快速檢測生物液體中的肝細胞生長因子的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及測定樣品中生物活性HGF的存在與否或量的方法，包括(i)將樣品與第一多孔固相接觸，所述第一多孔固相包含胞外基質(zhì)或細胞膜的HGF結合組分和含有溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑組合物；和(ii)將多孔固相的顏色與樣品中生物活性HGF的存在與否或量相關聯(lián)。本發(fā)明還涉及包含第一多孔固相的裝置，所述第一多孔固相包含胞外基質(zhì)或細胞膜的至少一種HGF-結合組分和含有溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑組合物。
【專利說明】快速檢測生物液體中的肝細胞生長因子的新方法 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明屬于用于檢測生物樣品中的生長因子如肝細胞生長因子（HGF)存在的產(chǎn) 品的【技術領域】。本發(fā)明還涉及實施這類方法的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 肝細胞生長因子（HGF)是一種獨特的生長因子，其與其他已知的多肽有絲分裂原 不相關。其是在間充質(zhì)細胞（如肺巨噬細胞和成纖維細胞）、肝臟中的庫普弗（Kupffer)細 胞，以及白細胞中表達的一種蛋白質(zhì)。HGF響應細胞損傷而分泌并且似乎對于某些器官的再 生和創(chuàng)傷愈合很重要。其為異二聚體，具有二硫鍵結合的分別為約60和30kDa的重鏈和輕 鏈，其首先以非活性的前體形式合成。在受損傷的器官中，前體由特定的激活劑切割成活性 蛋白。HGF以旁分泌形式起作用（即其影響相鄰的細胞），并以內(nèi)分泌形式起作用（即，其 具有長距離）。HGF的靶細胞是完全發(fā)育的上皮細胞。HGF在器官損傷的位點處以高濃度產(chǎn) 生并存在。
[0004] 已經(jīng)研究了各種感染性疾病中HGF的全身和局部產(chǎn)生，并且在急性感染疾?。ㄈ?胃腸炎、膿毒、肺炎、皮膚和軟組織感染以及腎盂腎炎）中觀察到了高血清HGF濃度。在增 強的全身性產(chǎn)生HGF的同時，已在腦膜炎期間的腦脊液中發(fā)現(xiàn)高HGF濃度。肺炎患者的呼 出氣冷凝物中升高的HGF濃度（其與血清HGF水平無關）表明在肺炎期間局部產(chǎn)生HGF。 此外，已經(jīng)研究了血清中HGF的穩(wěn)定性，并且已發(fā)現(xiàn)HGF在稀釋的糞便樣品中非常穩(wěn)定，并 且?guī)状蝺鋈谘h(huán)、不同的緩沖液或在20°C下儲存幾年并不顯著影響糞便HGF濃度。已顯示 腹瀉期間糞便中高量的HGF可能表示患者患有可傳染的胃腸炎。另外，已顯示在感染性疾 病中監(jiān)測治療前和治療后的HGF水平有可能在早期揭示治療失敗。
[0005] 對建議療法之間的臨床重要性和差異的識別、身體中炎性紊亂之間的不同診斷已 經(jīng)成為幾類研究的目標。一個主要的臨床問題是確定感染或其他炎性紊亂是否引起疾病。 醫(yī)生通常采用幾種標志物來建立正確的診斷，如顯微鏡分析和體液的培養(yǎng)、白細胞計數(shù)、 C-反應性蛋白、血漿原降鈣素和乳酸鹽。然而，仍然沒有可使用的金標準。在治療腸內(nèi)炎癥 紊亂，潰瘍，關節(jié)病，CNS病癥，腹腔、胸腔和心包積水等時，在正確診斷的建立中每天都會產(chǎn) 生問題。常規(guī)標記物（如CRP和WBC)的量可能在幾種紊亂中很高，并且盡管存在感染，培 養(yǎng)物并不總是陽性的。在PCT申請PCT/SE2001/001831中討論了高量的HGF及其在感染性 疾病的診斷和預后中的應用。但在這些研究中，通過ELISA方法來確定體液中HGF的總量。 已經(jīng)報道了各種關于HGF的研究。一些研究已經(jīng)使用血漿/血清和尿中HGF的測定來診斷 和篩選疾病，如急性腎功能缺陷、心肌梗塞、膀胱癌、急性胰腺炎和急性及慢性肺病。出于該 原因，已經(jīng)使用了之前描述的方法，如ELISA和Western印跡。在炎性病癥期間檢測到高量 的細胞因子并不是唯一發(fā)現(xiàn)。然而，在一些情況中，已發(fā)現(xiàn)HGF的測定是靈敏的方法，其可 以比常規(guī)方法更容易地檢測到特定的臨床問題（PCT申請PCT/SE2001/001831)。
