一種萘檢測生物細胞傳感器及其制備方法和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種萘檢測生物細胞傳感器及其制備方法和使用方法，所述萘檢測生物細胞傳感器為基因重組細胞，所述基因重組細胞以水楊酸檢測光傳感細胞為宿主細胞，并且所述基因重組細胞的質(zhì)粒由萘降解基因與載體質(zhì)粒重組。本發(fā)明的萘檢測生物細胞傳感器在萘存在時可以立即發(fā)光，選擇性好、靈敏度高、分析速度快、操作簡易和儀器價格低廉、能在復(fù)雜體系中進行在線連續(xù)穩(wěn)定檢測。本發(fā)明還提供了所述細胞傳感器的制備方法，所采用的構(gòu)建條件溫和、方法可控及簡單易行，采用Gibson克隆技術(shù)完成了大分子降解片段的體外重組，是對專一污染底物進行檢測的重要手段。
【專利說明】一種萘檢測生物細胞傳感器及其制備方法和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物細胞傳感器及其制備方法和用途，具體而言，本發(fā)明涉及一種萘檢測生物細胞傳感器及其制備方法和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PAHs— Polycyclic Aromatic Hydrocarbons),多環(huán)芳經(jīng)是指一類含有2個或2個以上苯環(huán)，以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)型化合物，熔點和沸點較高，具有疏水性強等特點，目前已知的多環(huán)芳烴有200多種。PAHs具有致癌、致畸、致突的“三致”效應(yīng)，由于它具有脂溶性，很容易被動物的腸胃吸收，并能經(jīng)食物鏈級聯(lián)放大而富集并迅速的被廣泛的分散到不同的組織中發(fā)揮作用。由于其毒性效應(yīng)顯著，有16種PAHs列入了美國環(huán)保局制定的129種優(yōu)先污染物中。
[0003]PAHs的主要來源包括自然源和人為源。自然源包括燃燒和生物合成，如森林大火和火山噴發(fā)以及沉積物成巖過程、生物轉(zhuǎn)化過程和焦油礦坑內(nèi)氣體等。人為源的數(shù)量則隨著工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展大大增加，主要存在于石油、煤等燃料以及木材、天然氣、汽油、重油、紙張、作物秸桿、煙草等含碳氫化合物的物質(zhì)不完全燃燒或在還原性氣氛中熱分解的產(chǎn)物中。原油和煤炭中存在大量的PAHs，而含碳燃料的不完全燃燒也可產(chǎn)生PAHs。近年來大量調(diào)查研究表明，空氣、土壤、水體及生物體等都受到了多環(huán)芳烴的污染。由于石化廠、焦化廠、煉油廠等工業(yè)污染原的廣泛存在，土壤和地下水系統(tǒng)中PAHs的污染相當普遍和嚴重。我國部分石化廠和石油開采區(qū)污染地區(qū)地下水中萘、菲、蒽、芘、苯并(a)芘等PAHs的檢出率高達50%以上。
[0004]萘是一種常見的雙環(huán)芳香烴化合物，是最簡單的PAHs，是分子量最小的PAHs，是煤焦油和雜酚油的主要成分，是多環(huán)芳烴中水溶性和揮發(fā)性最強的一種。隨著對萘研究的不斷深入，萘的毒性特別是三致作用引起有關(guān)學(xué)者的高度重視。長期接觸萘?xí)鹑梭w內(nèi)血液成份的變化，肝轉(zhuǎn)氨酶活性升高，出現(xiàn)黃疸，嚴重威脅人體健康；萘對水生生物也有毒害作用，表現(xiàn)為抑制呼吸強度，降低葉綠素含量，最終導(dǎo)致水生生物萎縮死亡。由于其結(jié)構(gòu)簡單、較高水溶性和容易從自然界分離得到其降解菌株等原因，常被用作PAHs生物降解的模式化合物，其相關(guān)研究最早也最為深入和透徹。
[0005]萘可用作制造染料、塑料、合成纖維、殺真菌劑、殺蟲劑和油漆等的原料，還用作木材防腐劑和家用防蟲劑。在20世紀七八十年代,常被用作家用殺蟲藥(樟腦丸)。隨著石油化學(xué)工業(yè)的發(fā)展，萘的需要量顯著增多，已成為石化工業(yè)的八大原料之一，廣泛應(yīng)用于塑料、石油、化工、煤加工、紡織和制藥等行業(yè)中，在這些行業(yè)的生產(chǎn)廢水中都可以檢測到萘。世界上許多水體，包括 湖泊甚至地下水中也都有萘的存在；萘還分布于受石油污染的海港、土壤、垃圾集散和處理場。是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機污染物。因此消除萘的污染已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重大問題之一，各國的研究者們都在爭相尋找消除萘污染的有效途徑。
[0006]PAHs的檢測和修復(fù)機理及其污染控制對策是一項國際性技術(shù)難題。之前諸多專家學(xué)者對此開展了大量研究工作并取得了重要進展，多數(shù)研究集中在PAHs的毒性表征研究。對多環(huán)芳烴的檢測方法分為化學(xué)分析方法和生物分析方法。化學(xué)分析方法是通過對樣品進行色譜等化學(xué)分析手段得到PAHs的濃度，目前而言，對于PAHs的檢測往往是在經(jīng)過復(fù)雜的前處理之后，再用氣相色譜(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)、激光質(zhì)譜以及熒光光譜法等。這類方法需要對樣品進行復(fù)雜的處理和化學(xué)分析，僅從物質(zhì)的角度而不是生物效應(yīng)的角度來衡量其毒性效應(yīng)。多環(huán)芳烴性質(zhì)穩(wěn)定、難于降解，可以長期存在于環(huán)境之中，也是環(huán)境中常見的系列有毒化合物。土壤是環(huán)境中PAHs的儲庫和中轉(zhuǎn)站，但是它可以通過大氣直接沉降，雨水沖刷以及生物合成等途徑進入水體生態(tài)系統(tǒng)。在對環(huán)境中液相和固相的PAHs進行治理修復(fù)工作之前，其測定工作是至關(guān)重要的，但由于一般PAHs含量很低，在進行儀器分析之前必須進行預(yù)處理以富集目標化合物，傳統(tǒng)的萃取，濃縮凈化法較為復(fù)雜，且耗用大量對環(huán)境有害試劑，所需時間長，難以滿足應(yīng)急需要，僅從物質(zhì)的角度而不是生物效應(yīng)的角度來衡量其毒性效應(yīng)。
