一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法，步驟包括：制備特定粒徑納米金粒子的免疫原，將免疫原注射到動物體內(nèi)，制得高特異性抗體，用吸光度法測定特定粒徑納米金粒子含量，將抗抗體酶標記制得酶標二抗體，用間接競爭酶聯(lián)免疫法將標準樣品與待測樣競爭與抗體的反應，酶標二抗體的酶促使底物液發(fā)光，測得吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。本發(fā)明中特定粒徑納米金粒子抗體的特異性強，交叉反應較少，因此其選擇性很高，從而簡化了樣品前處理過程。
【專利說明】一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]納米材料被認為是21世紀的新材料。納米結(jié)構(gòu)材料指其基本組成顆粒尺寸為納米數(shù)量級，處于原子簇和宏觀物體交接區(qū)域內(nèi)的粒子，顆粒直徑一般為I?IOOnm之間，微粒可以是晶體，亦可以是非晶體。納米結(jié)構(gòu)材料具有一系列新異的物理、機械、電子、磁學、光學及化學特性。納米金為直徑0.8?250nm的締合膠體，具有納米表面效應、量子效應和宏觀量子隧道效應，抗氧化性強，生物相容性好，密度高和光電性能優(yōu)異等，被廣泛用于催化、生物、光電子學、信息存儲等領(lǐng)域。如今，隨著納米技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化，各種形式的納米尺度的物質(zhì)已經(jīng)以各種不同的途徑進入我們的生活。比如，在藥物化學、藥劑學等領(lǐng)域，一些納米物質(zhì)以其特殊的化學結(jié)構(gòu)、表面性質(zhì)和微小粒徑，成為新型藥物載體，而出于醫(yī)學目的，這些顆粒有可能會直接被注射進入人體內(nèi)；或在生產(chǎn)、使用、廢棄過程中，納米材料必然會通過各種途徑以“三廢”形式進入環(huán)境，并造成一定的生態(tài)效應和人群暴露；也或通過大氣環(huán)境、食物鏈進入人體，如吸入，攝取以及皮膚途徑?？傊藗冊诠ぷ骱蜕钪薪佑|到納米材料的機會越來越多，引起人們對其負面生物效應的關(guān)注。因此能監(jiān)測納米金在日常生活和藥物領(lǐng)域中的應用，將其用量控制在安全范圍內(nèi)，就會顯得尤為重要。
[0003]目前，對納米金的痕量檢測方法少之又少，有文獻報導使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)對納米金進行痕量檢測，通過將固態(tài)的納米金變成金原子，再將金原子氧化成金離子，最后通過質(zhì)譜分析檢測金離子的信號，從而實現(xiàn)對納米材料的定量檢測。ICP-MS方法成本高，儀器昂貴，并且需要專門的實驗人員，樣品前處理復雜，特異性差等缺點。并且ICP-MS只能用于檢測使用1%HC1 (v/v)制備得到的納米金樣品，對于納米金常用合成方法1%檸檬酸鈉還原氯金酸制備得到的納米金樣品的檢測回收率只有10%-40%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法，本發(fā)明測試方法成本低，操作簡便，特異性選擇性高，樣品前處理簡單等優(yōu)點，同時可以根據(jù)粒子粒徑幫助判斷納米金粒子的來源。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法，步驟包括:
[0007]a、制備特定粒徑納米金粒子的免疫原；
[0008]b、將免疫原注射到動物體內(nèi)，制得高特異性抗體；
[0009]C、用吸光度法測定特定粒徑納米金粒子含量，將抗抗體酶標記制得酶標二抗體，用間接競爭酶聯(lián)免疫法將標準樣品與待測樣競爭與抗體的反應，酶標二抗體的酶促使底物液發(fā)光，測得吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。[0010]所述步驟a中特定粒徑納米金粒子的免疫原的制備方法為:
[0011 ] 在攬祥下將疏基乙fe (TGA )溶液加入到特定粒徑納米金粒子溶液中，在攬祥15-20min后調(diào)節(jié)溶液在弱酸條件下，分別加入1-乙基_3_ (3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶液，室溫避光下攪拌3_4h，然后再調(diào)節(jié)pH9?10,加入牛血清白蛋白(BSA, sigma公司),4°C下攪拌5_6h后,將反應液裝入透析袋,用蒸懼水透析12h以上，避光低溫保存。
[0012]所述弱酸條件為PH=5.5 ;所述避光低溫保存溫度為4°C ；
[0013]所述巰基乙酸溶液濃度為0.001mol/L,特定粒徑納米金粒子溶液濃度0.4?
