多重蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供具有不同分子量多肽的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其用作電泳凝膠的一條泳道中作為質(zhì)量定量標(biāo)準(zhǔn)。所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包括具有不同電泳遷移率并以不同量存在的未染色多肽，從而在觀察時(shí)凝膠中的條帶具有不同強(qiáng)度。所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物還可包括預(yù)染色的多肽，其用作可見的分子量標(biāo)志物。本發(fā)明還提供用所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物確定靶多肽或蛋白質(zhì)質(zhì)量的方法。
【專利說明】多重蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物
[0001] 相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年6月28日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/665,425號(hào)的優(yōu)先 權(quán)，其通過引用全文納入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及對(duì)凝膠電泳中的蛋白質(zhì)定量。
[0004] 背景
[0005] 凝膠電泳，包括聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)，是用于評(píng)估蛋白質(zhì)或多肽的分子量 的常見實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。凝膠電泳用于分離蛋白質(zhì)，所述分離基于它們的電荷、大小和/或分子 量。在非變性條件下，蛋白質(zhì)可基于其荷質(zhì)比分離，并且電泳迀移率受天然蛋白質(zhì)的大小和 形狀影響。在變性條件下，例如存在陰離子去污劑例如十二烷基磺酸鈉（SDS)，蛋白質(zhì)會(huì)基 于其分子量分離。陰離子去污劑會(huì)使蛋白質(zhì)解折疊并提供均勻的負(fù)電荷密度，從而蛋白質(zhì) 的電泳迀移率是分子量的對(duì)數(shù)的線性函數(shù)。
[0006] 對(duì)樣品中蛋白質(zhì)的量定量的方法為本領(lǐng)域已知，包括Bradford試驗(yàn)。Bradford試 驗(yàn)依賴由已知蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的總量。然而，Bradford試 驗(yàn)通常使用含有感興趣蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行。若感興趣蛋白質(zhì)的消光系數(shù)已知，可使用分光 光度法測(cè)量純化的蛋白質(zhì)的量。蛋白質(zhì)的量還可通過偶聯(lián)同位素標(biāo)記方法（如ICAT、iTRAQ 和串聯(lián)治療標(biāo)簽）的質(zhì)譜來測(cè)定。然而，分光光度法受限用于溶液中純蛋白質(zhì)的測(cè)量。當(dāng) 前用于對(duì)SDS-PAGE凝膠中蛋白質(zhì)定量的方法涉及從已知質(zhì)量的純化蛋白質(zhì)的系列稀釋液 生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中使各稀釋液在凝膠的分開泳道中與含感興趣靶蛋白的樣品平行電泳。
[0007] 本發(fā)明公開了用于對(duì)電泳凝膠中蛋白質(zhì)的量定量的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，以及測(cè)定 凝膠中蛋白質(zhì)的量的方法，而無需生成已知蛋白質(zhì)質(zhì)量的系列稀釋或制備感興趣蛋白質(zhì)的 純化樣品。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明描述了蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其可用于測(cè)定電泳凝膠中靶蛋白的質(zhì)量（即含 量或量）。所述標(biāo)準(zhǔn)物包含可用于生成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的未染色多肽組，用于測(cè)定所述凝膠中 靶多肽的量。所述未染色多肽組可在混合物中提供，所述混合物適于加樣和在凝膠的一個(gè) 泳道中電泳分離。所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物還可包括預(yù)染色多肽組，其可用作測(cè)定靶多肽分 子量（即大?。┑姆肿恿刻荻?。因此，在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物可用于測(cè) 定電泳凝膠中靶蛋白的分子量和質(zhì)量。所述預(yù)染色多肽組和未染色多肽組可在混合物中提 供，所述混合物適于加樣和在凝膠的一個(gè)泳道中電泳分離。在電泳分離時(shí)，所述預(yù)染色多肽 顯示為凝膠上的條帶，使得使用者可確定不同大小多肽之間的分離程度。靶蛋白通常在凝 膠的另一泳道中加樣，隨后電泳分離。
[0009] 因此，在一個(gè)方面，提供一種可加樣到電泳凝膠的一條泳道中的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn) 物，所述標(biāo)準(zhǔn)物包括未染色多肽組，其中所述未染色多肽組的成員具有不同的電泳迀移率 并且以不同量存在，從而所述標(biāo)準(zhǔn)物適于從凝膠的一條泳道中生成蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述未染色多肽組的不同成員具有不同的分子量和/或不同的電泳迀 移率。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述未染色多肽組的各成員具有與所述未染色多肽組的其他成 員不同的分子量和/或不同的電泳迀移率。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物還包含具有不同分子量和/或不同電 泳迀移率的預(yù)染色多肽組，從而所述標(biāo)準(zhǔn)物適于在凝膠的一條泳道中生成分子量梯度和蛋 白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽組的不同成員具有不同的分子量和/ 或不同的電泳迀移率。