[0007]生物傳感器處在生命科學(xué)和信息科學(xué)的交叉區(qū)域，是一個非?；钴S的研究和工程【技術(shù)領(lǐng)域】，是多種學(xué)科互相滲透、綜合交叉的一門技術(shù)。它具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、操作簡易和儀器價格低廉、能在復(fù)雜體系中進行在線連續(xù)檢測等特點，甚至可以進行活體分析，并趨向微型化、集成化和智能化，給生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域直接帶來新技術(shù)革命，有著重要的應(yīng)用價值，已引起世界各國的極大關(guān)注。生物傳感器是一種把生物體本身或生物物質(zhì)作為識別元件的測量系統(tǒng)，用來檢測與生理或生化過程相關(guān)的參數(shù)。按照識別元件可將生物傳感器分為三類:基于分子(酶、抗原或抗體、受體、核酸、脂質(zhì)體等)的，基于細胞的和基于組織切片的。就敏感元件而言，前者是固定化的生物體成分，后兩者是生物體本身?；诜肿拥纳飩鞲衅骶哂懈叨冗x擇性和敏感性，只對靶分子有響應(yīng)。但正因為這種高度選擇性，可能會使某些具有相同功能的相關(guān)分子檢測不到。而將活細胞作為探測單元，可以檢測到許多未知的物質(zhì)。近幾年，隨著半導(dǎo)體微細加工技術(shù)的發(fā)展，分析技術(shù)的微型化為細胞微環(huán)境分析提供了強有力的手段，以活細胞作為敏感元件已成為生物傳感器研究領(lǐng)域的一大熱點。
[0008]近年來，隨著生物細胞傳感技術(shù)的發(fā)展，微生物細胞傳感器作為一種新型的檢測技術(shù)被用于檢測環(huán)境污染物，給環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域直接帶來新技術(shù)革命，有著重要的應(yīng)用價值。
[0009]微生物細胞傳感器是由選擇性較好的微生物體構(gòu)成的分子識別元件，因此一般不需要樣品的預(yù)處理:同時由于其體積小、響應(yīng)時間短，因此可以實現(xiàn)在采樣點的原位監(jiān)測，并且大多可以實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測；另外由于微生物體本身可以快速繁殖的特點，使得該類傳感器的制造和分析成本遠低于大型分析儀器:此外，最為重要的是其測定的污染物濃度是樣品中具有生物有效性的部分，因而得到的數(shù)據(jù)更有實際意義。
[0010]由于PAHs種類繁多，降解途徑復(fù)雜，對于其典型特異種類的快速生物監(jiān)測還未取得突破性進展。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，近年來對于PAHs的生物降解途徑已經(jīng)有了深入的認識。目前，利用生物細胞傳感器對持久性污染物PAHs代謝終端的小分子物質(zhì)如水楊酸、鄰苯二酚的檢測也已經(jīng)取得了可喜的成果。
[0011]近年來，將特異性因子融合到發(fā)光基因上而得到的重組發(fā)光細菌菌株已經(jīng)開始用于環(huán)境監(jiān)測，該利用重組發(fā)光細菌作為生物傳感單元的優(yōu)勢在于反應(yīng)快速，成本低，可重復(fù)性好。[0012]1998年Sayler將tod操縱兀和luxCDABE融合，轉(zhuǎn)化到假單胞菌(Pseudomonasputida)Fl菌株中，獲得了一個對苯、甲苯、乙苯和二甲苯等苯系物有檢測效應(yīng)的生物傳感器菌株TVA8。2004年Gu等利用固定化的重組發(fā)光細菌成功構(gòu)建了檢測污染土壤中PAHs毒性的生物傳感器，采用鼠李糖作為表面活性劑提取PAHs，液相中的菲的濃度(數(shù)量級為ng/mL)與傳感器得到的毒性數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)很好，該傳感器可用于現(xiàn)場檢測土壤中疏水性污染物的毒性以及PAHs的含量。2006年Van der Meer等將對菲有降解作用的菌株伯克氏菌(Burkholderia sp.)RP007 的基因啟動子(phnS putative promoter/operator region)克隆出來，并將其與GFP基因連接，構(gòu)建出新的菌株伯克氏菌RP037，對菲一類的污染物有檢測效果。
[0013]King和他的同事(1990年)建造的第一個萘和水楊酸敏感的生物細胞傳感器，使用質(zhì)粒為基礎(chǔ)的luxCDABE基因并融合源于熒光假單胞菌產(chǎn)生的NAH7質(zhì)粒。后來在實驗室得到廣泛使用以及在現(xiàn)場檢測系統(tǒng)中提供良好的系統(tǒng)檢測工具。King構(gòu)建的傳感細胞的光感時間是15min (對萘污染物反應(yīng)15min后才開始發(fā)光)，靈敏度不夠高、分析速度較慢，詳見 King 等的文章 “Rapid, sensitive bioluminescent reporter technology fornaphthalene exposure and biodegradation，，，〈〈Science〉〉,第 249 期，P778 - 781。
