一種用于篩選抗腫瘤藥物的spr傳感芯片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，以市售的傳感片L1為基板，在所述基板表面偶聯(lián)含MDR1的微囊泡。本案利用MDR1特異性識別候選藥物分子，根據(jù)MDR1與藥物之間的親和力，判斷藥物可被腫瘤細(xì)胞耐受的可能性，實(shí)現(xiàn)藥物篩選，同時該芯片檢測的蛋白-藥物親和動力學(xué)也可被用于多藥耐藥機(jī)理的研究。本案制備的SPR傳感芯片結(jié)合了表面等離子共振技術(shù)的非標(biāo)記及高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)，可開發(fā)作為有效的高通量藥物篩選和藥理學(xué)研究工具。
【專利說明】—種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及SPR傳感檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤治療是目前的研究熱點(diǎn)，化療是時下治療惡性腫瘤的主要方法，然而腫瘤細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥是實(shí)現(xiàn)治療的主要障礙之一，也是多數(shù)腫瘤患者治療后效果不佳的重要因素。多藥耐藥蛋白(MDRl)屬于ATP能量依賴型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對于外源藥物具有選擇性與特異性外排的功能。目前的大量研究均表明，MDRl的過表達(dá)是多藥耐藥的重要原因之一。因此，抗腫瘤藥物篩選中均將MDRl對藥物的識別能力作為重要依據(jù)，同時，多藥耐藥現(xiàn)象的研究中也將MDRl作為主要內(nèi)容之一。
[0003]表面等離子共振傳感技術(shù)(SPR)發(fā)源于上世紀(jì)80年代，因其免標(biāo)記、快速靈敏以及實(shí)時監(jiān)測特性，被廣泛應(yīng)用于生物大分子相互作用、大分子與小分子相互作用、藥物篩選以及腫瘤研究中。基于該技術(shù)開發(fā)的芯片與儀器已經(jīng)高度商業(yè)化，目前國外主要有Biacore, IBIS等系列，國內(nèi)也有中科院電子所研制的各型號儀器與芯片出售，然而這些芯片中還未有研究多藥耐藥現(xiàn)象及機(jī)理的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，以填補(bǔ)國內(nèi)市場上研究抗腫瘤藥物及多藥耐藥機(jī)理所用SPR傳感芯片的空白。
[0005]本發(fā)明提供一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，以市售的傳感片LI為基板，在所述基板表面偶聯(lián)含MDRl的微囊泡。
[0006]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，以市售的傳感片LI為基板，將所述基板放入BIACore3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以15?25微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以15?25微升/分鐘的流速注入15?25mM的3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為2?4min ;用磷酸緩沖液沖洗所述基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)所述BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl 芯片。
[0007]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，所述的含MDRl的微囊泡懸浮液采用如下方法制得:將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90%融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎與蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，將所述中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。[0008]優(yōu)選地,所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法,在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。
[0009]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，在蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為lOOOOg，離心時間為lOOmin，溫度控制在4±0.I。。。
[0010]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，在獲得所述的含MDRl的微囊泡懸浮液后，將其注入BIAcore3000儀器前，還包括對所獲含MDRl的微囊泡懸浮液進(jìn)行鑒定:采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出所獲含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及活度；采用動態(tài)光散射儀測定微囊泡的直徑分布，直徑在150?300nm之間的才能注入BIAcore3000 儀器中。
[0011]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，在制得Ll-MDRl芯片之后，還包括對其進(jìn)行表面覆蓋率檢測:將所述Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。
[0012]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為25 ±0.1°C。
[0013]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，磷酸緩沖液配制方法為:將0.27g磷酸二氫鉀、1.42g磷酸氫二鈉、Sg氯化鈉及0.2g氯化鉀溶解于IL雙蒸水中，并通過滴加IM的鹽酸水溶液或氫氧化鈉水溶液來調(diào)整pH至7.4。