[0006] 之前描述的方法（如ELISA和Western印跡）基于樣品中的HGF和特異性結合HGF 的抗體之間的相互作用。在ELISA中，測定HGF單鏈和雙鏈的量。通過Western-印跡，通 過檢測樣品中存在的表觀分子量來確定體液中HGF的質(zhì)量。然而，該方法是繁瑣且費力的。
[0007] 生物傳感器的創(chuàng)新應用在該分析領域中是有用、便宜并且快速的?？梢允褂帽砻?等離子共振技術（：8丨八(：〇1^6 1<)來檢測糞便中的邪？(102005/031365)。該技術能夠在單 次運行中檢測HGF水平和質(zhì)量。
[0008] W02010/151222描述了測定樣品中生物活性或無活性HGF的存在與否或量的方 法，包括將樣品與包含胞外基質(zhì)或細胞膜的HGF結合組分的凝膠接觸，向凝膠添加甲苯胺 藍，和將凝膠和/或與該凝膠接觸的液體的顏色與樣品中生物活性HGF的存在與否或量相 關聯(lián)。
[0009] -在感染的情況中：在不同的器官中，在感染位點處HGF的水平局部增高?？梢酝?過ELISA檢測總蛋白量。使用Biacore技術，檢測到單克隆、多克隆抗體與HGF以及固定于 芯片上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG)的相互作用（信號）的水平較高，并且其與ELISA 所得的結果正相關。
[0010] -在慢性炎癥的情況中：盡管可能通過ELISA發(fā)現(xiàn)樣品中高量的HGF，但是觀察到 ELISA和通過Biacore所得的結果之間的非顯著相關性。可能由Biacore檢測到無信號或 非常低的信號，其顯示與配體的弱相互作用。與c-met原癌基因受體可能具有高相互作用， 并且該信號與固定化的水平正相關。在HSPG通道中有低信號率。在分析前至少10分鐘向 樣品添加 HSPG或硫酸葡聚糖可能并不減少HSPG通道中的信號。該蛋白質(zhì)可能是無生物活 性的。
[0011] 方法（平臺）
[0012] -內(nèi)在機制
[0013] 受傷期間產(chǎn)生的生長因子和細胞因子（如肝細胞生長因子）以內(nèi)分泌方式釋放并 且通過相鄰的間充質(zhì)細胞局部產(chǎn)生。該蛋白質(zhì)與高親和力細胞結合特異性受體相互作用并 且向細胞內(nèi)傳送信號導致受傷器官的再生。在HGF的情況中，需要細胞膜和胞外基質(zhì)（ECM) 上的非特異性受體來捕獲細胞因子并且使其可及于特定的受體（c-Met受體）。因此，顯示 對HSPG或其他蛋白氨基聚糖（proteoaminoglycan)無親和性的HGF的變體沒有在釋放后 被ECM捕獲并且可能不與特定受體相互作用。因此，該蛋白質(zhì)可以無活性方式起作用，盡管 其對c-Met受體有高親和性。
[0014] 在我們之前的工作中，我們已經(jīng)通過SDS_page、Western印跡、ELISA和SPR研究了 HGF，并且顯示不與蛋白氨基聚糖（HSPG，硫酸乙酰肝素）或硫酸葡聚糖結合的HGF蛋白（內(nèi) 源或重組）在用于我們研究組的體內(nèi)（毛發(fā)生長小鼠）或體外生物活性方法（CCL-53. 1細 胞）時沒有生物學效果。我們已經(jīng)觀察到與慢性炎癥相比患有急性感染的患者在SPR方法 中與HSPG的結合親和性上具有差異。