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽組的各成員具有與所述預(yù)染色 多肽組的其他成員不同的分子量和/或不同的電泳迀移率。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn) 物的至少一種預(yù)染色多肽和至少一種未染色多肽具有不同電泳迀移率。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物在共同混合物中包含具有不同分子量 的預(yù)染色多肽組和具有不同分子量的未染色多肽組，其中所述未染色多肽組的成員具有不 同電泳迀移率且以不同的量存在，從而所述標(biāo)準(zhǔn)物適于在電泳凝膠的一條泳道中生成分子 量梯度和蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所述蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于從凝膠的一條泳道生成蛋白質(zhì)定量 標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明公開了用于測(cè)定靶蛋白的質(zhì)量或量的方法。因此，在一 些實(shí)施方式中，所述方法包括：使所述靶多肽在凝膠的一條泳道中電泳迀移，并使蛋白質(zhì)定 量標(biāo)準(zhǔn)物在凝膠的另一泳道中電泳迀移，其中所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀 移率并以不同量存在的未染色多肽組；檢測(cè)所述靶多肽和所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物；和，將 所述靶多肽的檢測(cè)量與由所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物生成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較，從而確定靶 蛋白的質(zhì)量。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括視覺比較凝膠中的靶多肽含量與凝膠或凝 膠圖像中的所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的條帶，從而測(cè)定或評(píng)估所述靶多肽的質(zhì)量或含量。所 述方法還可檢測(cè)含預(yù)染色多肽的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物，所述預(yù)染色多肽用于檢測(cè)所述靶蛋白的表 觀分子量。所述未染色多肽可在凝膠分離完成期間或之后進(jìn)行觀察或檢測(cè)，如本文詳述。在 一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)包括無染劑成像。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)包括熒光成像。 在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)包括使所述未染色多肽與染劑或染料接觸并觀察所述多肽。 所述方法可在變性凝膠例如SDS-PAGE凝膠上或非變形凝膠上實(shí)施。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括使所述未染色多肽接觸一種或多種配體，所 述配體特異結(jié)合所述標(biāo)準(zhǔn)物的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述一種或多種配體與生色或化 學(xué)發(fā)光試劑偶聯(lián)。
[0014] 本發(fā)明還提供在微流體電泳裝置或毛細(xì)管電泳裝置中測(cè)定靶蛋白的質(zhì)量的方法。 因此，在一些實(shí)施方式中，公開了測(cè)定靶多肽質(zhì)量的方法，所述方法包括：
[0015] 使本文所述靶多肽和所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物在微流體裝置中電泳迀移；
[0016] 檢測(cè)所述靶多肽和所述蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)物；和
[0017] 將所述靶多肽的檢測(cè)量與由所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物生成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較， 從而確定所述靶多肽的質(zhì)量。
[0018] 本發(fā)明還提供測(cè)定靶多肽的質(zhì)量或含量的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法 可用經(jīng)過電泳分離所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的凝膠或凝膠圖像進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，所述計(jì) 算機(jī)執(zhí)行方法包括：
[0019] 對(duì)蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中的未染色多肽定量，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同 電泳迀移率并以不同量存在的未染色多肽組；
[0020] 基于所述定量步驟生成回歸擬合；
[0021] 從所述回歸擬合計(jì)算所述靶多肽的質(zhì)量；和
[0022] 提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
[0023] 所述回歸擬合可為線性或非線性回歸。在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法 受用可執(zhí)行指令配置的一種或多種計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的控制。
