Pc-o 44:4-一種用于內(nèi)臟脂肪過多的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明總體上涉及生物標(biāo)志物領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物如PC-O 44:4，其可例如用于檢測(cè)和/或定量?jī)?nèi)臟脂肪過多和/或內(nèi)臟脂肪過多的變化。該生物標(biāo)志物也可以用于診斷受試者生活方式的改變對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的影響。
【專利說明】PC-0 44:4 一一種用于內(nèi)臟脂肪過多的生物標(biāo)志物
[0001] 本發(fā)明總體上涉及生物標(biāo)志物領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物如1-0-烷 基-2-?；视土姿崮憠A（PC-0)44:4,其可例如用于檢測(cè)和/或定量?jī)?nèi)臟脂肪過多 (visceral adiposity)和/或內(nèi)臟脂肪過多的變化。這種生物標(biāo)志物也可用于診斷受試者 生活方式的改變對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的影響。
[0002] 過重和肥胖蔓延的持續(xù)攀升，尤其在兒童中的持續(xù)攀升使得解讀它們相關(guān)的基因 組和代謝組表型變成最大的公共健康挑戰(zhàn)之一。雖然營(yíng)養(yǎng)不良和肥胖，如由身體質(zhì)量指數(shù) (BMI)定義的營(yíng)養(yǎng)不良和肥胖，對(duì)預(yù)期壽命具有實(shí)質(zhì)的警示，但是顯然BMI在評(píng)估身體組成 方面具有相當(dāng)大的局限性并且對(duì)于評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)缺乏靈敏性（Dulloo, A.G.等人（2010) Int. J. Obes. (Lond)34Suppl 2，S4-17。Dullo等人最近綜述了與身體組成表型相關(guān)的健康 風(fēng)險(xiǎn)的概念的最新進(jìn)展，包括（i)將BMI分割成脂肪質(zhì)量（FM)指數(shù)（FM/H2)和無脂肪質(zhì)量 (FFM)指數(shù)（FFM/H2)，（ii)將FFM分割成器官質(zhì)量和骨骼肌質(zhì)量，（iii)將FM分割成有害 脂肪和保護(hù)性脂肪，和（iv)在構(gòu)成瘦體重質(zhì)量的器官/組織的內(nèi)部或者周圍的脂肪組織擴(kuò) 展和異位脂肪沉著之間的相互作用（Dulloo，A.G.等人（2010) Int. J. Obes. (Lond)34Suppl 2, S4-17)。
[0003] 在過去的數(shù)十年間，使用本領(lǐng)域技術(shù)的許多研究已經(jīng)鑒定了與脂肪貯存和肥胖相 關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子（Viguerie，N?等人（2005)Diabetologia 48,123-131 ;Viguerie， N?等人（2005)Biochimie 87,117-123 ;Sorensen，T. I?等人（2006)PLoS. Clin. Trials 1， el2 ;Klannemark，M?等人（1998)Diabetologia 41,1516-1522 ;Clement，K?等人（2007) J. Intern. Med. 262,422-430)，與基因可遺傳性相關(guān)的基因和轉(zhuǎn)錄因子（Teran-Garcia， M?等人（2007)Appl.Physiol Nutr.Metab 32,89-114)，并且已經(jīng)提出人腸道微生物群對(duì) 肥胖發(fā)生率的影響（Backhed，F(xiàn)?等人（2007)Proc. Natl. Acad. Sci.U.S. A 104,979-984; Ley, R?等人（2006)Nature444,1022-1023 ;Turnbaugh，P?等人（2006)Nature 444， 1027-1031)。
[0004] 但是，在相似的致肥環(huán)境和致糖尿病環(huán)境下，許多個(gè)體仍保持代謝健康和抵抗肥 胖相關(guān)的心血管疾病（CVD)風(fēng)險(xiǎn)。除了意識(shí)到與肥胖相關(guān)的疾病風(fēng)險(xiǎn)可能不是一律相同的 之外（Wildman，R.P.等人（2008) Arch. Intern. Med. 168,1617-1624)，越來越多數(shù)量的具有 正常體重的個(gè)體（身體質(zhì)量指數(shù)，BMK25)表現(xiàn)出以前認(rèn)為是過重和肥胖狀態(tài)特有的心代 謝異常。最近的證據(jù)表明了區(qū)域特異的（regio-specific)身體組成如何可能決定針對(duì)代謝 疾病的個(gè)體素質(zhì)，其中身體脂肪和特別地內(nèi)臟脂肪分布與心代謝疾病、糖尿病、高血壓、非 酒精的脂肪肝疾病和致死性的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
[0005] 臨床上使用腰和臀測(cè)量監(jiān)測(cè)內(nèi)臟脂肪過多（例如，男人>0.9 ;和女人>0.85)，但是 這具有類似的局限性，尤其是在肥胖群體中。金標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)，包括磁共振成像（MRI)和計(jì) 算機(jī)斷層掃描（CT)，現(xiàn)在對(duì)內(nèi)臟脂肪庫(kù)產(chǎn)生了區(qū)域特異的和高精確的定量。但是，由于缺乏 非侵入性的、快速和可靠的生物標(biāo)志物能用于流行病學(xué)研究和由于常規(guī)分析方法不適用于 代謝的整體分析的局限性，評(píng)估與內(nèi)臟脂肪相關(guān)的代謝仍然特別具有挑戰(zhàn)性。
[0006] 過多的脂肪貯存在軀干部或男性樣的區(qū)域可能在代謝上比脂肪貯存在女性樣的 區(qū)域（gynoid area)更不健康，其中胰島素抗性作為一個(gè)關(guān)鍵的原因機(jī)制。因此，患者層次 化對(duì)于個(gè)性化營(yíng)養(yǎng)和治療管理是必須的，但是當(dāng)受試者具有相似的腰臀比和獲得成像設(shè)施 受限時(shí)，這個(gè)應(yīng)用受到了挑戰(zhàn)。因此，迫切需要允許以簡(jiǎn)單和可靠的方式評(píng)估內(nèi)臟脂肪的存 在、與內(nèi)臟脂肪相關(guān)的代謝和/或其中的變化的生物標(biāo)志物。
[0007] 本發(fā)明人致力于這種需要。
[0008] 因此，本發(fā)明的目的是改良現(xiàn)有技術(shù)并提供滿足本發(fā)明目的的和/或允許克服至 少一個(gè)當(dāng)前現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)的生物標(biāo)志物。
[0009] 為了鑒定合適的生物標(biāo)志物，發(fā)明人使用了代謝組學(xué)方法。
[0010] 當(dāng)前認(rèn)為代謝組學(xué)是表征代謝表型的一個(gè)已很好建立的體系方法，其包含多種因 素如環(huán)境、藥物、膳食、生活方式、遺傳學(xué)和微生物組因素的影響。不像表明生理學(xué)變化的潛 在可能性的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，細(xì)胞、組織和器官內(nèi)的代謝物和它們的動(dòng)力學(xué)濃 度變化代表生理學(xué)調(diào)節(jié)進(jìn)程的真正終點(diǎn)。
[0011] 近年來，基于代謝組學(xué)和脂類組學(xué)的發(fā)現(xiàn)加速了我們對(duì)疾病進(jìn)程的理解，并且將 為防止和營(yíng)養(yǎng)管理與代謝綜合征相關(guān)的亞臨床疾病提供新的途經(jīng)。
[0012] 本發(fā)明人旨在提供區(qū)域特異的身體組成的綜合的代謝表型：內(nèi)臟脂肪過多。這允 許鑒定內(nèi)臟脂肪過多特異的生物標(biāo)志物。
[0013] 在本研究中，于40個(gè)健康肥胖女人的組中使用多個(gè)代謝終點(diǎn)的測(cè)量值和使用雙 能X線吸收測(cè)量法（DXA)體內(nèi)定量身體組成和使用計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT)的腹部脂肪分布 研究了與內(nèi)臟脂肪過多相關(guān)的代謝。
[0014] 使用質(zhì)子核磁共振（:H NMR)光譜學(xué)和等離子體的靶向LC-MS/MS譜和隨時(shí)間的進(jìn) 行而收集的24小時(shí)尿樣本，發(fā)明人在具有不同內(nèi)臟脂肪沉著模式的這組充分定義的肥胖 組中鑒定了內(nèi)臟脂肪分布的新的代謝生物標(biāo)志物。
[0015] 由此，發(fā)明人已經(jīng)鑒定了新的生物標(biāo)志物PC-0 44:4.