我們的初步結論是在患有慢性炎癥的患者中，高等級 的細胞因子（如HGF)是無活性的，因此他們可能需要外源性生物活性的HGF來刺激再生。 例如，使用外源性HGF的治療已經(jīng)顯示出有益于治療一些慢性腿部潰瘍的病例（PCT申請 PCT/SE2001/001831)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HGF通過在體外改變細胞的細胞骨架結構來增強健康相鄰 皮膚上皮細胞向受傷區(qū)域的遷移。在患有慢性潰瘍的患者的潰瘍區(qū)域中觀察到met原癌基 因受體（c-met)的增強表達。用外源性HGF治療顯著減少了 c-met表達。從潰瘍分泌的生 物活性內(nèi)源性HGF濃度和met原癌基因受體（c-met)表達之間存在負相關。在具有低量內(nèi) 源性HGF和高met原癌基因受體（c-met)表達的患者中用外源性HGF治療引起血管增殖和 潰瘍面積減少。這種皮膚器官損傷模型和相關事件在其他器官組織中也可能存在。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 在第一方面，本發(fā)明涉及檢測樣品中生物活性HGF存在與否的方法，所述方法包 括將含有HGF的樣品與其上固定有胞外基質(zhì)（ECM)或細胞膜的至少一種HGF-結合組分（如 蛋白氨基聚糖或葡糖胺聚糖）的多孔固相以及包含溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑 組合物接觸。
[0017] 在第二方面，本發(fā)明涉及一種包含多孔固相的裝置，所述多孔固相具有固定于其 上的胞外基質(zhì)（ECM)或細胞膜的至少一種HGF結合組分（如蛋白氨基聚糖或葡糖胺聚糖） 和含有溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑組合物。
[0018] 附圖簡要說明
[0019] 圖1 :根據(jù)糞便pH的死亡率增加的柱狀圖
[0020] 定義和縮寫
[0021] HGF的質(zhì)量指示HGF結合至胞外基質(zhì)并在體內(nèi)發(fā)揮其生物效果的能力。
[0022] HGF表不肝細胞生長因子，也稱為分散因子。
[0023] ECM表示胞外基質(zhì)。
[0024] HSPG表示硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
[0025] MQ，或Milli-Q是指已經(jīng)高度純化或去離子化的水。
[0026] PBS是指磷酸鹽緩沖鹽水。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 生物活性形式的肝細胞生長因子對蛋白氨基聚糖（如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG)和硫酸葡聚糖）具有高親和性。這種親和性類似于生長因子在與其膜結合受體發(fā)生 相互作用之前與細胞膜結合。
[0029] 在本發(fā)明的以下方面和實施方式中利用這種親和性?；诶弥皝碜許PR方法 的觀察的結果（顯示對ECM組分具有高親和性的細胞因子在急性感染中釋放），發(fā)明人通過 在基本固相基質(zhì)（如纖維素）中加入一定量的蛋白氨基聚糖制備了平臺。然后通過在包括 溴麝香草酚藍，季銨化合物和/或甲基紅的指示劑存在下的顏色變化觀察蛋白質(zhì)對蛋白氨 基聚糖的親和性。
[0030] 本發(fā)明使用含有胞外基質(zhì)或細胞膜的HGF結合組分（優(yōu)選硫酸葡聚糖或HSPG)的 墊料相（pad phase)。該墊料由多孔固相制成，如纖維素、硝酸纖維素或紙。目前優(yōu)選的多 孔固相是具有1?加載容量的厚纖維素基濾紙和中等截留濾紙598Schleicher & Schull (施 萊些許爾公司）。目前優(yōu)選如下配方：