[0014]優(yōu)選地，所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，Tris緩沖液的pH 為 7.4。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:利用MDRl特異性識別候選藥物分子，根據(jù)MDRl與藥物之間的親和力，判斷藥物可被腫瘤細(xì)胞耐受的可能性，實(shí)現(xiàn)藥物篩選，同時該芯片檢測的蛋白-藥物親和動力學(xué)也可被用于多藥耐藥機(jī)理的研究。本芯片結(jié)合了表面等離子共振技術(shù)的非標(biāo)記及高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)，可開發(fā)作為有效的高通量藥物篩選和藥理學(xué)研究工具。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是Ll-MDRl芯片結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為玻璃片基，2為鍍金膜層，3為羧基化葡聚糖膜層，4為親脂殘基，5為微囊泡。
[0017]圖2是Ll-MDRl芯片檢測下不同底物的響應(yīng)曲線。其中A為紅霉素，B為甲氨蝶呤，C為羅丹明123，D為利福平，E為肌酐。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0019]本發(fā)明提供了一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，包括以下步驟:[0020]步驟I)制備含MDRl的微囊泡懸浮液
[0021]將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90%融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎、蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，該中間層是高倍濃縮的含MDRl的微囊泡蔗糖溶液，其中磷酸緩沖液和蔗糖溶液的含量極少；隨后將中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。
[0022]在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。在進(jìn)行蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為10000g(g代表重力加速度)，離心時間為lOOmin，溫度控制在4±0.1°C。Tris緩沖液的pH為7.4。
[0023]步驟2)對微囊泡懸浮液的鑒定
[0024]采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出堿性磷酸酶的活性與總蛋白量比值、蛋白活性與蛋白總量比值，從而獲知含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及蛋白活度；
[0025]采用動態(tài)光散射儀測定微囊泡的直徑分布，直徑在150?300nm之間的才能注入BIAcore3000儀器中，直徑不在此區(qū)間范圍的不適用于后續(xù)的試驗(yàn)，應(yīng)舍棄。動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為25 ±0.1°C。
[0026]步驟3)制作Ll-MDRl芯片
[0027]以市售的傳感片LI為基板，將基板放入BIACore3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以15?25微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以15?25微升/分鐘的流速注入15?25mM的3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為2?4min ;用磷酸緩沖液沖洗基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl芯片。
[0028]3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸是一種兩性表面活性劑，可以增溶蛋白。
[0029]步驟4) Ll-MDRl芯片表面覆蓋率驗(yàn)證
[0030]將Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出芯片并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。Ll-MDRl芯片的干燥可采用氮?dú)獯蹈?、空氣吹干、烘干或者自然晾干?br> [0031]值得注意的是，以上所用磷酸緩沖液均采用以下方法制得:將0.27g磷酸二氫鉀、
1.42g磷酸氫二鈉、8g氯化鈉及0.2g氯化鉀溶解于IL雙蒸水中，并通過滴加IM的鹽酸水溶液或氫氧化鈉水溶液來調(diào)整pH至7.4。
[0032]實(shí)施例1:
[0033]步驟I)制備含MDRl的微囊泡懸浮液
[0034]將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90 %融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎、蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，該中間層是高倍濃縮的含MDRl的微囊泡蔗糖溶液，其中磷酸緩沖液和蔗糖溶液的含量極少；隨后將中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。
[0035]在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。在進(jìn)行蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為10000g(g代表重力加速度)，離心時間為lOOmin，溫度控制在4±0.1°C。Tris緩沖液的pH為7.4。
[0036]步驟2)對微囊泡懸浮液的鑒定