0.6 μ g/mL, EDAC 溶液濃度為 0.2mol/L, NHS 溶液濃度為 0.05mol/L, BSA 濃度為 10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物質(zhì)的量比1:4:2 ;納米金粒子、TGA和BSA的質(zhì)量比為1:1:2000 ；
[0014]所述步驟b中高特異性抗體的制備方法為:
[0015]將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對動物進行多次免疫，制得特定粒徑納米金粒子高特異性抗體。
[0016]所述多次免疫方法為:第一次動物免疫將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，免疫三周后，進行五次加強免疫，加強免疫是將免疫抗原與弗氏不完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，五次加強免疫免疫間隔為兩周，經(jīng)五次加強免疫后，從動物心臟采血，血清室溫20-25°C靜置0.5-lh,在冰箱4°C靜置2h后吸取上層澄清的血清，制得高特異性抗體。
[0017]所述弗氏佐劑制備方法為:將液體石蠟和羊毛脂按2:1體積比用超聲清洗器超聲3小時左右，使之完全混勻，制得不完全弗氏佐劑，臨用前加殺死的卡介苗即為完全弗氏佐劑。
[0018]所述步驟c中吸光度法具體為:
[0019]包被:在酶標板中加入5 μ g/mL的包被抗原，100 μ L/孔，8組，每組3孔，37°C溫育l-3h，或4°C過夜12h，PBST洗滌3次，包被抗原所用稀釋液為包被液CB ;所述包被抗原的制備方法基本同免疫原的制備方法，不同處在于使用雞卵白蛋白(OVA，sigma公司)代替BSA ；
[0020]封閉:加10mg/mL 的 OVA 溶液，200 μ I/ 孔，37°C溫育 15_60min，PBST 洗滌 3 次；
[0021]競爭:加入50 μ I/孔不同濃度特定粒徑納米金粒子溶液，分別加入濃度為30 μ g/mL抗體，50 μ I/孔，37°C溫育2_4h，PBST洗滌3次；
[0022]加酶:加入100 μ I/孔稀釋度為1:500酶標二抗體溶液，37°C溫育2_4h，PBST洗滌3次；
[0023]顯色:加入處理后的底物液100 μ L/孔，37°C溫育溫育15_60min ;底物液處理方法為:在加處理后的底物液前15-30min向底物液原液加入0PD，加入量為IOmL底物液原液中加入4mgOPD，加處理后的底物液前3-5min向底物液原液加入質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2，加入量為底物液原液體積分數(shù)的0.15% ；
[0024]檢測:加入終止液50 μ L/孔，測定吸光度值，繪制標準曲線；
[0025]將待測樣用同樣方法測定吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。
[0026]酶聯(lián)免疫方法(Elisa)有成本低，操作簡便，特異性選擇性高，樣品前處理簡單等優(yōu)點，并且適用于各種方法制備的納米金粒子。將其制成試劑盒，使其操作更加簡單方便，更加有利于此方法的商業(yè)應用。本發(fā)明在多功能酶標儀上應用，操作簡便，能進行高通量快速化的樣品檢測，真正實現(xiàn)了對環(huán)境水樣，醫(yī)藥樣品，化妝品等樣品中特定粒徑納米金粒子含量的痕量檢測。
[0027]本發(fā)明中特定粒徑納米金粒子抗體的特異性強，交叉反應較少，因此其選擇性很高，從而簡化了樣品前處理過程。本發(fā)明最低檢測限(3 σ )是0.01ng/mL，靈敏度為0.0lng/
mLo
【具體實施方式】
[0028]實施例1
[0029]1.16nm金粒子全抗原的合成
[0030]I)納米金的合成
[0031]取0.01%的氯金酸溶液IOOmL加熱至沸騰，攪動下迅速加入1%檸檬酸三鈉水溶液5mL，溶液的顏色迅速地變成黑色，在I分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，隨著加熱時間的增長，直到溶液出現(xiàn)透明的酒紅色，約需7-10分鐘左右。待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)回流沸騰15分鐘，撤熱源持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，所得液體為16nm金溶膠，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0032]2)納米金免疫原(GNP-BSA)的制備