[0014]1990年Sayler等利用萘降解代謝途徑中的nah操縱元和發(fā)光基因lux融合，構(gòu)建了對萘有特異檢測效果的微生物傳感器。1994年Sayler又利用nahG基因和luxCDABE融合改進了上面的報告菌株，并將構(gòu)建成功的新菌株用于對污染河流中萘和水楊酸類物質(zhì)的生物有效性進行連續(xù)在線的監(jiān)測。2004年Van der Meer等利用Psal啟動子和luxAB基因融合構(gòu)建的菌株，首次報道可以直接監(jiān)測氣態(tài)物質(zhì)中的有機污染物，可以檢測到50nmol/L水平的萘類物質(zhì)。
[0015]建立、完善和發(fā)展PAHs污染物的檢測方法是環(huán)境科學(xué)的熱點研究課題，也是環(huán)境綜合治理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之 一，具有重要的研究意義。同時構(gòu)建一種新的高靈敏、低成本的細胞生物傳感器的檢測方法對完善現(xiàn)有的檢測技術(shù)亦具有重要意義和較好的應(yīng)用價值。由于PAHs降解的多樣性，以往對于PAHs的生物傳感器研究較少，大部分的細胞傳感器主要是用于小分子PAHs (如:萘和菲)及部分PAHs降解的中間產(chǎn)物(如:水楊酸)的研究等。對于萘生物傳感器的構(gòu)建多是通過將對萘有降解作用的基因同光報告基因的融合實現(xiàn)的。現(xiàn)有的方法構(gòu)件復(fù)雜，穩(wěn)定性低，檢測時間長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明通過萘的傳感器的構(gòu)建，以建立新型的PAHs污染物降解的生物傳感器，這種構(gòu)建思路是環(huán)境領(lǐng)域的創(chuàng)新。具體而言，本發(fā)明是從萘的降解途徑出發(fā)，由于多種PAHs，包括萘的降解過程中都會產(chǎn)生共同的中間產(chǎn)物——水楊酸，通過把對大分子的萘降解基因與已經(jīng)構(gòu)建好的在細胞內(nèi)的對水楊酸識別和光報告的生物傳感系統(tǒng)進行融合，通過熒光報告基因的發(fā)光強度來指示水楊酸濃度，從而間接地實現(xiàn)對萘的檢測。上述構(gòu)建方法為其他多種的PAHs構(gòu)建傳感細胞奠定了基礎(chǔ)。同時本發(fā)明針對傳感細胞構(gòu)建技術(shù)的難點，對大分子融合基因構(gòu)建和轉(zhuǎn)化、融合基因啟動和表達載體的篩選等關(guān)鍵過程進行創(chuàng)新，實現(xiàn)了萘檢測生物細胞傳感器的成功構(gòu)建，既為萘污染的修復(fù)機制提供有利的依據(jù)，又實現(xiàn)了對不同污染環(huán)境樣品的快速靈敏檢測，為萘污染環(huán)境全面分析及有效生物修復(fù)提供可行的理論依據(jù)和實際應(yīng)用技術(shù)。
[0017]本發(fā)明重點在于萘的大分子降解基因片段與啟動基因的重組結(jié)合，實現(xiàn)降解基因在受體細胞中的表達。由于大片段降解基因跟載體連接的困難，本發(fā)明將借助新型高性能的Gibson克隆法，Gibson克隆法是2009年發(fā)表在Nature Methods上的一種新穎的大片段基因重組的方法，本發(fā)明采用的是Gibson —步恒溫法實現(xiàn)DNA重組(詳見現(xiàn)有技術(shù)文獻Gibson D G, Young L, Chuang R等,Enzymatic assembly of DNA molecules up to severalhundred kilobases [J].Nature Methods, 2009, 6 (5): 341-343 中的第 343 頁 method 部分One-step isothermal DNA assembly—段中),通過運用等溫,單反應(yīng)的方法重組多個重疊的DNA分子，通 過外切酶，DNA聚合酶的聯(lián)合作用準確的完成大分子擴增和基因重組過程。此
【發(fā)明內(nèi)容】
的實現(xiàn)為其他的PAHs污染物的檢測和降解修復(fù)提供寶貴的基礎(chǔ)。
[0018]本發(fā)明的萘檢測生物細胞傳感器的構(gòu)建原理如圖1所示，技術(shù)路線如圖2所示。
[0019]具體而言，本發(fā)明提供的一種萘檢測生物細胞傳感器，其特征在于:
[0020]所述萘檢測生物細胞傳感器為基因重組細胞，所述基因重組細胞以水楊酸檢測光傳感細胞為宿主細胞，并且所述基因重組細胞的質(zhì)粒由萘降解基因與載體質(zhì)粒重組。
[0021 ] 所述萘降解基因與所述載體質(zhì)粒通過Gibson —步恒溫法實現(xiàn)DNA重組(One-stepisothermal DNA assembly)得到所述基因重組細胞的質(zhì)粒。
[0022]所述萘降解基因為NahAD ；
[0023]所述載體質(zhì)粒為pWH1274 ；
[0024]所述水楊酸檢測光傳感細胞為不動桿菌ADPWH_lux(Acinetobacter ADPWH_lux)。
[0025]本發(fā)明還提供了一種所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0026]1)宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞的培養(yǎng)；
[0027]2)獲取載體質(zhì)粒和萘降解基因；
[0028]3)通過Gibson法將載體質(zhì)粒和萘降解基因重組得到所述基因重組細胞的質(zhì)粒；
[0029]4)將步驟3)得到的所述基因重組細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)得到的宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞。