[0037]采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出堿性磷酸酶的活性與總蛋白量比值、蛋白活性與蛋白總量比值，從而獲知含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及蛋白活度；
[0038]采用動態(tài)光散射儀測定微囊泡的直徑分布，直徑在150?300nm之間的才能注入BIAcore3000儀器中，直徑不在此區(qū)間范圍的不適用于后續(xù)的試驗(yàn)，應(yīng)舍棄。動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為25 ±0.1°C。
[0039]步驟3)制作Ll-MDRl芯片
[0040]以市售的傳感片LI為基板，將基板放入BIACore3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以15微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以15微升/分鐘的流速注入15mM的3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為2min ;用磷酸緩沖液沖洗基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl芯片。
[0041 ] 步驟4) Ll-MDRl芯片表面覆蓋率驗(yàn)證
[0042]將Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出芯片并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。
[0043]實(shí)施例2:
[0044]步驟I)制備含MDRl的微囊泡懸浮液
[0045]將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90 %融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎、蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，該中間層是高倍濃縮的含MDRl的微囊泡蔗糖溶液，其中磷酸緩沖液和蔗糖溶液的含量極少；隨后將中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。
[0046]在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。在進(jìn)行蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為10000g(g代表重力加速度)，離心時間為lOOmin，溫度控制在4±0.1°C。Tris緩沖液的pH為7.4。
[0047]步驟2)對微囊泡懸浮液的鑒定
[0048]采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出堿性磷酸酶的活性與總蛋白量比值、蛋白活性與蛋白總量比值，從而獲知含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及蛋白活度；
[0049]采用動態(tài)光散射儀測定微囊泡的直徑分布，直徑在150?300nm之間的才能注入BIAcore3000儀器中，直徑不在此區(qū)間范圍的不適用于后續(xù)的試驗(yàn)，應(yīng)舍棄。動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為25 ±0.1°C。
[0050]步驟3)制作Ll-MDRl芯片
[0051]以市售的傳感片LI為基板，將基板放入BIACore3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以20微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以20微升/分鐘的流速注入20mM的3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為3min ;用磷酸緩沖液沖洗基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl芯片。
[0052]步驟4) Ll-MDRl芯片表面覆蓋率驗(yàn)證
[0053]將Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出芯片并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。
[0054]實(shí)施例3:
[0055]步驟I)制備含MDRl的微囊泡懸浮液
[0056]將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90%融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎、蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，該中間層是高倍濃縮的含MDRl的微囊泡蔗糖溶液，其中磷酸緩沖液和蔗糖溶液的含量極少；隨后將中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。
[0057]在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。在進(jìn)行蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為10000g(g代表重力加速度)，離心時間為lOOmin，溫度控制在4±0.1°C。Tris緩沖液的pH為7.4。
[0058]步驟2)對微囊泡懸浮液的鑒定
[0059]采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出堿性磷酸酶的活性與總蛋白量比值、蛋白活性與蛋白總量比值，從而獲知含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及蛋白活度；
[0060]采用動態(tài)光散射儀測定微囊泡的直徑分布，直徑在150?300nm之間的才能注入BIAcore3000儀器中，直徑不在此區(qū)間范圍的不適用于后續(xù)的試驗(yàn)，應(yīng)舍棄。動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為25 ±0.1°C。