[0033]在攪拌下將巰基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力攪拌20min后調(diào)節(jié)溶液在弱酸條件下，分別加入EDAC和NHS溶液，室溫避光下攪拌3h，然后再調(diào)節(jié)pH9?10，力口入BSA，4°C下攪拌5h后，將反應液裝入透析袋，用蒸餾水透析12h，避光保存在冰箱內(nèi)。
[0034]所述弱酸條件為PH=5.5 ;所述避光低溫保存溫度為4°C ；
[0035]所述巰基乙酸溶液濃度為0.001mol/L,特定粒徑納米金粒子溶液濃度為0.5 μ g/mL, EDAC 溶液濃度為 0.2mol/L, NHS 溶液濃度為 0.05mol/L, BSA 濃度為 10mg/mL，TGA, EDAC和NHS的物質(zhì)的量比1:4:2 ;納米金粒子、TGA和BSA的質(zhì)量比為1:1:2000 ；
[0036]3)納米金包被抗原(GNP-OVA)的制備
[0037]包被抗原的制備方法基本同免疫原的制備方法，不同處在于使用OVA代替BSA ；
[0038]2.16nm金粒子抗體的制備
[0039]I)福氏佐劑的制備
[0040]將液體石蠟和羊毛脂按2:1體積比用超聲清洗器超聲3小時左右，使之完全混勻，即滴一滴乳化劑到冰水混合液中半分鐘之內(nèi)不擴散才能算混合完全。此乳化劑稱之為不完全佐劑。不完全佐劑低溫(0-4°C )貯存，臨用前加殺死的卡介苗即為完全佐劑。
[0041]2)抗體的制備方法
[0042]將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對三只新西蘭大白兔進行多次免疫，第一次免疫將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，免疫三周后，進行五次加強免疫，加強免疫是將免疫抗原與弗氏不完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，五次加強免疫免疫間隔為兩周，經(jīng)五次加強免疫后，從大白兔心臟采血，血清室溫25°C靜置lh，在冰箱4°C靜置2h后吸取上層澄清的血清，制得兔抗16nm金納米粒子抗體。
[0043]3.吸光度法測定特定粒徑納米金粒子含量
[0044]包被:在酶標板中加入5 μ g/mL的包被抗原，100 μ L/孔，8組，每組3孔，37°C溫育2h，PBST洗滌3次，包被抗原所用稀釋液為包被液CB ；[0045]封閉:加入10mg/mL 的 OVA 溶液，200 μ L/ 孔，37°C溫育 40min，PBST 洗滌 3 次；
[0046]競爭:加入50 μ I/ 孔濃度分別為 0.01，0.02，0.1, 0.2，I, 2，10，20，100ng/mL16nm金粒子溶液，分別加入濃度為30 μ g/mL抗體，50 μ L/孔，37°C溫育4h，PBST洗滌3次；
[0047]加酶:加入100 μ L/孔稀釋度為1:500酶標羊抗兔抗抗體溶液，37°C溫育3h，PBST洗漆3次；
[0048]顯色:加入處理后的底物液100 μ L/孔，37°C溫育溫育40min ;底物液處理方法為:在加處理后的底物液前25min向底物液原液加入0PD，加入量為IOmL底物液原液中加入4mgOPD，加處理后的底物液前5min向底物液原液加入質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2，加入量為底物液原液體積分數(shù)的0.15% ；
[0049]檢測:加入終止液50 μ L/孔，測定吸光度值，繪制標準曲線；
[0050]將待測樣用同樣方法測定吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。
[0051]標準曲線的線性方程:
[0052]A=0.89332-0.222431ogC (A—吸光度值，C一待測液濃度)
[0053]R2=0.985