[0030]其中，所述步驟2)包括以下步驟:
[0031]2-1)載體質(zhì)粒的選擇與處理
[0032]其中，載體質(zhì)粒的選擇是選擇帶有強啟動子質(zhì)粒載體的菌株；本發(fā)明的實施例所需要的包含帶有萘降解基因NahAD的質(zhì)粒pDTGl的細菌——假單胞菌NCIB9816、包含質(zhì)粒載體pWH1274的細菌——乙酸鈣不動桿菌以及水楊酸檢測光傳感細胞不動桿菌ADPWH_lux均是由英國謝菲爾德大學(xué)黃巍教授贈與。
[0033](Huang, ff.E., Wang.Η., Zheng.Η.J., Huang.L.F., Singer.A.C., Thompson.L.and ffhiteley.A.S.(2005) Chromosomally located gene fusions constructedin Acinetobacter sp.ADP1 for the detection of salicylate.Environ.Microbiol.7(9):P1339_1348.)
[0034]其中，對載體質(zhì)粒進行處理，包括以下步驟:
[0035]2-1-1)提取載體質(zhì)粒、2-1-2)對載體質(zhì)粒DNA進行檢測、2_1_3)載體質(zhì)粒聚合酶鏈式反應(yīng)，即PCR (Polymerase Chain Reaction)、2-l_4)載體質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物的純化、2-1-5) PCR產(chǎn)物的檢測；
[0036]2-2)萘的降解基因的選擇和處理，包括以下步驟:
[0037]其中，對萘的降解基因的選擇是分析降解菌對PAHs污染物的降解機理，選擇能夠降解奈的囷株；
[0038]2-2-1)提取含萘的降解基因的質(zhì)粒、2-2-2 )萘降解基因的質(zhì)粒DNA的檢測、2-2-3)所述含萘降解基因質(zhì)粒的PCR反應(yīng)、2-2-4) PCR產(chǎn)物的純化、2_2_5) PCR產(chǎn)物的檢測。
[0039]其中所述步驟2-1-3)的聚合酶鏈式反應(yīng)中，質(zhì)粒載體引物1274EcoRV的序列分別是:
[0040]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；
[0041 ] 1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；
[0042]所述步驟2-1-3) PCR的反應(yīng)體系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物
2.0 μ L，10mM的四種脫氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或稱為dNTPs，其加入體積是1 μ L，10 X緩沖液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板質(zhì)粒載體PWH1274為1 μ L，去離子水38.5 μ L，該步驟的熱循環(huán)條件分別為:95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s ;56-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35個循環(huán)；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在 4。。。
[0043]其中所述步驟2-2-3)的聚合酶鏈式反應(yīng)中，萘降解基因NahAD的引物序列分別是:
[0044]NahAD正向引物序列:
[0045]AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACG
[0046]NahAD反向引物序列:
[0047]GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC
[0048]其中步驟2-2-2)的PCR的反應(yīng)體系共50 μ L，其中包括正向引物2.Ομ L，反向引物 2.Ο μ L, 10mM 的 dNTPs 加入體積 1 μ L，10 X 緩沖液 5 μ L，Dream Taq 聚合酶 0.5 μ L，模板質(zhì)粒pDTGl為1 μ L，去離子水38.5 μ L，該步驟的熱循環(huán)條件分別為:95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s ;57-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35個循環(huán)；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在4 C。
[0049]所述步驟3)包括以下步驟: [0050]3-1)運用 Gibson—步恒溫法(One-step isothermal DNA assembly)實現(xiàn) DNA 重組、3-2) PCR產(chǎn)物的檢測。
[0051]所述步驟3-1)的Gibson反應(yīng)體系為20 μ L，其中5X恒溫重組混合物(ISAmaster mixture) 15 μ L，載體質(zhì)粒pWH1274的PCR產(chǎn)物與萘降解基因的PCR產(chǎn)物濃度均為10-100ng/ μ L，載體pWH1274的PCR產(chǎn)物與萘降解基因的PCR產(chǎn)物的體積共為5 μ L，在50°C反應(yīng)一夜；