[0031] 用內(nèi)含0· 4%季銨化合物（默克公司（Merck))和0· 1 %溴麝香草酚藍（Panreac) 的甲醇溶液浸漬多孔固相。通過添加0.5%涂覆穩(wěn)定劑（阿科斯公司（Acros))將所有的化 學物固定于纖維素基質(zhì)。在熱空氣流中使固相干燥。
[0032] 之后，多孔固相用由去離子蒸餾水（MQ)中0. ImM硫酸葡聚糖（伏路卡公司 (Fluka))組成的溶液浸泡5-10秒并在熱空氣流中干燥。
[0033] 在一個實施方式中，還制備用作pH指示劑的第二固相。用內(nèi)含0.02%甲基紅（默 克公司）、0· 4%季銨化合物（默克公司）和0· 1%溴麝香草酚藍（Panreac)的甲醇溶液浸 漬第二固體多孔固相。通過添加〇. 5%涂覆穩(wěn)定劑（阿科斯公司）將所有的化學物固定于 纖維素基質(zhì)。在熱空氣流中使第二固相干燥。該第二多孔固相優(yōu)選不含胞外基質(zhì)或細胞膜 的HGF結合組分。
[0034] 包含蛋白氨基聚糖和指示劑組合物的第一多孔固相和任選地用作pH指示劑的第 二多孔固相可以在雙側粘合紙上固定并且被固定在固體支持物（如塑料帶）上，隨后切割 成具有適用尺寸的試條，如寬度為6mm。
[0035] 在實踐中，為了便于實施，將菌環(huán)刷上的糞便轉移至0.5ml的稀釋緩沖液（0. IM PBS pH 7.4)或水（優(yōu)選MQ)中，并且將包含固定在固體支持物上的多孔固相的測試條浸 入該溶液中。當測試條浸入含有HGF的溶液中時，根據(jù)分析物的量，HGF與其偶聯(lián)物或受體 (例如硫酸葡聚糖）特異性地發(fā)生反應，從而所述試條的顏色從黃色變?yōu)楦鞣N可觀察強度 的綠色至海藍色。
[0036] 也可使用胞外基質(zhì)的其他組分（葡糖胺聚糖），但是硫酸葡聚糖價格上更便宜并 且顯示相似的結果。
[0037] 本發(fā)明涉及一種方法，所述方法包括將試條浸入生物樣品或由緩沖液稀釋的樣品 中，優(yōu)選PBS 0· 5M-0. 15M，pH 6. 00-8. 00,或水（優(yōu)選MQ)稀釋，從而試生物活性的HGF與 硫酸葡聚糖相連。
[0038] 通過在棉紙上輕拍來去除試條邊緣上的殘余樣品液滴。硫酸葡聚糖和指示劑之間 的相互作用使墊料的顏色從黃色變?yōu)榫G色光譜到深藍色，作為HGF存在的陽性信號。
[0039] 在多孔固相介質(zhì)中存在指示劑的情況下，在生物活性的HGF和硫酸葡聚糖之間存 在特異性相互作用。由于樣品含有與硫酸葡聚糖結合的生物活性HGF，多孔固相的顏色改 變。
[0040] 綠色的強度取決于HGF與硫酸葡聚糖的親和性，以及多孔固相中封閉的H+離子。
[0041] 可以通過使用標準方法例如定量ELISA方法來比較性地檢測HGF，以確定觀察到 綠色強度的多孔固相中的HGF的量。任選地，使用一種或多種已知HGF含量的參比溶液來 評估反應結果?？梢允褂藐幮詤⒈龋ɡ?，水或PBS)。陽性參比可以是已知HGF含量的健 康體液樣品或含有HGF的廣品。
[0042] 對于一些樣品（如包括尿和糞便的排泄物）的分析，除了生物活性HGF的存在與 否或量以外，還對分析樣品的PH感興趣。如上所述，第二多孔固相用作pH指示劑，并且因 此優(yōu)選被引入采用這類樣品的方法和裝置中。
[0043] 通過本發(fā)明的方法，能夠快速區(qū)分急性炎癥（如器官中的細菌性感染）與慢性炎 癥。
[0044] 本發(fā)明的方法和產(chǎn)品可用于分析以下內(nèi)容：
[0045]-關節(jié)中的膿毒性關節(jié)炎與非膿毒性或反應性關節(jié)炎之間的差異 [0046]-急性可傳染的胃腸炎與慢性炎性腸疾病或其他腹瀉原因之間的差異 [0047]-腦脊液中急性膿毒性腦膜炎與非特異性腦脊液細胞增多之間的差異 [0048]-急性腎機能不全和腎盂腎炎與遠端尿道感染和慢性腎損傷之間的差異
[0049] -肺炎與慢性阻塞性肺部疾病在呼出氣冷凝物中的差異
[0050] -胸腔積液和腹水中的膿毒性炎癥與非膿毒性炎癥的差異