[0054]實施例中:
[0055]氯金酸(HAuCl4.4H20)，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7).2H20，巰基乙酸(99%，C2H4O2S)和N-羥基琥珀酰亞胺(98%，C4H5NO3) (NHS)均購買于國藥集團化學試劑有限公司；
[0056]1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(98.5%, C8H17N3.HCl) (EDAC)購買于阿拉丁試劑公司；
[0057]液體石臘(上海試劑有限公司)；
[0058]羊毛脂(國藥集團化學試劑有限公司)；
[0059]液體卡介苗(新蕪區(qū)醫(yī)院)；
[0060]酶標羊抗兔抗抗體(購于合肥博美生物科技有限責任公司)；
[0061]包被液CB (碳酸鈉緩沖液，0.05mol/L, pH=9.6 ；Na2C030.0 7 9 5g, NaHCO30.147g 溶于蒸餾水，定容到50ml)，
[0062]洗滌液PBST (磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L,加體積分數(shù)0.05%吐溫)，
[0063]底物液原液(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH=5 ;檸檬酸0.5106g, Na2HPO4.12H201.8408g 溶于蒸餾水，定容到 50mL)
[0064]H2O2 (質(zhì)量分數(shù)為30%，實驗加底物液前3—5min加入底物液中，加入量為底物液體積分數(shù)的0.15%)
[0065]OPD (鄰苯二胺，實驗加底物液前15-30min前加入底物液中，IOmL底物液中加入4mgOPD)
[0066]終止液(硫酸溶液，2mol/L)
[0067]實驗試劑都為分析純，實驗用水為三蒸去離子水。
[0068]實施例2
[0069]1.16nm金粒子全抗原的合成
[0070]I)納米金的合成
[0071]取0.01%的氯金酸溶液IOOmL加熱至沸騰，攪動下迅速加入1%檸檬酸三鈉水溶液5mL，溶液的顏色迅速地變成黑色，在I分鐘內(nèi)變?yōu)樽霞t色，隨著加熱時間的增長，直到溶液出現(xiàn)透明的酒紅色，約需7-10分鐘左右。待顏色穩(wěn)定后繼續(xù)回流沸騰15分鐘，撤熱源持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，所得液體為16nm金溶膠，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072]2)納米金免疫原(GNP-BSA)的制備
[0073]在攪拌下將巰基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力攪拌20min后調(diào)節(jié)溶液在弱酸條件下，分別加入EDAC和NHS溶液，室溫避光下攪拌3h，然后再調(diào)節(jié)pH9?10，力口入BSA，4°C下攪拌5h后，將反應液裝入透析袋，用蒸餾水透析12h，避光保存在冰箱內(nèi)。
[0074]所述弱酸條件為PH=5.5 ;所述避光低溫保存溫度為4°C ；
[0075]所述巰基乙酸溶液濃度為0.001mol/L,特定粒徑納米金粒子溶液濃度為0.5 μ g/mL, EDAC 溶液濃度為 0.2mol/L, NHS 溶液濃度為 0.05mol/L, BSA 濃度為 10mg/mL，TGA, EDAC和NHS的物質(zhì)的量比1:4:2 ;納米金粒子、TGA和BSA的質(zhì)量比為1:1:2000 ；
[0076]4)納米金包被抗原(GNP-OVA)的制備
[0077]包被抗原的制備方法基本同免疫原的制備方法，不同處在于使用OVA代替BSA ；
[0078]2.16nm金粒子抗體的制備
[0079]I)福氏佐劑的制備
[0080]將液體石蠟和羊毛脂按2:1體積比用超聲清洗器超聲3小時左右，使之完全混勻，即滴一滴乳化劑到冰水混合液中半分鐘之內(nèi)不擴散才能算混合完全。此乳化劑稱之為不完全佐劑。不完全佐劑低溫(0-4°C )貯存，臨用前加殺死的卡介苗即為完全佐劑。
[0081]2)抗體的制備方法