[0052]其中恒溫重組混合物的組成包括:5 X恒溫重組緩沖液40 μ L、0.2U/ μ L的T5外切酶4 μ L、2U/ μ L的Phusion聚合酶2.5 μ L、40U/ μ L的Taq DNA連接酶20 μ L以及去離子水共83.5 μ L ;
[0053]其中5Χ恒溫重組緩沖液包括1Μ的ρΗ=7的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris_HCl)500μ L，2M的氯化鎂(MgCl2) 25 μ LUOOmM的脫氧鳥苷三磷酸三鈉(dGTP) 10 μ LUOOmM的去氧胞苷三磷酸(dCTP)lOy L、100mM的脫氧胸苷三磷酸(dTTP)10 μ L、lOOmM的三磷酸脫氧腺苷(dATP) 10μ L、1M 的二硫蘇糖醇(DTT) 50 μ L、聚乙二醇 8000 (PEG-8000)為 0.25 μ L、50mM的輔酶I (NAD) 100 μ L和去離子水共75 μ L，其中用于T5外切酶稀釋的緩沖液包括100%甘油10mL、lM的pH為7.5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris_HCl)為lmL、0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)4y L、1M的二硫蘇糖醇(DTT)20 μ L、1M的氯化鈉(NaCl)2 μ L、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 20 μ L和去離子水695 μ L。
[0054]所述步驟4)采用電轉(zhuǎn)化實驗步驟將步驟3)得到的所述基因重組細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)得到的宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞。 [0055]所述質(zhì)粒載體引物1274EcoRV的序列:
[0056]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；
[0057]1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；
[0058]以及所述萘降解基因NahAD的引物序列:
[0059]NahAD正向引物序列:
[0060]AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACG[0061 ] NahAD反向引物序列:
[0062]GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC
[0063]都列入序列表(SEQUENCE LISTING),上述序列均為人工(Artificial)序列。
[0064]本發(fā)明還提供了所述的萘檢測生物細胞傳感器的使用方法，其特征在于包括以下步驟:
[0065]1)將所述萘檢測生物細胞傳感器加入不同濃度的萘溶液中，記錄所述萘檢測生物細胞傳感器對于不同濃度溶液在0-6h時的發(fā)光量，得出濃度與第3h時的發(fā)光量的線性關(guān)系;
[0066]2)根據(jù)上述濃度與第3h時的發(fā)光量的線性關(guān)系，根據(jù)所述萘檢測生物細胞傳感器在待測萘溶液中實際發(fā)光量計算出待測溶液中萘的濃度。
[0067]實驗發(fā)現(xiàn)，所述萘檢測生物細胞傳感器在不同濃度的萘溶液誘導(dǎo)后的第3h時的發(fā)光量與濃度呈較好的線性關(guān)系，可以作為檢測溶液中萘的濃度標準曲線。
[0068]本發(fā)明提供的萘檢測生物細胞傳感器，其為基因重組細胞，其以水楊酸檢測光傳感細胞為宿主細胞，包括由萘降解基因與載體質(zhì)粒重組的質(zhì)粒。本發(fā)明的細胞傳感器在萘存在時立即有發(fā)光反應(yīng)，選擇性好、靈敏度高、分析速度快、操作簡易和儀器價格低廉、能在復(fù)雜體系中進行在線連續(xù)穩(wěn)定檢測。本發(fā)明利用在水楊酸檢測光傳感細胞轉(zhuǎn)入萘的降解質(zhì)粒的方法構(gòu)建的萘傳感細胞，主要用于檢測萘，而上述構(gòu)建方法也可以用于構(gòu)建其他多種PAHs生物傳感細胞，且構(gòu)建方法簡單，快速，發(fā)光穩(wěn)定。本發(fā)明還提供了所述細胞傳感器的制備方法，所采用的構(gòu)建條件溫和、方法可控及簡單易行，采用Gibson克隆技術(shù)完成了大分子降解片段的體外重組，是對專一污染底物——萘進行檢測的重要手段。
[0069]具體而言，本發(fā)明的有益效果如下:
[0070]1.本發(fā)明所采用的構(gòu)建條件溫和、方法可控及簡單易行，采用Gibson克隆技術(shù)完成了大分子降解片段的體外重組，是對專一污染底物進行檢測的重要手段。
[0071]2.本發(fā)明通過降解基因的整合重組，結(jié)合染色體上構(gòu)建的穩(wěn)定的熒光報告基因進行報告，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、操作簡易和儀器價格低廉、能在復(fù)雜體系中進行在線連續(xù)穩(wěn)定檢測等特點。
[0072]3.在環(huán)境石油類多環(huán)芳烴類污染物的檢測中解決了對特定污染物——萘進行專一檢測的實際問題。在完善我國現(xiàn)有檢測技術(shù)手段具有重要意義和較好的應(yīng)用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0073]圖1為本發(fā)明的生物細胞傳感器的構(gòu)建原理圖。
[0074]圖2為本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