[0051] -血清和血漿中HGF的存在
[0052] -唾液中HGF的存在
[0053] -醫(yī)藥和血液產(chǎn)品中生物活性HGF的標準評價。
[0054] -對抗生素治療的監(jiān)測。
[0055] -在疾病中定位感染灶點 實施例
[0056] 按照本發(fā)明開發(fā)了具有用于檢測對HSPG的親和性和pH的兩個表面的測試條。在 這個實施例中，已經(jīng)評價試條測試來從其它腹瀉原因識別感染性胃腸炎。在幾種慢性炎性 疾病的檢測中，評價了一組患有SIRS的患者中糞便pH與存活的相關性和測試結果與糞便 鈣衛(wèi)蛋白的相關性。在2011年到我們的病房中入院和出院的患者材料中回顧性地評價常 規(guī)微生物方法鑒定感染性胃腸炎的靈敏度。
[0057] 研究群體
[0058] 該研究中包括從健康機構檢索到的瑞典東約特蘭的腸紊亂為病因的所有患者的 糞便樣品。沒有排除標準。樣品立即被編號并且未經(jīng)鑒定。在收集后48小時內(nèi)，在得到培 養(yǎng)物或PCR結果之前通過試條測試對2012年3月3日和8月3日之間從健康護理中心檢 索到的患者（η = 140)或在林雪平的大學醫(yī)院、北雪平和穆塔拉的鄉(xiāng)村醫(yī)院入院的患者（η =305)總共445份糞便樣品（10-99,中值70歲，243名女性）進行分析。各病房的主治醫(yī) 師進行診斷操作和治療。從而，對患者進行參比測試。另外包括來自健康志愿者（9-73,中 值53歲，17名女性）的27個培養(yǎng)物陰性糞便樣品（也包括在之前的研究中）。將-20°C冷 凍保存的證實感染的另外64份在2003 (η = 16)、2009 (η = 20)和2011 (η = 28)年收集的 糞便樣品再解凍并對其進行回顧性分析。將2011年從健康中心送到生物化學系用于半定 量的糞便鈣衛(wèi)蛋白測試并且自此在_20°C下冷凍保存的總共85份來自慢性腹瀉患者的樣 品再解凍并分析。
[0059] 項目領導人研究了患者-日志并且記錄了試條測試的結果和病史。文件每天更新 并且因此記錄了常規(guī)測試、X-射線、內(nèi)窺鏡過程和患者出院之前的最終診斷。患者在納入 后隨訪至多一年供于最終診斷和結果。在未鑒定的研究中包括未患有腹瀉的志愿者的糞便 樣品。林雪平的倫理委員會批準了該研究方案。
[0060] 試驗完成和結果解釋
[0061] 在分析前，糞便在室溫下存放15分鐘。封閉的微刷（micro-brush)浸泡在Milli Q水中，然后浸入糞便中10秒，然后微刷在試條墊上擦拭并且在60秒內(nèi)觀察顏色變化并與 CMYK 比色表比較（Klasner 等，Anal Bioanl Chem，2010 年 7 月；397 (5) 1821-1829)。
[0062] 試條測試的再現(xiàn)性
[0063] 為了控制制備中方法差異，10個樣品用不同的批次分析10次。也用陰性和陽性對 照來測試來自各批次的20個試條。每天在分析樣品之前也使用陽性和陰性對照。糞便樣 品一式兩份地進行分析。
[0064] 參比測試
[0065] 在林雪平的大學醫(yī)院中以常規(guī)測試形式進行糞便檢驗，該糞便檢驗通過顯微鏡（η =52)、病毒（杯狀病毒PCR，用ELISA檢測輪狀病毒和腺病毒抗原，η = 90)和細菌培養(yǎng)的 方法（η = 170)以及血清學和毒素鑒定技術（艱難梭菌（Clostridium difficile)毒素 ，η =431)、半定量鈣衛(wèi)蛋白（η = 85,在2011年收集的新鮮糞便樣品上進行）和糞便血紅蛋 白（η = 30)檢測方法組合進行?？梢愿鶕?jù)指示采用多種X-射線和內(nèi)窺鏡技術。對所有的 糞便樣品進行試條測試。然而，在得到參比測試的結果之前觀察并記錄條測試的結果。 [0066] 外部驗證