[0082]將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對三只新西蘭大白兔進行多次免疫，第一次免疫將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，免疫三周后，進行五次加強免疫，加強免疫是將免疫抗原與弗氏不完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，五次加強免疫免疫間隔為兩周，經(jīng)五次加強免疫后，從大白兔心臟采血，血清室溫20°C靜置0.5h，在冰箱4°C靜置2h后吸取上層澄清的血清，制得兔抗16nm金納米粒子抗體。
[0083]3.吸光度法測定特定粒徑納米金粒子含量
[0084]包被:在酶標板中加入5 μ g/mL的包被抗原，100 μ L/孔，8組，每組3孔，37°C溫育3h，PBST洗滌3次，包被抗原所用稀釋液為包被液CB ；
[0085]封閉:加10mg/mL 的 OVA 溶液，200 μ L/ 孔，37°C溫育 20min, PBST 洗滌 3 次；
[0086]競爭:加入50 μ L/ 孔濃度分別為 0.01，0.02，0.1, 0.2，I, 2，10，20，100ng/mL16nm金粒子溶液，加入濃度為30 μ g/mL抗體，50 μ I/孔，37°C溫育2h，PBST洗滌3次；
[0087]加酶:加入100 μ L/孔稀釋度為1:500酶標羊抗兔抗抗體溶液，37°C溫育4h，PBST洗漆3次；
[0088]顯色:加入處理后的底物液100 μ L/孔，37°C溫育溫育60min ;底物液處理方法為:在加處理后的底物液前15min向底物液原液加入0PD，加入量為IOmL底物液原液中加入4mgOPD，加處理后的底物液前3min向底物液原液加入質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2，加入量為底物液原液體積分數(shù)的0.15% ；
[0089]檢測:加入終止液50 μ L/孔，測定吸光度值，繪制標準曲線；
[0090]將待測樣用同樣方法測定吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。
[0091]標準曲線的線性方程:[0092]A=0.92128-0.139761ogC (A—吸光度值，C一待測液濃度)
[0093]R2=0.988
[0094]實施例中:
[0095]氯金酸(HAuCl4.4H20)，檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7).2H20，巰基乙酸(99%，C2H4O2S)和N-羥基琥珀酰亞胺(98%，C4H5NO3) (NHS)均購買于國藥集團化學試劑有限公司；
[0096]1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(98.5%, C8H17N3.HCl) (EDAC)購買于阿拉丁試劑公司；
[0097]液體石臘(上海試劑有限公司)；
[0098]羊毛脂(國藥集團化學試劑有限公司)；
[0099]液體卡介苗(新蕪區(qū)醫(yī)院)；
[0100]酶標羊抗兔抗抗體(購于合肥博美生物科技有限責任公司)；
[0101]包被液CB (碳酸鈉緩沖液，0.05mol/L, pH=9.6 ；Na2C030.0 7 9 5g, NaHCO30.147g 溶于蒸懼水，定容到50mL)；
[0102]洗滌液PBST (磷酸鹽緩沖液，0.01mol/L,加體積分數(shù)0.05%吐溫)；
[0103]底物液原液(檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，pH=5 ;檸檬酸
0.5106g, Na2HPO4.Iffi2Ol.8408g 溶于蒸餾水，定容到 50mL)；
[0104]H2O2 (質(zhì)量分數(shù)為30%，實驗加底物液前3—5min加入底物液中，加入量為底物液體積分數(shù)的0.15%)；
[0105]OPD (鄰苯二胺，實驗加底物液前15-30min前加入底物液中，IOml底物液中加入4mgOPD)；
[0106]終止液(硫酸溶液，2mol/L)；
[0107]實驗試劑都為分析純，實驗用水為三蒸去離子水。
【權(quán)利要求】