[0016] PC-0是1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A。
[0017] 對(duì)各脂質(zhì)種類注解如下：[脂質(zhì)類型][碳原子總數(shù)]:[雙鍵總數(shù)]。例如，PC34:1 反映包含34個(gè)碳原子和1個(gè)雙鍵的磷脂酰膽堿種類。
[0018] PC-0 44:4因此是1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸膽堿44:4.
[0019] 發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)PC-0 44:4可以用作生物標(biāo)志物來檢測(cè)和/或定量?jī)?nèi)臟脂肪過多和 /或內(nèi)臟脂肪過多的變化。這種診斷方法在人或動(dòng)物體的體外實(shí)施。
[0020] 生物標(biāo)志物的這種檢測(cè)和/或定量可以在體液中實(shí)施。體液可以是例如血液，血 漿，血清或尿。
[0021] 一般地，于事先獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本實(shí)施生物標(biāo)志物的檢測(cè)和/或定 量步驟。
[0022] 內(nèi)臟脂肪也已知稱為腹部脂肪，器官脂肪或腹內(nèi)脂肪，并且定位于腹腔內(nèi)部器官 之間中。
[0023] 內(nèi)臟脂肪可以包含幾種脂肪庫(kù)（adipose depot)，包括腸系膜庫(kù)、附睪白色脂肪組 織（EWAT)和腎周庫(kù)，以及心外膜脂肪組織和圍繞肝和胃的脂肪。一般地，腹中的脂肪主要 是內(nèi)臟脂肪，通常導(dǎo)致出名的"啤酒肚"。
[0024] 過多的內(nèi)臟脂肪導(dǎo)致中心肥胖，其隨后例如與心血管疾病、2型糖尿病、胰島素抗 性或炎性疾病相關(guān)。這些是與過多的內(nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的例子。
[0025] 本發(fā)明也涉及在受試者中診斷內(nèi)臟脂肪過多的方法，包括確定事先獲自待測(cè)試的 受試者的體液樣本中的1-0-烷基-2-?；视土姿崮憠A（PC_0)44:4水平，和將受試者的 PC-0 44:4水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于對(duì)照群體同樣的體液中 的平均PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中降低的PC-0 44:4水平指示 增加的內(nèi)臟脂肪過多。
[0026] 內(nèi)臟脂肪過多可以包括腸系膜脂肪、附睪白色脂肪組織和/或腎周脂肪，以及心 外膜脂肪組織和圍繞肝和胃的脂肪。
[0027] 體液可以是例如血液、血清、血漿或尿。
[0028] 血清和/或血漿具有的優(yōu)勢(shì)是待測(cè)試的生物標(biāo)志物的信噪比尤其高。
[0029] 尿具有的優(yōu)勢(shì)是能夠非侵入地獲得體液樣本。
[0030] 不管所選擇的體液是何種，本發(fā)明的方法具有的優(yōu)勢(shì)是自受試者獲得此類體液是 一個(gè)已經(jīng)很好建立了的操作程序。
[0031] 然后在身體外于體液樣本中實(shí)施實(shí)際的診斷方法。
[0032] 能夠使用本領(lǐng)域已知的任一手段檢測(cè)和定量樣本中的PC-0 44:4水平。例如，可 以使用質(zhì)譜，如UPLC-ESI-MS/MS。也可以使用其它方法，如其它光譜法，色譜法，標(biāo)記技術(shù)， 或定量化學(xué)方法。
[0033] 理想的是，通過相同的方法測(cè)定樣本中的PC-0 44:4水平和參考值。
[0034] 預(yù)定的參考值可以基于對(duì)照群體的受試體液中的平均PC-0 44:4水平。對(duì)照群體 可以是至少3個(gè)，優(yōu)選地至少10個(gè)，更優(yōu)選地至少50個(gè)具有相似遺傳背景、年齡和平均健 康狀態(tài)的一組人。
[0035] 對(duì)照群體也可以是同一人，由此預(yù)定的參考值事先獲自同一受試者。這允許例如 直接比較當(dāng)前生活方式和之前的生活方式對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的影響，并可以直接評(píng)估改善。 [0036] 測(cè)定內(nèi)臟脂肪的脂肪過多允許得出存在內(nèi)臟脂肪的脂肪過多和獲得相關(guān)疾病的 危險(xiǎn)的結(jié)論。
[0037] 本發(fā)明的主題也涉及在受試者中診斷內(nèi)臟脂肪過多的變化的方法，包括確定事先 獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本中的PC-0 44:4水平，和將受試者的PC-0 44:4水平與 預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中降低的PC-0 44:4水平指示增加的 內(nèi)臟脂肪過多。
[0038] 這個(gè)方法允許隨著時(shí)間來跟蹤內(nèi)臟脂肪的增多或減少，并且因此允許得出進(jìn)展為 與內(nèi)臟脂肪過多相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)是上升或下降。
[0039] 這具有例如遠(yuǎn)在能夠確定內(nèi)臟脂肪實(shí)際增加或降低之前可立即獲得結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。 這對(duì)于激發(fā)旨在降低內(nèi)臟脂肪的人特別好。顯然地，減少內(nèi)臟脂肪是一項(xiàng)艱難的任務(wù)，它通 常需要加強(qiáng)鍛煉。Ohkawara等人建議，對(duì)于有效的內(nèi)臟脂肪減少，需要每周有氧鍛煉至少 10 個(gè)任務(wù)的代謝當(dāng)量（MET)-小時(shí)（Ohkawara，K?等人，（2007)，International journal of obesity (2005)31 (12):1786 - 1797)〇
[0040] 本發(fā)明也涉及在受試者中診斷生活方式的變化對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的影響的方法， 包括確定事先獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本中的PC-0 44:4水平，和將受試者的PC-0 44:4水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于之前獲自同一受試者的同樣的 體液中的PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中降低的PC-0 44:4水平指 示生活方式的變化對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的正影響。
[0041] 這個(gè)方法具有的效果是它允許監(jiān)測(cè)生活方式變化對(duì)內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的影響和對(duì)有 相關(guān)疾病危險(xiǎn)的影響。
[0042] 生活方式的變化可以是任何變化，如新的工作，不同的壓力水平，新的關(guān)系，身體 活動(dòng)的增加或減少，和/或總體健康的變化。
[0043] 例如，生活方式的變化可以是膳食的變化。
[0044] 膳食的變化可以是碳水化合物、脂類和/或蛋白質(zhì)含量的增加或減少。它可以是 例如變化為不同地區(qū)的膳食，如地中海膳食。它也可以是總熱量攝入的變化。
[0045] 因此，本發(fā)明的方法可以用來測(cè)試新的營(yíng)養(yǎng)方案、營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品和/或藥物的有效性。