[0024] 在另一方面，公開了用于進(jìn)行本文所述方法的一個(gè)或多個(gè)步驟的計(jì)算機(jī)產(chǎn)品。在 一個(gè)實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品包括永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其儲(chǔ)存多項(xiàng)指令，所述指令 用于控制處理器進(jìn)行一種或多種下述步驟的操作：
[0025] (i)接收數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包括蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中的未染色多肽的量，所述蛋白質(zhì) 定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀移率并以不同量存在的未染色多肽組；
[0026] (ii)基于所接收的數(shù)據(jù)生成回歸擬合；
[0027] (iii)從所述回歸擬合計(jì)算所述靶多肽的質(zhì)量；和
[0028] (iv)提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
[0029] 在一些實(shí)施方式中，提供包含計(jì)算機(jī)產(chǎn)品的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，所述產(chǎn)品用于進(jìn)行本文 所述方法的一個(gè)或多個(gè)步驟。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括永久性計(jì)算機(jī)可讀 介質(zhì)和一種或多種處理器，所述永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)儲(chǔ)存多項(xiàng)指令，所述指令用于控制 處理器進(jìn)行一種或多種下述步驟的操作：
[0030] (i)接收數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包括蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中的未染色多肽的量，所述蛋白質(zhì) 定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀移率并以不同量存在的未染色多肽組；
[0031] (ii)基于所接收的數(shù)據(jù)生成回歸擬合；
[0032] (iii)從所述回歸擬合計(jì)算所述靶多肽的質(zhì)量；和
[0033] (iv)提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量；且
[0034] 所述處理器用于執(zhí)行儲(chǔ)存在所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上的指令。
[0035] 在一些上述實(shí)施方式中，所述回歸擬合是線性回歸擬合。在某些實(shí)施方式中，所述 回歸擬合是非線性回歸擬合。
[0036] 以下描述進(jìn)一步實(shí)施方式。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1是凝膠或印跡成像的示意圖，顯示蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的一個(gè)實(shí)施方式的說明 性示例。左側(cè)：對(duì)應(yīng)于預(yù)染色多肽的條帶有色顯示于左泳道中，對(duì)應(yīng)于考馬斯亮藍(lán)染色多肽 的條帶在右泳道中顯示。右側(cè)：實(shí)際凝膠圖像顯示：左泳道中的所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色條帶， 和右泳道中的所述標(biāo)準(zhǔn)物的考馬斯亮藍(lán)染色條帶。
[0038] 圖2是凝膠或印跡成像的示意圖，顯示多重蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的兩個(gè)實(shí)施方式的 說明性示例。各實(shí)施例的左泳道（"有色"）顯示所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色蛋白質(zhì)可用作分子 量梯度。各實(shí)施例的中泳道顯示所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽可通過數(shù)種方法之一來檢測(cè)，包 括Western印跡之后的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、考馬斯亮藍(lán)染色或無染劑檢測(cè)。各實(shí)施例的右泳道 ("Fluor激發(fā)"）提供代表性示例，顯示用熒光激發(fā)觀察時(shí)左泳道的預(yù)染色蛋白質(zhì)的狀態(tài) (所示熒光顏色和圖譜僅用于示例）。在實(shí)施例1所示的實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色 多肽群聚在表示預(yù)染色分子量標(biāo)志物多肽的條帶的其中兩條之間的窄分子量范圍內(nèi)。實(shí)施 例2說明了所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽分布在表示預(yù)染色分子量標(biāo)志物多肽的多重條帶之 間的實(shí)施方式。
[0039] 圖3顯示圖1的凝膠圖像所示的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0040] 圖4顯示示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800的框圖，其可用于本文所述實(shí)施方式的系統(tǒng)和方 法。
[0041] 定義
[0042] 本文所用術(shù)語"預(yù)染色多肽"指經(jīng)標(biāo)記或與染料或染劑偶聯(lián)的多肽。例如，所述多 肽可用藍(lán)色或粉色染料標(biāo)記以在所述多肽在凝膠中迀移時(shí)提供有色標(biāo)志。
[0043] 本文所用術(shù)語"無染劑成像"指通過氨基酸色氨酸（Trp)和鹵代有機(jī)化和物之間 的紫外（UV)光依賴反應(yīng)來使蛋白質(zhì)可視化的方法，其導(dǎo)致在可見光范圍內(nèi)發(fā)熒光的產(chǎn)物。 無染劑成像的示例如美國(guó)專利號(hào)第7, 569, 130和8, 007, 646所述，其通過引用全文納入本 文。