[0067] 為了對測試進行客觀的評價，將林雪平傳染病科入院的患者的新鮮糞便上進行的 試條測試的結果立即記錄在研究數(shù)據(jù)庫和數(shù)字患者日志（COSMIC)中并且標注日期和時 間。請外部評價員研究測試結果和最終結果以評價測試在病例（η = 30)中的靈敏度。 [0068] 對2011年診斷患感染性胃腸炎的病例的回顧性研究
[0069] 2011年在林雪平傳染病科被診斷為感染性胃腸炎而入院和出院的181名患者中， 對其醫(yī)學日志進行了回顧性研究并且在2012年評價了傳統(tǒng)微生物測試的靈敏度（表3)。 進行了針對沙門菌（Salmonella)、志賀氏菌（Shigella)和彎曲桿菌（Campylobacter)的 總共187次糞便培養(yǎng)、針對梭菌（Clostridium)分型的7次糞便培養(yǎng)、針對EHEC的23次糞 便培養(yǎng)、123次杯狀病毒PCR和105次輪狀病毒+腸道病毒ELISA以及51次糞便寄生蟲分 析。
[0070] 統(tǒng)計
[0071] 使用Graphpad prism 5版進行對相關性的回歸分析。計算了測試結果的特異度 (真陰性的數(shù)目/真陰性的數(shù)目+假陽性的數(shù)目）、靈敏度（真陽性的數(shù)目/真陽性的數(shù)目 +假陰性的數(shù)目）、陽性預測值（PPV =真陽性/真陽性+假陽性）、陰性預測值（NPV =真陰 性/真陰性+假陰性）和精確性（真陽性+真陰性/真陽性+真陰性+假陽性+假陰性）。 對糞便PH和死亡率使用克-瓦二氏、曼-惠特尼和費舍爾精確檢驗并且使用雙向邏輯回歸 Mini tab 16來比較試條測試和半定量糞便I丐衛(wèi)蛋白測試。
[0072] 結果
[0073] 亞組
[0074] -感染性胃腸炎：在總共173個病例中，糞便檢測揭示陽性培養(yǎng)物（沙門菌η = 6,彎曲桿菌η = 15和艱難梭菌η = 113)，病毒診斷（杯狀病毒η = 23,輪狀病毒η = 12和腺病毒η = 1)，寄生蟲（曼氏血吸蟲（Schistosomia mansoni)n = 1和人芽囊原蟲 (Blastocystis homonis) η = 3)。在34個病例中，高度疑似有艱難梭菌感染但是未通過培 養(yǎng)物證明。用針對艱難梭菌感染的藥物對患者進行了有效的治療。因此，患有感染性胃腸炎 的亞組207份糞便樣品組成（表1)。在133例細菌感染中有9例試條測試呈陰性￠. 7% )。 在病毒性胃腸炎中假陰性結果的頻率更高（36個病例中有6例=16% )。病史查閱表明若 樣品在腹瀉發(fā)作的前兩天內(nèi)收集，則沒有在患有病毒性胃腸炎的病例中發(fā)現(xiàn)假陰性結果。 在急性腹瀉癥狀已經(jīng)消退但是常規(guī)測試表示為陽性結果的9個病例中，試條測試呈陰性。 認為該組是攜帶者并且將其從統(tǒng)計學計算中省去。
[0075] -非感染性病例：在172個病例中，排除了以腸為感染灶點的病例。該組由常 規(guī)測試為陰性并且腹瀉被認為是其他疾?。é?= 123)或IBD(n = 36)過程的副癥狀 (bi-symptom)的病例組成。在該亞組的總共199個病例（包括健康志愿者η = 27)中，有 13個病例的試條測試呈陽性（表1)。
[0076] -SIRS :在40個病例中觀察到伴隨多重器官功能缺陷和/或SIRS的膿毒過程中的 腹瀉。在這組中，疑似有一般炎癥和器官功能缺陷。
[0077] -疑似感染/不明確的：在81名患者中，常規(guī)測試表明沒有感染。病史和/或診 斷過程不完整或無法獲得，因此不能確定腹瀉的原因。然而，疑似在伴有感染的流行病學史 或之前的培養(yǎng)物的病例中有感染性胃腸炎。該組并不包括在統(tǒng)計學分析內(nèi)，因為診斷沒有 經(jīng)過客觀檢驗。
[0078] 估計
[0079] -在經(jīng)檢驗的感染性胃腸炎（η = 207),以及進而包括患有IBD的患者、患有其他 全身性疾病的患者和健康的非感染性病例（η = 199)的組中計算靈敏度、特異度、陽性預測 值和陰性預測值以及精確性。如表2所示，試條測試可以92. 2%的靈敏度，93. 5%的特異 度，93. 6%的陽性預測值和92. 1%的陰性預測值來區(qū)分急性感染性胃腸炎。測試的精確性 為 92. 9%。