[0046] 營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品可以是例如聲稱對(duì)身體脂肪、重量管理和/或內(nèi)臟脂肪具有影響的產(chǎn) 品。
[0047] 一般地，營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品可以是食物產(chǎn)品，飲料，寵物食物產(chǎn)品，食物補(bǔ)充物，營(yíng)養(yǎng)保健品 (nutraceuticals)，食物添加劑或配方營(yíng)養(yǎng)品。
[0048] 例如，膳食的變化可以是使用至少一種以前沒有消費(fèi)或者以不同量消費(fèi)的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn) 品。
[0049] 由此，本發(fā)明的方法可以用來測(cè)試新的營(yíng)養(yǎng)方案和/或營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的有效性。
[0050] PC-0 44:4可以用作用于本發(fā)明目的的唯一標(biāo)志物。
[0051] 雖然PC-0 44:4作為唯一的標(biāo)志物是有效地作為用于本發(fā)明診斷方法的工具，但 是如果診斷基于多于一種標(biāo)志物時(shí)，所述診斷的質(zhì)量和/或預(yù)測(cè)能力會(huì)提高。
[0052] 因此，用于在受試者中診斷內(nèi)臟脂肪過多和/或相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的一種或多種其它 標(biāo)志物可以與PC-0 44:4組合使用。
[0053] 發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)其它生物標(biāo)志物也能夠用于檢測(cè)診斷內(nèi)臟脂肪過多和/或相 關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)。
[0054] 由此發(fā)明人鑒定了 PC-0 44:6, PC-0 44:4, PC-0 42:4, PC-0 40:4,和 / 或 PC-0 40:3降低的體液濃度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺增加的體液濃度允許診斷內(nèi)臟脂肪量 的增加和/或增加的進(jìn)展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0055] 相反地，PC-0 44:6，PC-0 44:4，PC-0 42:4，PC-0 40:4,和 / 或 PC-0 40:3 增加的 體液濃度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺降低的體液濃度允許診斷內(nèi)臟脂肪量的降低和/ 或降低的進(jìn)展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0056] 本發(fā)明的方法因此可以進(jìn)一步包括如下步驟：測(cè)定體液樣本中至少一種其它生物 標(biāo)志物的水平，所述其它生物標(biāo)志物選自谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-044:6, PC-0 42:4， PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3,和將受試者的至少一種谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-0 44:6， PC-0 42:4, PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3的水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的 參考值基于正常健康對(duì)照群體的體液樣本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:6, PC-0 42:4，？(：-0 40:4，和/或？(：-0 40:3水平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:6，PC-0 42:4，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水平，并且其中與 預(yù)定的參考值比較體液樣本中增加的谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-0 44:6， PC-0 44:4, PC-0 42:4, PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水平指示增加的內(nèi)臟脂肪過多。
[0057] 本發(fā)明的方法可以包括評(píng)估至少2種，至少3種，至少4種，至少5種，至少6種， 或至少7種生物標(biāo)志物。
[0058] 例如，PC-0 44:4 可以與 PC-0 44:6 -起評(píng)估。
[0059] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 42:4 -起評(píng)估。
[0060] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 40:4 -起評(píng)估。
[0061] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 40:3 -起評(píng)估。
[0062] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 44:6 和 PC-0 42:4 -起評(píng)估。
[0063] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 44:6, PC-0 42:4,和 PC-0 40:4 -起評(píng)估。
[0064] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 44:6, PC-0 42:4,和 PC-0 40:3 -起評(píng)估。
[0065] PC-0 44:4 也可以與 PC-0 44:6, PC-0 42:4, PC-0 40:3,和 PC-0 40:4 -起評(píng)估。
[0066] ?〇0 44:4 也可以與？〇0 44:6，？〇0 42:4，？(：-0 40:3，？(：-0 40:4，和谷氨酰胺 一起評(píng)估。
[0067] ?〇0 44:4 也可以與？〇0 44:6，？〇0 42:4，？(：-0 40:3，？(：-0 40:4，谷氨酰胺和 酪氨酸一起評(píng)估。
[0068] 評(píng)估多于一種生物標(biāo)志物的優(yōu)勢(shì)在于：評(píng)估越多的生物標(biāo)志物，診斷將變得越可 靠。如果例如多于1，2, 3,4, 5,6,或7種生物標(biāo)志物顯示如上所述的濃度升高或降低，則內(nèi) 臟肥胖的存在或缺乏和內(nèi)臟肥胖的程度以及相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)能力更強(qiáng)。
[0069] 據(jù)此，發(fā)明人鑒定了能用于預(yù)測(cè)內(nèi)臟脂肪過多和進(jìn)展為相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的其它生 物標(biāo)志物。