[0075]圖3為本發(fā)明的生物細胞傳感器ADPWH_Nah及對照組細胞ADPWH_1274對50 μ Μ萘的發(fā)光曲線與對DMS0的發(fā)光曲線對比圖。
[0076]圖4為本發(fā)明的生物細胞傳感器ADPWH_Nah對于不同濃度萘的發(fā)光曲線對比圖。
[0077]圖5為本發(fā)明的生物細胞傳感器ADPWH_Nah對于不同濃度萘誘導(dǎo)后的第3h時的發(fā)光量與萘濃度的關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0078]如圖2所示，本發(fā)明的技術(shù)路線如下:
[0079](1)水楊酸檢測光傳感細胞不動桿菌ADPWH_lux (Acinetobacter ADPWH_lux)的
培養(yǎng)
[0080]>前期工作是對已獲得的水楊酸檢測光傳感細胞ADPWH_lux進行培養(yǎng)。
[0081](2)大分子片段萘降解基因和`載體質(zhì)粒的獲得
[0082]首先分析降解菌對PAHs污染物的降解機理?？赏ㄟ^已有報道獲得需要的降解功能細菌或具有相關(guān)功能的降解質(zhì)粒。載體質(zhì)粒的選擇是選擇帶有強啟動子質(zhì)粒載體的菌株。實施例所需要的包含帶有萘降解基因NahAD的質(zhì)粒pDTGl的細菌——假單胞菌NCIB9816、包含質(zhì)粒載體pWH1274的細菌——乙酸鈣不動桿菌以及水楊酸檢測光傳感細胞不動桿菌ADPWH_lux均是由英國謝菲爾德大學(xué)黃巍教授贈與。
[0083]>根據(jù)已知萘污染物質(zhì)降解(同源)基因搜索，設(shè)計基因簡并引物，定位、擴增降解基因片段。大分子片段的獲得具有一定的難度，采用高效能PCR擴增多聚酶進行擴增。
[0084]>選擇具有強啟動子質(zhì)粒pWH1274做載體，設(shè)計PCR擴增引物，擴增載體基因片段。與降解片段NahAD進行體外重組連接克隆。因為大分子的降解基因跟載體連接的困難，因此運用Gibson克隆的方法實現(xiàn)降解基因和質(zhì)粒載體的連接。
[0085]>將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入到已構(gòu)建好(含水楊酸檢測的傳感系統(tǒng))的宿主細菌不動桿菌ADPWH_lux內(nèi)。完成萘檢測傳感細胞的重組構(gòu)建，檢測基因的穩(wěn)定表達及生物學(xué)性能分析。
[0086](3)細胞生物細胞傳感器的敏感反應(yīng)條件測試篩選和應(yīng)用參數(shù)優(yōu)化
[0087]>對萘檢測細胞傳感細胞在不同環(huán)境條件，如pH，溫度，萘的最適濃度范圍等因
素進行動力學(xué)測試分析，確定其應(yīng)用的最佳敏感性和穩(wěn)定性參數(shù)條件。
[0088]本發(fā)明的主要構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0089]A.水楊酸檢測光傳感細胞不動桿菌ADPWH_lux的培養(yǎng)[0090]>前期工作是對已獲得的水楊酸檢測光傳感細胞不動桿菌ADPWH_lux進行培養(yǎng)。
[0091]B.大片段的萘降解基因的獲得及體外重組質(zhì)粒構(gòu)建
[0092]1.載體質(zhì)粒pWH1274的處理
[0093]1.1載體質(zhì)粒pWH1274的提取
[0094]用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的高純度質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號:DP104)從一株乙酸鈣不動桿菌中提取載體質(zhì)粒PWH1274。
[0095]1.1.1.柱平衡步驟:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500 μ L的平衡液BL，12，OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0096]1.1.2.取5mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，12，OOOrpm離心lmin，盡量吸除上清。
[0097]1.1.3.向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ L溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。
[0098]1.1.4.向離心管中加入250 μ L溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次使菌體充分裂解。
[0099]1.1.5.向離心管中加入350 μ L溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，12，OOOrpm離心lOmin,將上清轉(zhuǎn)移到過濾柱CS。
[0100]1.1.6.12，OOOrpm離心2min，小心地將離心后收集管中得到的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3 中。
[0101]1.1.7.12，OOOrpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0102]1.1.8.向吸附柱CP3中加入500 μ L去蛋白液PD，12，OOOrpm離心60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0103]1.1.9.向吸附柱CP3中加入600yL漂洗液PW，12，000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。
[0104]1.1.10.重復(fù)操作步驟 1.1.9。