[0080] -在由感染性胃腸炎（η = 38)、非感染性腹瀉（η = 34)和膿毒/SIRS (η = 38)組 成的三組中計算pH對死亡率的影響。使用試條測試來測試糞便pH并且使用比色表標尺記 錄。與非感染性胃腸炎相比，膿毒/SIRS組中的pH和死亡率明顯較高（P < 0. 05)(使用 克-瓦二氏、曼-惠特尼和費舍爾精確檢驗進行統(tǒng)計學分析）（圖1)。
[0081] -在求醫(yī)于健康護理中心的患有腸紊亂的85個病例中評價試條測試和糞便鈣衛(wèi) 蛋白結果之間的相關性。這些病例都沒有患急性胃腸炎并且常規(guī)測試的結果是陰性的。在 1年后檢查病史以研究后果。在該選定的患有慢性腸紊亂的材料中，糞便鈣衛(wèi)蛋白顯示出 與嚴重腸疾病的顯著相關性（雙向邏輯回歸Minitab 16p < 0. 01)，其具有高陰性預測值 (NPV = 0. 92)，當在樣品材料中同時控制鈣衛(wèi)蛋白和Dexact-f時，其沒有差別。同時控制 糞便鈣衛(wèi)蛋白和Dexact-f能在診斷過程（CT掃描、陰道鏡檢和病理診斷）揭示紊亂的性質(zhì) 之前以14/19病例從良性的那些區(qū)分嚴重的慢性腸疾病。因此，陽性Dexact-f對腸的急性 炎癥診斷起作用，并且陰性糞便鈣衛(wèi)蛋白對排除慢性炎癥起作用（表2)。
[0082] -沒有發(fā)現(xiàn)試條測試的結果與糞便中血液存在之間的顯著相關性（R2 = 0. 08)。
[0083] -沒有觀察到相同或不同批次的試條測試之間的顯著差異。
[0084] -在來自2011年的材料中常規(guī)微生物診斷方法鑒定感染性胃腸炎的靈敏度為 59%。研究日志和最終后果表明在輪狀病毒胃腸炎中，錯誤診斷的風險最小且抗生素的過 量使用最少。在40-70歲的中年患者并且尤其是在患有細菌性胃腸炎的組中，出現(xiàn)最多的 抗生素過量使用。觀察到4例雙重感染并且觀察到1例寄生蟲感染（鞭毛蟲（Giardia))。
[0085] 討論
[0086] 糞便pH的測定給出了關于腸中離子交換的重要信息（Bachmann 0等，Acta Physiol(Oxf). 2011年1月；201(1) :33-46)。該信息已經(jīng)被用作診斷一些腸感染的非特異 性方法。最近,提出了該方法用于預測嚴重疾病患者的后果（OsukaA等，Crit Care. 2012年 7月10日；16(4) :R119)。由于患者具有一般炎癥響應的事實；嚴重外傷和/或膿毒的過程 中的SIRS在腸中生成大量HGF和高糞便pH (文章已接收），我們假設同時檢測糞便中的HGF 和PH可能會提高試條測試在腸的急性炎癥診斷中的靈敏度。我們觀察到，與非感染性病例 和健康者相比，患有感染性胃腸炎的患者有較高的pH。然而，在患有嚴重結腸炎和SIRS的 病例中觀察到糞便PH > 8. 0,這進而顯示出顯著增加的死亡率。因此，陽性試條測試和pH < 8.0的結合可指示需要補液的自限性感染性胃腸炎。另一方面，高度陽性的試條測試和 pH > 8. 0-9. 0可預示嚴重的結腸炎敗血癥或其他嚴重的疾病，其中經(jīng)驗性的寬范圍抗生素 治療可能是有益的。這可導致更少但是更直接的抗生素使用。