[0070] 例如，發(fā)現(xiàn)了與事先獲得的相應(yīng)參考值比較，體液中濃度增加的苯丙氨酸，亮 氨酸，異亮氨酸，棕櫚酰肉堿（C16)，癸酰肉堿（C10)，辛酰肉堿（C8:l)溶血磷脂酰膽堿 (LPC)24:0,磷脂酰膽堿（PC)PC 30:0,和/或PC 34:4或體液中濃度降低的PC-0 34:1， PC-0 34:2, PC-0 36:2, PC-0 36:3, PC-0 40:6, PC-0 42:2，PC-0 42:3, PC-0 44:3, PC-0 44:5, PC 42:0,和/或PC 42:2指示增加的內(nèi)臟脂肪過多和增加的相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)。
[0071] PC是磷脂酰膽堿。LPC是溶血磷脂酰膽堿。C是?；鈮A。
[0072] 相反地，與事先獲得的相應(yīng)參考值比較，體液中濃度降低的苯丙氨酸，亮氨酸，異 亮氨酸，C10 (癸酰肉堿），C16 (棕櫚酰肉堿），C8:1 (辛酰-肉堿）LPC 24:0, PC 30:0,和/ 或？〇34:4或體液中濃度增加的？〇0 34:1，？〇0 34:2，？(：-036:2，？(：-0 36:3，？(：-0 40:6， PC-0 42:2，PC-0 42:3，PC-0 44:3，PC-0 44:5，PC 42:0,和 / 或 PC 42:2 指示降低的內(nèi)臟 脂肪過多和降低的相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)。
[0073]因此，本發(fā)明的方法還可以包括如下步驟：確定體液樣本中至少一種其它生物 標(biāo)志物的水平，所述其它生物標(biāo)志物選自苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10 (癸酰肉堿）， C16(棕櫚酰肉堿），C8:l(辛酰-肉堿），LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-0 34:1，PC-0 34:2, PC-0 36:2, PC-0 36:3, PC-0 40:6, PC-042:2, PC-0 42:3, PC-0 44:3, PC-0 44:5， PC 42:0,和/或PC 42:2,和將受試者的至少一種苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10, C16， C8:l，肉堿，LPC24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-0 34:1，PC-0 34:2, PC-0 36:2, PC-0 36:3， PC-040:6, PC-0 42:2, PC-0 42:3, PC-0 44:3, PC-0 44:5, PC 42:0,和 / 或 PC 42:2 水平 與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于正常健康對(duì)照群體體液樣本中的平均苯 丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，CIO, C16，C8:1，肉堿，LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-0 34:1， PC-0 34:2, PC-0 36:2, PC-0 36:3, PC-0 40:6, PC-0 42:2, PC-0 42:3, PC-0 44:3, PC-0 44:5, PC 42:0,和/或PC 42:2水平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的 苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10(癸酰肉堿），C16(棕櫚酰肉堿），C8:l(辛酰-肉堿）， LPC 24:0, PC 30:0, PC 34:4, PC-0 34:1，PC-0 34:2, PC-0 36:2, PC-0 36:3, PC-0 40:6， PC-042:2，PC-0 42:3，PC-0 44:3，PC-0 44:5，PC 42:0,和 / 或PC 42:2 水平，且其中與預(yù)定 的參考值比較，體液中增加的苯丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，C10, C16, C8:1，肉堿，LPC 24:0， PC 30:0,和/或PC 34:4水平和/或體液樣本中降低的PC-0 34:l，PC-0 34:2，PC-0 36:2， PC-0 36:3,PC-0 40:6,PC-0 42:2,PC-0 42:3,PC-0 44:3,PC-0 44:5,PC 42:0,和 / 或 PC 42:2水平指示增加的內(nèi)臟脂肪過多。
[0074] 增加的內(nèi)臟脂肪過多增加了進(jìn)展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0075] 因此，在本發(fā)明的方法中，內(nèi)臟脂肪過多的程度可以用作進(jìn)展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪 相關(guān)的疾病的可能性的指示。
[0076] 同樣地，內(nèi)臟脂肪過多的變化可以用作進(jìn)展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的上升 或下降的可能性的指示。
[0077] 與內(nèi)臟脂肪過多相關(guān)的疾病是例如心代謝疾病。
[0078] 因此，本發(fā)明的方法可以用來確定進(jìn)展為心代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0079] 另外，與內(nèi)臟脂肪過多相關(guān)的疾病是例如代謝失調(diào)。典型的代謝失調(diào)是隨后的肥 胖，胰島素抗性，2型糖尿病，代謝綜合征，血管疾?。ǜ哐獕?，冠心?。?，代謝肝疾病中的脂 肪肝炎，脂肪代謝障礙，肺功能障礙，炎性疾病和其它肥胖相關(guān)疾病。
[0080] 能夠?qū)θ魏问茉囌邔?shí)施本發(fā)明的方法。
[0081] 有利地，可以對(duì)有進(jìn)展為內(nèi)臟脂肪過多和/或與內(nèi)臟脂肪過多相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn) 的受試者實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0082] 例如，可以對(duì)正常的、過重的或肥胖的受試者實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0083] "過重"是對(duì)成年人定義為具有25至30之間的BMI。"身體質(zhì)量指數(shù)"或"BMI"意 指kg體重除以以米為單位的身高平方之比。"肥胖"是貯存在動(dòng)物的脂肪組織，特別是在人 和其它哺乳動(dòng)物的脂肪組織中的天然能量?jī)?chǔ)備增加至與某些健康狀況或增加的致死性相 關(guān)的點(diǎn)的狀況。"肥胖的"是對(duì)成年人定義為具有大于30的BMI。
[0084] 對(duì)于PC-0 44:4和任選地對(duì)于其它生物標(biāo)志物，參考值優(yōu)選地使用用來表征獲自 試驗(yàn)受試者的PC-0 44:4和任選地其它生物標(biāo)志物水平的相同單位測(cè)定。因此，如果PC-0 44:4和任選地其它生物標(biāo)志物的水平是如PC-0 44:4以iimol/l(iiM)所示單位的絕對(duì) 值，則參考值也是基于一般群體或基于所選擇的受試者對(duì)照群體中個(gè)體的PC-0 44:4以 ii mol/1 ( y M)所示單位。