[0105]1.1.11.將吸附柱CP3放入收集管中，12，OOOrpm離心2min，目的是將吸附柱中殘
余的漂洗液去除。
[0106]1.1.12.將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50 μ L洗脫緩沖液ΤΒ，室溫放置2min，12，OOOrpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
[0107]1.2質(zhì)粒DNA的檢測
[0108]吸取5μ L質(zhì)粒DNA進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余DNA存于_20°C冰箱。用1XTAE按照質(zhì)量濃度比配制瓊脂糖，在80V的電壓下電泳，電泳結(jié)果經(jīng)用溴化乙錠(EB)染色后在凝膠成像系統(tǒng)紫外下觀察。
[0109]1.3PCR 質(zhì)粒 pWH1274
[0110]其中引物由發(fā)明人設(shè)計，生工生物工程(上海)股份有限公司合成:
[0111]1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC
[0112]1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC
[0113]PCR的反應(yīng)體系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物2.0 μ L，10mM的四種脫氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或稱為dNTPs，其加入體積是1 μ L，10 X緩沖液5 μ L，Dream Taq聚合酶(λ 5 μ L，模板質(zhì)粒載體pWH1274為1 μ L，去離子水38.5 μ L，該步驟的熱循環(huán)條件分別為:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性30s ;56_60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35個循環(huán)，即PCR循環(huán)次數(shù)為35次；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在4°C ;具體見下表1。
[0114]表1PCR弓丨物及反應(yīng)條件
【權(quán)利要求】
1.一種萘檢測生物細胞傳感器，其特征在于:所述萘檢測生物細胞傳感器為基因重組細胞，所述基因重組細胞以水楊酸檢測光傳感細胞為宿主細胞，并且所述基因重組細胞的質(zhì)粒由萘降解基因與載體質(zhì)粒重組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萘檢測生物細胞傳感器，其特征在于:所述萘降解基因與所述載體質(zhì)粒通過Gibson —步恒溫法實現(xiàn)DNA重組(One-stepisothermal DNA assembly)得到所述基因重組細胞的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的萘檢測生物細胞傳感器，其特征在于:所述萘降解基因為NahAD ；所述載體質(zhì)粒為PWH1274 ；所述水楊酸檢測光傳感細胞為不動桿菌ADPWH_lux (Acinetobacter ADPWH_lux)。
4.一種如權(quán)利要求1~3所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于包括以下步驟:1)宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞的培養(yǎng)；2)獲取載體質(zhì)粒和蔡降解 基因；3)通過Gibson—步恒溫法將載體質(zhì)粒和萘降解基因重組得到所述基因重組細胞的質(zhì)粒;4)將步驟3)得到的所述基因重組細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)得到的宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟2)包括以下步驟:2-1)載體質(zhì)粒的選擇與處理其中，載體質(zhì)粒的選擇是選擇帶有強啟動子質(zhì)粒載體的菌株；其中，對載體質(zhì)粒進行處理，包括以下步驟:2-1-1)提取載體質(zhì)粒、2-1-2)對載體質(zhì)粒DNA進行檢測、2_1_3)載體質(zhì)粒聚合酶鏈式反應(yīng)，即 PCR (Polymerase Chain Reaction)、2-l_4)載體質(zhì)粒的 PCR 產(chǎn)物的純化、2-1-5)PCR產(chǎn)物的檢測；2-2)萘的降解基因的選擇和處理，包括以下步驟:其中，對萘的降解基因的選擇是分析降解菌對PAHs污染物的降解機理，選擇能夠降解萘的菌株；2-2-1)提取含萘的降解基因的質(zhì)粒、2-2-2)萘降解基因的質(zhì)粒DNA的檢測、2_2_3)所述含萘降解基因質(zhì)粒的PCR反應(yīng)、2-2-4) PCR產(chǎn)物的純化、2_2_5) PCR產(chǎn)物的檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于:其中所述步驟2-1-3)的聚合酶鏈式反應(yīng)中，質(zhì)粒載體引物1274EcoRV的序列分別是:1274EcoRV 正向引物序列:ATCGTCCATTCCGACAGCATCGCC ；1274EcoRV 反向引物序列:ATCCCGCAAGAGGCCCGGCAGTAC ；所述步驟2-1-3) PCR的反應(yīng)體系共50 