[0087] 鈣衛(wèi)蛋白是一種炎癥期間在腸中表達的蛋白質(zhì)。糞便中存在高水平的鈣衛(wèi)蛋白表 明有炎性過程。雖然該測試具有高陰性預測值，并不能通過糞便中鈣衛(wèi)蛋白的存在來從慢 性炎性腸病中鑒定急性疾?。↘ostakis ID等，Dig Dis Sci. 2012年8月17日和J Chen CC等，Pediatr Gastroenterol Nutr. 2012年6月13日）。在最近的研究中，我們已經(jīng)顯 示HGF在腸中的急性炎癥位點處而不在慢性炎癥區(qū)域高度表達（文章已接收）并且糞便中 的高HGF水平可能表明腸中的急性炎性過程，如處于感染過程中。在患有腸紊亂的門診患 者組中，在新鮮的樣品上測定糞便鈣衛(wèi)蛋白。這種選定的材料由如此病例組成，其中基于之 前根據(jù)這種測試的指示的記錄選擇糞便鈣衛(wèi)蛋白的對照并且疑似未發(fā)現(xiàn)感染性胃腸炎。隨 訪該患者組一年并且記錄最終的結果。由試條測試對新鮮的材料（文章已接收）和再解凍 的糞便進行半定量測試。結果與其他研究一致，證明了糞便鈣衛(wèi)蛋白的陰性預測值排除了 嚴重的慢性腸疾病。然而，在由85名患者組成的我們的材料中，高糞便鈣衛(wèi)蛋白和陰性試 條測試的組合能夠從11個IBD病例中鑒定出10個并且從4個患有結腸癌的病例中鑒定出 3個（表2)。
[0088] 如之前研究所不（Nayeri F 等，Scand J Clin LabInvest. 2004 ;64 (6) :589-97), HGF在糞便中非常穩(wěn)定。我們觀察到，甚至再解凍的樣品也可以用于試條測試。然而，從疾 病活躍階段的糞便中取樣是重要的，雖然在病毒性胃腸炎中在癥狀首次出現(xiàn)幾天后進行取 樣測試的病例中觀察到假陰性結果，或者
[0089] 表
【權利要求】
1. 一種測定樣品中生物活性HGF的存在與否或量的方法，所述方法包括以下步驟： -使所述樣品與第一多孔固相接觸，所述第一多孔固相包含胞外基質(zhì)或細胞膜的HGF 結合組分和含有溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑組合物；和 -將所述多孔固相的顏色與所述樣品中生物活性HGF的存在與否或量相關聯(lián)。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述裝置包含第二多孔固相，所述第二多孔 固相包含含有溴麝香草酚藍、季銨化合物和甲基紅的指示劑組合物。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述HGF結合組分是蛋白氨基聚糖或葡糖胺 聚糖。
4. 如權利要求3所述的方法或裝置，其特征在于，所述HGF結合組分是硫酸乙酰肝素蛋 白聚糖或硫酸葡聚糖。
5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品是來自患者的組織、體 液或排泄物樣品。
6. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品來自藥物產(chǎn)品。
7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于，將所述多孔固相的顏色與所述 樣品中生物活性HGF的存在與否或量相關聯(lián)包括將所述多孔固相的顏色和已與已知HGF含 量的至少一種參比溶液接觸的多孔固相的顏色做比較。
8. -種包含第一多孔固相的裝置，所述第一多孔固相包含至少一種胞外基質(zhì)或細胞膜 的HGF結合組分，和含有溴麝香草酚藍和季銨化合物的指示劑組合物。
9. 如權利要求8所述的裝置，其特征在于，所述裝置包含第二多孔固相，所述第二多孔 固相包含含有溴麝香草酚藍、季銨化合物和甲基紅的指示劑組合物。
10. 如權利要求8或9所述的裝置，其特征在于，所述HGF結合組分是蛋白氨基聚糖或 葡糖胺聚糖。
11. 如權利要求10所述的裝置，其特征在于，所述HGF結合組分是硫酸乙酰肝素蛋白聚 糖或硫酸葡聚糖。
12. 如權利要求8-11中任一項所述的裝置，其特征在于，所述多孔固相包括纖維素。
【文檔編號】G01N33/74GK104246509SQ201380014381
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權日:2012年2月22日
【發(fā)明者】F·納耶日, K·巴哈爾 申請人:豌豆屬植物研究所股份公司