[0085] 進(jìn)一步地，參考值能夠是單個(gè)的截止值，如中位值或均值。獲得的體液樣本中PC-0 44:4和任選地其它生物標(biāo)志物中的參考值如平均水平、中位值水平或"截止"水平可以通 過測(cè)試一般群體或所選擇的群體中大的個(gè)體樣本和使用統(tǒng)計(jì)學(xué)模型來建立，如用于選擇陽 性標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)測(cè)值方法，或定義最適特異性（最高的真陰性率）和靈敏性（最高的真陽性率） 的接收者操作特性曲線，如Knapp，R. G?和Miller，M. C. (1992)Clinical Epidemiology and Biostatistics. William 和 Wilkins,Harual Publishing Co. Malvern,Pa.所述，其在此弓I 用作為參考。
[0086] 熟練的技術(shù)人員知道如何指定正確的參考值，因?yàn)槔缢稣_的參考值隨著性 另IJ、種族、遺傳繼承、健康狀況或年齡而不同。
[0087] 作為例子，例如發(fā)明人已經(jīng)在肥胖成年人受試者和在正常成年人受試者的體液如 血漿中確定了典型的參考值。
[0088] 因此，對(duì)于肥胖受試者，預(yù)定的平均參考值可以是
[0089] 對(duì)酪氨酸約68.71 iiM體液，
[0090] 對(duì)谷氨酰胺約662. 67 ii M體液，
[0091] 對(duì) PC-0 44:6 約 1. 47 ii M 體液，
[0092] 對(duì) PC-0 44:4 約 0? 84 ii M 體液，
[0093] 對(duì) PC-0 42:4 約 1. 27 ii M 體液，
[0094] 對(duì) PC-0 40:4 約 2. 65 ii M 體液，
[0095] 對(duì) PC-0 40:3 約 1. 37 ii M 體液，
[0096] 對(duì)苯丙氨酸約52. 97 ii M體液，
[0097] 對(duì)亮氨酸+異亮氨酸約193. 56 ii M體液，
[0098] 對(duì) C10 約 0? 19iiM 體液，
[0099] 對(duì) C16 約 0? 06iiM 體液，
[0100] 對(duì) C8:1 約 0? 03 ii M 體液，
[0101] 對(duì) LPC 24:0 約 0? 25iiM 體液，
[0102] 對(duì) PC 30:0 約 4. 18 ii M 體液，
[0103] 對(duì) PC 34:4 約 1. 11 iiM 體液，
[0104] 對(duì) PC-0 34:1 約 9. 84 ii M 體液，
[0105] 對(duì) PC-0 34:2 約 11. 49iiM 體液，
[0106] 對(duì) PC-0 36:2 約 11. 79iiM 體液，
[0107] 對(duì) PC-0 36:3 約 7. 20 ii M 體液，
[0108] 對(duì) PC-0 40:6 約 3. 68 ii M 體液，
[0109] 對(duì) PC-0 42:2 約 0? 56 ii M 體液，
[0110] 對(duì) PC-0 42:3 約 0? 89 ii M 體液，
[0111] 對(duì) PC-0 44:3 約 0? 21 ii M 體液，
[0112] 對(duì) PC-0 44:5 約 2. 17 ii M 體液，
[0113] 對(duì) PC 42:0 約 0? 56 ii M 體液，
[0114] 對(duì) PC 42:2 約 0? 22iiM 體液。
[0115] 在正常受試者中，預(yù)定的平均參考值可以是
[0116] 對(duì)酪氨酸約75. 00 iiM體液，
[0117] 對(duì)谷氨酰胺約748. 27 ii M體液，
[0118] 對(duì) PC-0 44:6 約 1. 21iiM 體液，
[0119] 對(duì) PC-0 44:4 約 0? 50 ii M 體液，
[0120] 對(duì) PC-0 42:4 約 1. 12 ii M 體液，
[0121] 對(duì) PC-0 40:4 約 3. 24 ii M 體液，
[0122] 對(duì) PC-0 40:3 約 2. 10 ii M 體液，
[0123] 對(duì)苯丙氨酸約49. 17 ii M體液，
[0124] 對(duì)亮氨酸+異亮氨酸約197. 52 ii M體液，
[0125] 對(duì) C10 約 0? 29iiM 體液，
[0126] 對(duì) C16 約 0? 09iiM 體液，
[0127] 對(duì) C8:1 約 0? 04 ii M 體液，
[0128] 對(duì) LPC 24:0 約 0? 77 ii M 體液，
[0129] 對(duì) PC 30:0 約 4. 10 ii M 體液，
[0130] 對(duì) PC 34:4 約 1. 42 ii M 體液，
[0131] 對(duì) PC-0 34:1 約 8. 20 ii M 體液，
[0132] 對(duì) PC-0 34:2 約 9. 26 ii M 體液，
[0133] 對(duì) PC-0 36:2 約 12. 67 ii M 體液，
[0134] 對(duì) PC-0 36:3 約 5. 83 ii M 體液，
[0135] 對(duì) PC-0 40:6 約 4. 45 ii M 體液，
[0136] 對(duì) PC-0 42:2 約 0? 82 ii M 體液，
[0137] 對(duì) PC-0 42:3 約 1. 08 ii M 體液，
[0138] 對(duì) PC-0 44:3 約 0? 22 ii M 體液，
[0139] 對(duì) PC-0 44:5 約 1. 82 ii M 體液，
[0140] 對(duì) PC 42:0 約 0? 65 ii M 體液，
[0141] 對(duì) PC 42:2 約 0? 35iiM 體液。
[0142] 用本發(fā)明的方法待測(cè)試的受試者可以例如是人或動(dòng)物，特別地是哺乳動(dòng)物。通常 的動(dòng)物可以例如是陪伴動(dòng)物，如貓或狗或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物。
[0143] 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解他們能夠自由地組合文中所述的本發(fā)明的所有特征，且不偏 離所公開的本發(fā)明的范圍。具體而言，本發(fā)明的方法所述的特征可以應(yīng)用至其它方法和應(yīng) 用至本發(fā)明的用途且反之亦然。
[0144] 本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特征從下列實(shí)施例和附圖中是顯而易見的。
[0145] 表1顯示招募的群組的臨床特征，基于通過計(jì)算機(jī)斷層掃描測(cè)定的腹膜內(nèi)的/腹 部的脂肪比之l〇g 1(l值評(píng)估的他們的內(nèi)臟脂肪含量分級(jí)為四個(gè)四分位。值表示為平均值 (土SD)。ALAT =丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASAT =天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，BMI =身體質(zhì)量指數(shù)，GGT = Y _谷 氨酰轉(zhuǎn)肽酶，HDL-C =高密度脂蛋白膽固醇，H0MA-IR =胰島素抗性的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定模型評(píng) 估，LDL-C =低密度脂蛋白膽固醇，MAP =平均動(dòng)脈血壓，NEFAs =非酯化脂肪酸，TG =甘油 三酯。
[0146] 表2顯示基于通過計(jì)算機(jī)斷層掃描測(cè)定的腹膜內(nèi)的/腹部的脂肪比之log1(l值評(píng) 估的他們的內(nèi)臟脂肪含量，對(duì)四個(gè)四分位的每一個(gè)四分位以平均值（土SD)表示的代謝物 濃度。
[0147] 圖1顯示使用隨機(jī)森林分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)重構(gòu)4 NMR血漿譜，以鑒定與內(nèi)臟脂肪過多 相關(guān)的代謝模式（用方框鑒定）。GPCs =甘油磷脂，PUFAs =多不飽和脂肪酸，UFAs =不飽 和脂肪酸。