[0061]步驟3)制作Ll-MDRl芯片
[0062]以市售的傳感片LI為基板，將基板放入BIACore3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以25微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以25微升/分鐘的流速注入25mM的3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為4min ；用磷酸緩沖液沖洗基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl芯片。
[0063]步驟4) Ll-MDRl芯片表面覆蓋率驗(yàn)證
[0064]將Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出芯片并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。
[0065]實(shí)施例4:使用上述方法獲得的Ll-MDRl芯片進(jìn)行SPR檢測
[0066]步驟I)將Ll-MDRl芯片放入BIAcore3000儀器中，首先通入磷酸鹽緩沖液(含有5mM ATP)，直至得到平穩(wěn)基線。
[0067]步驟2) 5種對于MDRl具有不同親和力的底物紅霉素、甲氨蝶呤、羅丹明123、利福平以及肌酐溶解于磷酸緩沖液中，并通過Ll-MDRl芯片表面，獲得相應(yīng)的響應(yīng)曲線(見圖2，其中A為紅霉素，B為甲氨蝶呤，C為羅丹明123，D為利福平，E為肌酐)。
[0068]步驟3)對比文獻(xiàn)中各底物與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力，排序與響應(yīng)曲線結(jié)果一致，驗(yàn)證本方法在多藥耐藥現(xiàn)象研究以及藥物篩選中應(yīng)用的可行性。
[0069]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，以市售的傳感片LI為基板，在所述基板表面偶聯(lián)含MDRl的微囊泡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，以市售的傳感片LI為基板，將所述基板放入BIAcOre3000儀器中，注入磷酸緩沖液使其以15~25微升/分鐘的流速持續(xù)流經(jīng)基板表面，隨后又向該儀器中以15~25微升/分鐘的流速注入15~25mM的3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸水溶液，注入持續(xù)時間為2~4min ;用磷酸緩沖液沖洗所述基板，最后向該儀器中注入含MDRl的微囊泡懸浮液，當(dāng)所述BIACore3000儀器中折射率的信號變化參數(shù)RU值達(dá)到5500時，停止注入含MDRl的微囊泡懸浮液，待磷酸緩沖液沖洗掉未結(jié)合的微囊泡后，得到表面偶聯(lián)有MDRl的微囊泡的Ll-MDRl芯片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述的含MDRl的微囊泡懸浮液采用如下方法制得:將市售的MDCK-MDR1細(xì)胞進(jìn)行平板培養(yǎng)，待MDCK-MDR1細(xì)胞生長至90 %融合后，對其進(jìn)行胰酶-EDTA消化，離心，并重新懸浮于磷酸緩沖液中；將含MDCK-MDR1細(xì)胞的磷酸緩沖液放入超聲儀中，經(jīng)超聲破碎、蔗糖密度梯度離心后，取離心液的中間層，將所述中間層懸浮于含250mM蔗糖的50mM Tris緩沖液中，從而獲得含MDRl的微囊泡懸浮液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，在超聲破碎時，超聲頻率為250Hz，超聲時間為3min。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，在蔗糖密度梯度離心時，蔗糖濃度為38wt%，離心速度為10000g，離心時間為lOOmin，溫度控制在4 ± 0.1°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，在獲得所述的含MDRl的微囊泡懸浮液后，將其注入BIACore3000儀器前，還包括對所獲含MDRl的微囊泡懸浮液進(jìn)行鑒定:采用磷酸苯二鈉比色法檢測微囊泡中堿性磷酸酶的活性；采用熒光底物或同位素底物轉(zhuǎn)運(yùn)法測定MDRl的蛋白活性；采用BCA法檢測含MDRl的微囊泡懸浮液中的蛋白總量；將以上測定參數(shù)進(jìn)行比對，得出所獲含MDRl的微囊泡懸浮液中微囊泡的純度及活度；采用動態(tài)光散射儀檢測并確定微囊泡的直徑分布，直徑在150~300nm之間的才能注入BIAcore3000儀器中。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，在制得Ll-MDRl芯片之后，還包括對其進(jìn)行表面覆蓋率檢測:將所述Ll-MDRl芯片置于BIAcore3000儀器中，注入含有0.1mg / ml牛血清白蛋白的磷酸緩沖液，當(dāng)RU值的改變量小于50時，表明芯片表面已完全被微囊泡覆蓋，最后取出并用氮?dú)獯蹈杉纯捎糜诤罄m(xù)的檢測試驗(yàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，動態(tài)光散射儀的光源系統(tǒng)為氦離子激光系統(tǒng)，光源波長為633nm,動態(tài)光散射儀工作溫度為 25±0.10Co
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于，磷酸緩沖液配制方法為:將0.27g磷酸二氫鉀、1.42g磷酸氫二鈉、Sg氯化鈉及0.2g氯化鉀溶解于IL雙蒸水中，并通過滴加IM的鹽酸水溶液或氫氧化鈉水溶液來調(diào)整pH至7.4。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于篩選抗腫瘤藥物的SPR傳感芯片的制備方法，其特征在于， Tris緩沖液的pH為7.4。
【文檔編號】G01N21/55GK103712954SQ201310730985
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】殷建, 陳名利, 林穎, 胡軍 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所