗體間接ELISA操作步驟:[0043]I)在稀釋板中將待檢血清及陰陽性對(duì)照血清用樣品稀釋液進(jìn)行80倍稀釋，混勻后取100 μ L加入到酶標(biāo)板中，37°C孵育2h ;傾去酶標(biāo)板內(nèi)液體，加入300 μ L洗滌液洗滌3-5次，每次3min，最后一次拍干；加入酶標(biāo)抗體100μ L，37°C孵育Ih ;傾去酶標(biāo)板內(nèi)液體，加入300 μ L洗滌液洗滌3-5次，每次3min，最后一次拍干；依次加入顯色液A和顯色液B各50 μ L，室溫避光顯色I(xiàn)Omin ;加入終止液50 μ L終止顯色，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD45tl值，并根據(jù)OD值判定結(jié)果。
[0044]2 )結(jié)果判定:當(dāng)陽性對(duì)照的OD45tl值與陰性對(duì)照的OD45tl值的比(Ρ/Ν值)≥2.1，待檢血清樣本OD45tl值> 0.36即判定為陽性，反之為陰性。
[0045]10.臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果
[0046]用該試劑盒對(duì)2012年8月至2013年5月收集的來自廣西南寧、貴港、防城港玉林、桂平、柳州6市12個(gè)豬場(chǎng)的704份豬血清樣品的檢測(cè)結(jié)果如表3-13。
[0047]來自不同豬場(chǎng)的血清樣品陽性率各不相同，從31.4%~92.9%。其中，柳州4場(chǎng)的PEDV血清陽性率最低，為31.4% ;其余的11個(gè)豬場(chǎng)，血清陽性率均高于50%。臨床樣品采自哺乳仔豬、保育豬、育肥豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬、種公豬等，其中，來自南寧某場(chǎng)的126份種豬血清在采血前一個(gè)月免疫過豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活苗(利力佳，成都天邦)，該場(chǎng)血清陽性率最高，為92.9%。
[0048]表1臨床血清樣品的檢測(cè)結(jié)果
[0049]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，包括包被酶標(biāo)板、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清、酶標(biāo)二抗、濃縮洗滌液、樣品稀釋液、顯色液和終止液，其特征在于:所述包被酶標(biāo)板以重組蛋白Nh作為包被抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述重組蛋白Nh具有序列表SEQ.1D.N0.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.1D.N0.2的喊基序列的基因編碼。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述包被酶標(biāo)板每孔包被重組蛋白Nhl μ g，包被緩沖液采用pH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液，并用5%的脫脂奶粉作為封閉液進(jìn)行封閉。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于:所述陰性對(duì)照血清和陽性對(duì)照血清各2mL ； 所述酶標(biāo)二抗為60mL，由美國Earthox公司生產(chǎn)的山羊抗豬IgG稀釋8000倍而得； 所述濃縮洗滌液為10 X洗滌液，為含0.5%吐溫-20pH7.2-7.4的0.1M的PBS溶液，共200mL ； 所述樣品稀釋液為含有0.2%牛血清白蛋白和0.01%疊氮鈉pH7.2-7.4的0.0lM的PBS溶液，共IOOmL ； 所述顯色液包括顯色液A和顯色液B，顯色液A:稱取200mg四甲基聯(lián)苯胺，溶于IOOmL的無水乙醇中，雙蒸水定容至IOOOmL ;顯色液B:稱取檸檬酸21g、無水磷酸鈉28.2g，量取0.75%過氧化氫尿素6.4mL，雙蒸水定容至IOOOmL,調(diào)節(jié)PH值為4.5-5.0。顯色液A和顯色液B均為60mL ； 所述終止液為2M的H2SO4溶液，共30mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于所述重組蛋白Nh按以下操作制備:以豬流行性腹瀉病毒流行毒株為材料，通過RT-PCR擴(kuò)增N基因內(nèi)部主要親水區(qū)序列135-319位氨基酸，并獲得重組質(zhì)粒pMD-Nh ;再將Nh片段亞克隆到表達(dá)載體pET-32a(+)中獲得原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Nh ;將原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a_Nh轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主表達(dá)菌BL-21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白Nh ;利用Ni2+親和層析法純化獲到具有生物學(xué)活性的重組蛋白Nh。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103675274SQ201310701145
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】黃偉堅(jiān), 郭旋, 龍鳳 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)