[0148] 圖2顯示代謝物在如通過隨機(jī)森林分析預(yù)測(cè)內(nèi)臟脂肪的脂肪過多中的重要性和 確實(shí)性。在n= 10000個(gè)隨機(jī)森林生成之后精度上合并的平均降低。較高的可變重要性對(duì) 應(yīng)于精度上合并的平均降低的較高值。
[0149] 圖3-1，3-2和3-3顯示對(duì)每一所選代謝物，高和低內(nèi)臟脂肪受試者之間的代謝物 差異。基于通過計(jì)算機(jī)斷層掃描測(cè)定的腹膜內(nèi)脂肪容量之l〇g 1(l值評(píng)估的他們的內(nèi)臟脂肪 含量，對(duì)每一四分位繪制數(shù)據(jù)，1 =四分位1，2 =四分位2, 3 =四分位3,4 =四分位4。 實(shí)施例
[0150] 受試者和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0151] 臨床試驗(yàn)是在 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV，Lausanne，瑞 士）對(duì)40個(gè)健康的肥胖白種女人進(jìn)行的觀察研究。位于CHUV的獨(dú)立的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了 該研究方案。參加者的BMI在28和40之間，年齡在25歲和45歲之間，且不顯示代謝疾病 特征（糖尿病2型，心血管疾病或代謝綜合征）。獲得的生物樣本（血漿和24小時(shí)尿樣本） 在代謝組學(xué)分析之前貯存在一 80〇C。
[0152] 身體組成評(píng)估
[0153] 進(jìn)行全身掃描，以確定腹部脂肪分布和總的身體組成。在GE Lunar iDXA系統(tǒng) (軟件版本：enCORE version 12. 10. 113)上進(jìn)行全身掃描，其中掃描模式通過該設(shè)備自動(dòng) 確定。對(duì)于DXA測(cè)量，所有受試者穿醫(yī)院服裝并摘下所有金屬物。使用GE Lunar校準(zhǔn)儀 (calibration phantom)每日校準(zhǔn)iDXA單元。經(jīng)過訓(xùn)練的操作者進(jìn)行所有的掃描，按照操 作者手冊(cè)來安置患者和獲得數(shù)據(jù)。在一小時(shí)的約定期間，對(duì)每一受試者進(jìn)行兩次全身掃描， 在兩次掃描之間重新安置患者。使用enCORE軟件（版本14. 00. 207)分析掃描。通過enCORE 軟件（自動(dòng)R0I)對(duì)全身，臂，腿，軀干部，男性樣的區(qū)域和女性樣的區(qū)域自動(dòng)確定R〇Is。有 經(jīng)驗(yàn)的DXA操作者也證實(shí)并且當(dāng)指出時(shí)重新安置R0I位置（專家R0I)。除了 iDXA掃描之 夕卜，還進(jìn)行腰和臀測(cè)定。
[0154] 在 64 多檢測(cè)項(xiàng) CT 掃描儀（VCT Lightspeed，GE Medical Systems，Milwaukee， USA)上實(shí)施CT測(cè)定。受試者以他們的臂高于他們的頭和腿的仰臥位用墊子墊高地 躺著。在L4-L5椎骨水平獲得腹部的單個(gè)掃描（10mm)，并分析脂肪組織的橫截面積 (cross-sectional area),表示為平方厘米。使用下列的獲得參數(shù)：具z軸劑量調(diào)節(jié)的 120Kv，100-200mA，和視場(chǎng)500mm。使用標(biāo)準(zhǔn)的核心重構(gòu)5mm切片厚度的軸橫斷成像。定量 方法使用半交互式的市售運(yùn)算法則在Advantage Window工作區(qū)（GE Medical Systems) 上分割皮下的和腹內(nèi)脂肪。
[0155] 臨床化學(xué)
[0156] 使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室方法測(cè)定血漿總的、HDL和LDL膽固醇，甘油三酯，尿酸，肌酸 酐，鈉和鉀濃度41^!'，纟5纟1'，661'，葡萄糖，非酯化脂肪酸，胰島素和平均動(dòng)脈血壓（嫩?）。根 據(jù)之前描述的公式（Mathews等人，1985):胰島素（iiU/mL)x葡萄糖（mmol/L)/22. 5,將胰 島素抗性狀態(tài)評(píng)估為胰島素抗性的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定模型評(píng)估（H0MA-IR)。
[0157] 樣本制備和1H-NMR光譜分析
[0158] 將肝素血漿樣本（400 y L)與200 y L氘化磷酸鹽緩沖液（KH2P04終濃度為0. 2M) 導(dǎo)入5mm NMR管。氣用作鎖物質(zhì)。在配備有倒置的5mm低溫探頭的Bruker Avance III 600MHz 光譜儀上以 300K(Bruker Biospin，Rheinstetten，德國(guó)）測(cè)定代謝譜。對(duì) 每一血漿樣本，獲得具有水壓制的標(biāo)準(zhǔn)1H-NMR-維脈沖序列（RD = 4s)，具有水壓制 的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)自旋回波序列（RD = 4s)，和編輯了擴(kuò)散的序列 (diffusion-edited sequence) (RD = 4s)。對(duì)每個(gè)一維實(shí)驗(yàn)，使用98K數(shù)據(jù)點(diǎn)收集32個(gè)掃 描。在傅立葉轉(zhuǎn)換之前使用T0PSPIN(版本2. 1，Bruker，德國(guó)）軟件包加工1H-NMR譜。對(duì) 獲得的NMR譜手工定相和基線校正，并且對(duì)于血漿譜，參照a -葡萄糖異頭質(zhì)子在S 5. 2396 的化學(xué)位移。通過匹配我們?cè)跈C(jī)構(gòu)內(nèi)研發(fā)的純化合物的NMR數(shù)據(jù)庫(kù)和使用文獻(xiàn)數(shù)據(jù) (Fan, T. W. (1996)Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy28, 161-219 ； Nicholson, J. K?等人（1995) Anal. Chem. 67, 793-811)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定代謝物的屯-匪1? 共振的分配。通過 2D 士-1!! Correlation SpectroscopY(COSY) (Hurd, R.E. (1990) J. Magn. Reson. 87, 422-428) > TOtal Correlation SpectroscopY (TOCSY) (Bax, A. &Davis (1985) J.Magn.Reson. 65, 355-360)和1H_13C Heteronuclear Single Quantum Correlation (HSQC)(Bodenhausen, G. &Ruben(1980)Chemical Physics Letters 69, 185-189) NMR技術(shù)證實(shí)代謝物身份。
[0159] 用于 Biocrates Life Sciences Absolute IDQTM 試劑盒分析的樣本制備