1.一種測試痕量特定粒徑納米金粒子的方法，步驟包括: a、制備特定粒徑納米金粒子的免疫原； b、將免疫原注射到動物體內(nèi)，制得高特異性抗體； C、用吸光度法測定特定粒徑納米金粒子含量，將抗抗體酶標記制得酶標二抗體，用間接競爭酶聯(lián)免疫法將標準樣品與待測樣競爭與抗體的反應，酶標二抗體的酶促使底物液發(fā)光，測得吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于: 所述步驟a中特定粒徑納米金粒子的免疫原的制備方法為: 在攬祥下將疏基乙Ife溶液加入到特定粒徑納米金粒子溶液中，在攬祥15-20min后調(diào)節(jié)溶液在弱酸條件下，分別加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶液，室溫避光下攪拌3-4h，然后再調(diào)節(jié)pH9~10，加入牛血清白蛋白，4°C下攪拌5-6h后，將反應液裝入透析袋，用蒸餾水透析12h以上，避光低溫保存。
3.如權(quán)利要求2所述的測試方法，其特征在于:所述巰基乙酸溶液濃度為0.0Olmol/L，特定粒徑納米金粒子溶液濃度為0.4~0.6μ g/mL，1-乙基_3_(3_ 二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽溶液濃度為0.2mol/L, N-羥基琥珀酰亞胺溶液濃度為0.05mol/L,牛血清白蛋白濃度為10mg/mL，巰基乙酸、1-乙基_3_(3_ 二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的物質(zhì)的量比1:4:2 ;納米金粒子、巰基乙酸和牛血清白蛋白的質(zhì)量比為 1:1:2000。
4.如權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于:所述步驟b中高特異性抗體的制備方法為:將免疫抗原與弗氏佐劑以體積比1:1混溶，對動物進行多次免疫，制得特定粒徑納米金粒子高特異性抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的測試方法，其特征在于:所述多次免疫方法為:第一次動物免疫將免疫抗原與弗氏完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，免疫三周后，進行五次加強免疫，加強免疫是將免疫抗原與弗氏不完全佐劑混溶，免疫劑量lmL，免疫部位為背部皮下多點注射，五次加強免疫免疫間隔為兩周，經(jīng)五次加強免疫后，從動物心臟采血，血清室溫20-25°C靜置0.5-lh，在冰箱4°C靜置2h后吸取上層澄清的血清，制得高特異性抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的測試方法，其特征在于:所述步驟c中吸光度法具體為: 包被:在酶標板中加入5μ g/mL的包被抗原，100 μ L/孔，8組，每組3孔，37 °C溫育.l-3h，或4°過夜12h，PBST洗滌3次；所述包被抗原的制備方法基本同免疫原的制備方法，不同處在于使用雞卵白蛋白代替牛血清白蛋白； 封閉:加 10mg/mL 的 OVA 溶液，200 μ I/ 孔，37°C溫育 15_60min，PBST 洗滌 3 次； 競爭:加入50 μ I/孔不同濃度特定粒徑納米金粒子溶液，加入濃度為30 μ g/mL抗體，.50 μ I/ 孔，37°C溫育 2-4h，PBST 洗滌 3 次； 加酶:加入100 μ I/孔稀釋度為1:500酶標二抗體溶液，37°C溫育2-4h，PBST洗滌3次； 顯色:加入底物液100 μ L/孔，37°C溫育溫育15_60min ;底物液處理方法為:在加處理后的底物液前15_30min向底物液原液加入0PD，加入量為IOmL底物液原液中加入4mg OPD,加處理后的底物液前3-5min向底物液原液加入質(zhì)量分數(shù)為30%的H2O2，加入量為底物液原液體積分數(shù)的0.15% ； 檢測:加入終止液50 μ L/孔，測定吸光度值，繪制標準曲線； 將待測樣用同樣方法測`定吸光度值，通過標準曲線求得待測樣濃度。
【文檔編號】G01N33/558GK103675272SQ201310722275
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】張明翠, 孫錦文 申請人:安徽師范大學