μ L，其中包括正向引物2.0 μ L，反向引物·2.0 μ L，10mM的四種脫氧核糖核苷三磷酸，即包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP的混合物，或稱為dNTPs，其加入體積是1 μ L，10 X緩沖液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板質(zhì)粒載體PWH1274為1 μ L，去離子水38.5 μ L，該步驟的熱循環(huán)條件分別為:95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s ;56-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35個循環(huán)；72°C最后延伸lOmin ;最后保持在 4。。；其中所述步驟2-2-3)的聚合酶鏈式反應(yīng)中，萘降解基因NahAD的引物序列分別是:NahAD正向引物序列: AGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATTGACAT ATAACGTCGTATTCACGNahAD反向引物序列:GCACGCCATAGTGACTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATACGATCAG GTCAACCACTTATATC其中步驟2-2-2)的PCR的反應(yīng)體系共50 μ L，其中包括正向引物2.Ο μ L，反向引物.2.Ο μ L，10mM的dNTPs加入體積1 μ L，10 X緩沖液5 μ L，Dream Taq聚合酶0.5 μ L，模板質(zhì)粒pDTGl為1 μ L，去離子水38.5 μ L，該步驟的熱循環(huán)條件分別為:95°C預(yù)變性3min ；95°C變性30s ;57-60°C退火30s ;72°C延伸6min ;共35個循環(huán)；72°C最后延伸lOmin，最后保持在 4。。。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟3)包括以下步驟:3-1)運用 Gibson—步恒溫法(One-step isothermal DNA assembly)實現(xiàn) DNA 重組、3-2) PCR產(chǎn)物的檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟3-1)的Gibson反應(yīng)體系為20 μ L，其中5X恒溫重組混合物(ISA mastermixture) 15 μ L，載體質(zhì)粒pWH1274的PCR產(chǎn)物與萘降解基因的PCR產(chǎn)物濃度均為10-100ng/ μ L，載體pWH1274的PCR產(chǎn)物與萘降解基因的PCR產(chǎn)物的體積共為5 μ L，在50°C反應(yīng)一夜；其中恒溫重組混合物的組成包括:5X恒溫重組緩沖液40 μ L、0.2U/ μ L的T5外切酶4μ L、2U/y L的Phusion聚合酶2.5μ L、40U/y L的Taq DNA連接酶20 μ L以及去離子水共83.5 μ L ；其中5Χ恒溫重組緩沖液包括1Μ的ρΗ=7的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)500μ L，2M的氯化鎂(MgCl2) 25 μ LUOOmM的脫氧鳥苷三磷酸三鈉(dGTP) 10 μ LUOOmM的去氧胞苷三磷酸(dCTP)10y L、100mM的脫氧胸苷三磷酸(dTTP)10 μ L、100mM的三磷酸脫氧腺苷(dATP) 10μ L、1M 的二硫蘇糖醇(DTT) 50 μ L、聚乙二醇 8000 (PEG-8000)為 0.25 μ L、50mM的輔酶I (NAD) 100 μ L和去離子水共75 μ L，其中用于T5外切酶稀釋的緩沖液包括100%甘油10mL、lM的pH為7.5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris_HCl)為lmL、0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)4y L、1M的二硫蘇糖醇(DTT)20 μ L、1M的氯化鈉(NaCl)2 μ L、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 20 μ L和去離子水695 μ L。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的萘檢測生物細胞傳感器的制備方法，其特征在于:所述步驟4)采用電轉(zhuǎn)化實驗步驟將步驟3)得到的所述基因重組細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入步驟1)得到的宿主細胞水楊酸檢測光傳感細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的萘檢測生物細胞傳感器的使用方法，其特征在于包括以下步驟:1)將所述萘檢測生物細胞傳感器加入不同濃度的萘溶液中，記錄所述萘檢測生物細胞傳感器對于不同濃度溶液在0-6h時的發(fā)光量,得出濃度與第3h時的發(fā)光量的線性關(guān)系；2)根據(jù)上述濃度與第3h時的發(fā)光量的線性關(guān)系，根據(jù)所述萘檢測生物細胞傳感器在待測萘溶液中實際發(fā) 光量計算出待測溶液中萘的濃度。
【文檔編號】G01N21/76GK103695363SQ201310752396
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】孫寓姣, 趙曉輝, 丁愛中, 陳程, 張惠淳 申請人:北京師范大學(xué)