[0160] 如之前公開的那樣（:Rdmisdl -Margl，W.，C. Prehn, R. Bogumil, C.Rfihring, K. Suhre，J.Adamski，用于高通量靶向代謝組學(xué)的組織樣本制備和代謝物提取的方法， Metabonomics, 2011。首先在網(wǎng)上公開），將 Biocrates Life Sciences Absolute IDQTM 試劑盒用于EDTA血漿樣本。按照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行孔板制備以及樣本施加和提取。 將10 yl終體積的血漿加樣至提供的96孔板，其中含有同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)。在Dionex Ultimate 3000超高壓液體色譜（UHPLC)系統(tǒng)（Dionex AG, Olten,瑞士）上實(shí)施液相色 譜，其中所述色譜系統(tǒng)與安裝有TurboV離子源以電噴霧離子化（ESI)模式運(yùn)行的3200Q TRAP 質(zhì)譜儀（AB Sciex;Foster City，CA，USA)偶聯(lián)。使用梯度流速 0-2. 4 分鐘：30iil/ 分鐘，2. 4-2. 8分鐘：200 yl/分鐘，2. 9-3分鐘：30 yl/分鐘，通過直接輸注，注射樣本提 取物（20 yl)兩次（以正和負(fù)ESI模式）。MS源參數(shù)設(shè)置為：脫溶劑溫度（TEM) : 200°C，高 電壓：-4500V(ESI-)，5500V(ESI+)，氣簾（CUR)和霧化器（GS1 和 GS2)氣體；氮?dú)猓?0, 40， 和50psi ;分別地，氮?dú)馀鲎矚鈮海?mTorr。以計(jì)劃的反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM)進(jìn)行MS/MS獲取， 其中對(duì)于該測(cè)定試驗(yàn)中篩選的163種代謝物具有優(yōu)化的去簇電位值（potential values)。 將原始數(shù)據(jù)文件（Analyst軟件，版本1. 5. 1 ;AB Sciex, Foster City, CA, USA)輸入提供 的分析軟件MetlQ，以計(jì)算代謝物濃度?？蓮腂iocrates Life Sciences, Austria(http:// biocrates, com)獲得所有能夠檢測(cè)到的代謝物的列表。
[0161] 多變量數(shù)據(jù)分析（MVA)
[0162] 使用機(jī)構(gòu)內(nèi)研發(fā)的排除了 S 4. 68-5. 10之間的水殘留信號(hào)的MATLAB常規(guī)，在 S 0. 2-10. 0的范圍，將血漿NMR譜轉(zhuǎn)換為22K數(shù)據(jù)點(diǎn)。在化學(xué)計(jì)量分析之前，將化學(xué)位移強(qiáng) 度歸一化為特定范圍內(nèi)的所有強(qiáng)度的總和。使用軟件包SMCA-P+(版本12. 0. l，UmetriCS AB，Ume&，瑞典）和機(jī)構(gòu)內(nèi)研發(fā)的 MATLAB(The MathWorks Inc.，Natick，MA，USA)慣常 程序進(jìn)行化學(xué)計(jì)量分析。為了檢測(cè)代謝譜之間相似性的存在，使用主要組分分析（PCA) (Wold，S?等人（1987) Chemom.Intell. Lab. Syst. 2, 37-52)，隱變量投影（Projection to Latent Structures ;PLS) (Wold，S?等人（1987) PLS Meeting，F(xiàn)rankfurt)和隱變量正交 投影（Orthogonal Projection to Latent Structures ;0_PLS)(Trygg，J. &Wold (2003) J.Chemom. 17,53-64)。使用7層交叉檢驗(yàn)評(píng)估該模型的有效性（Cloarec，0?等人（2005) Anal. Chem. 77, 517-526)。從7層交叉檢驗(yàn)循環(huán)中預(yù)測(cè)的樣本建立0-PLS-DA模型的分類準(zhǔn) 確性。
[0163] 通過隨機(jī)森林法（Random Forests)，使用 'randomForest' 包（A. Liaw 和 ^町61^1'(2002)，通過隨機(jī)森林法分類和回歸，1?他￥8 2(3)，18-22)，在1?環(huán)境中運(yùn)行? Development Core Team(2011).用于統(tǒng)計(jì)學(xué)地計(jì)算機(jī)運(yùn)行的語言和環(huán)境R(R:A language and environment for statistical computing), R Foundation for Statistical Computing), Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL http://www.R-project.org/.), 分析靶向MS數(shù)據(jù)。用于驗(yàn)證的單變量顯著性檢驗(yàn)也在R中進(jìn)行。
[0164] 由于內(nèi)臟脂肪過多的非正規(guī)分布，使用下列參數(shù)用于隨后的代謝組學(xué)分析：內(nèi)臟 脂肪含量的log轉(zhuǎn)換值，腹膜內(nèi)的/皮下的脂肪比（比率1)的log轉(zhuǎn)換值，或腹膜內(nèi)的/ 腹部的脂肪比（比率2)的log轉(zhuǎn)換值。
[0165] 表1中示出了群組的人體可測(cè)量性狀和生物化學(xué)特性，基于使用CT測(cè)量的腹膜內(nèi) 的/腹部的脂肪比（比率2)的log 1(l值分類在四個(gè)四分位中（Ql-4，n = 10)。禁食后的葡 萄糖（p〈0. 10)和胰島素（p〈0. 05)，以及H0MA-IR(p〈0. 05)在具有最高的內(nèi)臟脂肪過多的受 試者中（Q4)，與（Q1)相比較而言更高。腹膜內(nèi)的/皮下的脂肪比或腹膜內(nèi)的/腹部的脂肪 比的Log轉(zhuǎn)換值優(yōu)選地用來根據(jù)受試者的內(nèi)臟脂肪過多來對(duì)他們分類，因?yàn)檫@些參數(shù)顯示 為獨(dú)立于BMI，Hipp，腰，ALAT，MAP，和量熱指數(shù)，對(duì)于腹膜內(nèi)的脂肪容積的Log轉(zhuǎn)換值而言 情況并非如此。有趣的是，在群組中，組之間的HDL，LDL，和總的膽固醇沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[0166] 為了鑒定內(nèi)臟脂肪沉著的表型特征物，使用屯-匪1?和靶向LC-MS/MS代謝組學(xué)方 法分析血漿樣本。對(duì)禁食后的血漿樣本進(jìn)行分析。收集的樣本的0PLS分析顯示血漿脂質(zhì) 和內(nèi)臟脂肪沉著之間某些細(xì)微但顯著的相關(guān)（R 2X:0. 68 ;R2Y:0. 506 ;Q2Y:0. 167)。也應(yīng)用隨 機(jī)森林分析來證實(shí)特定的血漿脂質(zhì)和內(nèi)臟脂肪狀態(tài)之間的該統(tǒng)計(jì)相關(guān)（圖1)，其表明甘油 磷脂和脂肪酸飽和模式的變化標(biāo)出的特定的血漿脂質(zhì)重新建模。
[0167] 因此，應(yīng)用靶向LC-MS/MS代謝組學(xué)來提供163種代謝物的結(jié)構(gòu)信息和定量測(cè)定 值，所述163種代謝物包括氨基酸，糖類，?；鈮A，鞘脂，和甘油磷脂。使用0PLS分析，確 定內(nèi)臟脂肪的脂肪過多的代謝標(biāo)簽是可能的（R2X:0. 29 ;R2Y:0. 68 ;Q2Y:0. 32)。
[0168] 為了選擇更堅(jiān)實(shí)的標(biāo)志物，使用了"out-of-bag"數(shù)據(jù)的％平均降低精度作為變量 的重要性特征。在這個(gè)方式中，確定根據(jù)受試者的內(nèi)臟脂肪狀態(tài)而更好地區(qū)分他們的變量 是可能的（Q1相對(duì)于Q4比較）。Ql，Q4均使用腹膜內(nèi)脂肪容積比率1和比率2的log轉(zhuǎn) 換值之一來評(píng)估。通過單獨(dú)地考慮每一訪問，也檢驗(yàn)了該模型用于評(píng)估天之間的代謝變化 (數(shù)據(jù)未顯示）。最終，保留26種代謝物為具有根據(jù)受試者內(nèi)臟脂肪的脂肪過多分類他們 的重要性（圖2, 3-1，3-2, 3-3)。內(nèi)臟脂肪過多與增加濃度的循環(huán)氨基酸相關(guān)，所述氨基酸 包括谷氨酰胺，亮氨酸/異亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。這些模式與較高濃度的?；鈮A相 關(guān)，所述?；鈮A包括棕櫚酰肉堿（C16)，癸酰肉堿（C10)，辛酰肉堿（C8:l)，和溶血磷脂酰 膽堿LPC 24:0和二酰基磷脂，包括PC 30:0, PC 34:4。此外，內(nèi)臟脂肪過多通過消耗酰基 醋 PC-0 36:3,PC-0 40:3,PC-0 40:4,PC-0 40:6,PC-0 42:2,PC-0 42:3,PC-0 42:4,PC-0 44:3, PC-0 44:4, PC-0 44:6,和兩種二?；姿崮憠A（PC 42:0和PC 42:2)而明顯。為了 評(píng)估所述標(biāo)簽的每一組分的單個(gè)區(qū)分能力，在內(nèi)臟脂肪的脂肪過多組之間實(shí)施了 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)（在表2中根據(jù)檢驗(yàn)的描述符，S卩比率2的loglO值，列出了所有的代謝物）。
[0169] 圖2總結(jié)了使用內(nèi)臟脂肪含量的loglO值，比率1的loglO值或比率2的loglO 值，所選擇的生物標(biāo)志物和在內(nèi)臟脂肪過多的分類中它們的權(quán)重。在交叉驗(yàn)證模式中這些 標(biāo)志物顯示對(duì)內(nèi)臟脂肪具有靈敏性和〇. 90的特異性（Sencv，Specv)。
[0170] 表 1:
【權(quán)利要求】
1. 生物標(biāo)志物，其中所述生物標(biāo)志物是PC-0 44:4。 2. PC-0 44:4的用途，用作生物標(biāo)志物來檢測(cè)和/或定量?jī)?nèi)臟脂肪過多和/或內(nèi)臟脂肪 過多的變化。
3. 在受試者中診斷內(nèi)臟脂肪過多的方法，包括 -在事先獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本中確定PC-0 44:4水平，和 -將受試者的PC-0 44:4水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于對(duì)照 群體同樣的體液中的平均PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中降低的 PC-0 44:4水平指示增加的內(nèi)臟脂肪過多。
4. 在受試者中診斷內(nèi)臟脂肪過多的變化的方法，包括 -確定事先獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本中的PC-0 44:4水平，和 -將受試者的PC-0 44:4水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于之前 獲自同一受試者的同樣的體液中的PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中 降低的PC-0 44:4水平指示增加的內(nèi)臟脂肪過多。
5. 在受試者中診斷生活方式的變化對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的影響的方法，包括 -確定事先獲自待測(cè)試的受試者的體液樣本中的PC-0 44:4水平，和 -將受試者的PC-0 44:4水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于之前 獲自同一受試者的同樣的體液中的PC-0 44:4水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較樣本中 增加的PC-0 44:4水平指示生活方式的變化對(duì)內(nèi)臟脂肪過多的積極影響。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述生活方式的變化是膳食的變化。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述膳食的變化是使用至少一種以前沒有消費(fèi)或者以 不同量消費(fèi)的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7的方法，用來測(cè)試新的營(yíng)養(yǎng)方案的有效性。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3至8中任一項(xiàng)所述的方法，還包括步驟 -確定體液樣本中至少一種其它生物標(biāo)志物的水平，所述其它生物標(biāo)志物選自谷氨酰 胺，酪氨酸，？〇0 44:6，？〇0 42:4，卩(：-0 40:4，和？(：-0 40:3，和 -將受試者的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:6, PC-0 42:4, PC-0 40:4,和PC-0 40:3之 至少之一的水平與預(yù)定的參考值比較，其中所述預(yù)定的參考值基于正常健康對(duì)照群體的體 液樣本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:6，PC-042:4，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水 平，或者基于之前獲自同一受試者的同樣的體液中的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:6, PC-0 42:4，？(：-0 40:4，和/或？(：-0 40:3水平，并且其中與預(yù)定的參考值比較體液樣本中增加的 谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-0 44:6, PC-0 44:4, PC-0 42:4, PC-0 40:4， 和/或PC-0 40:3水平指示增加的內(nèi)臟脂肪過多。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物的水平是通過 iH-NMR和/或質(zhì)譜測(cè)定樣本和參照物而確定的。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述體液是血漿或血清。
12. 根據(jù)權(quán)利要求3至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述內(nèi)臟脂肪過多的程度對(duì)于進(jìn) 展為與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病的可能性是指示性的。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述與過量?jī)?nèi)臟脂肪相關(guān)的疾病是心代謝疾病 和/或代謝失調(diào)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求3至13中任一項(xiàng)所述的方法，其在正常、過重或肥胖受試者中實(shí)施。
15. 根據(jù)權(quán)利要求3至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人或陪伴動(dòng)物，如貓 或狗。
【文檔編號(hào)】G01N33/92GK104350384SQ201380031044
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月12日
【發(fā)明者】F-P·馬丁, I·蒙托柳魯拉, P·A·蓋, S·A·D·萊茲 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司