[0044] 如本文所用，術(shù)語"化學(xué)發(fā)光"指化學(xué)反應(yīng)引起的熱量發(fā)射有限的能量發(fā)射。術(shù)語 "增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光"指使用酶（如HRP)催化化學(xué)發(fā)光底物轉(zhuǎn)變?yōu)槊艋噭?。所述敏化試?可被（例如通過過氧化氫）氧化產(chǎn)生三重羰基，其在衰變?yōu)閱为?dú)羰基時(shí)發(fā)光。術(shù)語"化學(xué)發(fā) 光試劑"指催化化學(xué)發(fā)光底物轉(zhuǎn)變?yōu)槊艋噭┑姆肿踊蛎浮?br>
[0045] 術(shù)語多肽的"質(zhì)量"指樣品中給定蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量。所述質(zhì)量可用樣品中蛋白 質(zhì)或多肽的微克數(shù)表示，例如加樣到電泳凝膠的一條泳道內(nèi)的靶蛋白的微克數(shù)。
[0046] 本文所用術(shù)語"標(biāo)記物"或"可檢測(cè)部分"指可通過光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免 疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理手段檢測(cè)的組合物。標(biāo)記的示例是 32P、熒光染料、高電子密度試 劑、酶（例如，ELISA中常用）、生物素、地高辛以及可被檢測(cè)的半抗原和蛋白或其他實(shí)體 (例如通過將放射性標(biāo)記物整合至肽中或用于檢測(cè)與肽特異性反應(yīng)的抗體）。所述標(biāo)記物 可整合至例如抗體和/或其它蛋白質(zhì)的任何位置?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的用于使抗體接 合所述標(biāo)記物的任何方法，例如，使用如下文獻(xiàn)中所述的方法：Hermanson，Bioconjugate Techniques (《生物結(jié)合技術(shù)》）1996,學(xué)術(shù)出版社有限公司（Academic Press, Inc.)，圣迭 戈。或者，使用高親和性相互作用的方法可以獲得相同的效果，其中一對(duì)結(jié)合伴侶（binding partner)中的一個(gè)能夠結(jié)合另一個(gè)，例如生物素和鏈霉親和素。本文所述蛋白質(zhì)可直接標(biāo) 記有同位素、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光團(tuán)、色原體，或者被間接標(biāo)記，例如通過生物素，該生物素隨后可 被復(fù)合體中的鏈霉親和素（包含熒光、放射性或可被直接檢測(cè)的其他部分）結(jié)合。因此，生 物素化的抗體被認(rèn)為是本文使用的"經(jīng)標(biāo)記的抗體"。
[0047] 本文所用術(shù)語"抗體"指一種或多種免疫球蛋白基因編碼的多肽或其片段，其特異 結(jié)合并識(shí)別抗原，所述抗原例如所述標(biāo)準(zhǔn)物的多肽或作為所述標(biāo)準(zhǔn)物的融合蛋白的部分的 肽標(biāo)簽。識(shí)別的免疫球蛋白輕鏈被歸類為κ或λ。免疫球蛋白重鏈分為γ、μ、α、δ或 ε，它們進(jìn)而分別定義免疫球蛋白類型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
[0048] 涉及蛋白質(zhì)、肽或抗原時(shí)，描述與抗體或配體結(jié)合的術(shù)語"特異性（或選擇性）"或 "特異性（或選擇性）與…發(fā)生免疫反應(yīng)"或"具有對(duì)…的結(jié)合特異性"指能在蛋白質(zhì)和其 它生物物質(zhì)的異質(zhì)群體存在的情況下確定是否存在蛋白質(zhì)、肽或抗原的結(jié)合反應(yīng)。因此，在 給定的條件下，特定的抗體結(jié)合樣品或所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物中的特定蛋白質(zhì)而不以顯著量結(jié) 合樣品或所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物中存在的其他蛋白質(zhì)。在這樣的條件下與抗體的特異性結(jié)合可 能需要就抗體對(duì)特定蛋白質(zhì)的特異性來選出的抗體。例如，可以選擇針對(duì)某一蛋白質(zhì)產(chǎn)生 的抗體以得到不與其他蛋白質(zhì)而與該蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體?？衫酶鞣N免疫 測(cè)定形式來選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，常規(guī)使用固相ELISA免 疫測(cè)定、Western印跡或免疫組化法來選擇與某一蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗 體。參見，Harlow 和 Lane，Antibodies, A Laboratory Manual (《抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》），冷 泉港出版社（Cold Spring Harbor Publications)，紐約（1988)，來獲得關(guān)于可用于確定特 定免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描述。通常，特異性或選擇性反應(yīng)會(huì)是背景信號(hào)或 噪音的至少2倍，更通常而言是超過背景10至100倍。
[0049] 本文所用術(shù)語"固體支持物"指固體惰性表面或物體，其上可固定試劑例如蛋白質(zhì) 或多肽。本文所用術(shù)語"固定"指分子基礎(chǔ)的偶聯(lián)，其在本文所述試驗(yàn)的任意步驟期間、在 任意施加的條件下都不會(huì)移開或去偶聯(lián)。這類固定可通過共價(jià)鍵、離子鍵、親和型鍵或任意 其他化學(xué)鍵實(shí)現(xiàn)。
[0050] 術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。如 本文所用，該術(shù)語涵蓋任意長(zhǎng)度的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸殘基通過共 價(jià)肽鍵連接。所述多肽可為天然或重組的，并且可含有天然或非天然氨基酸。所述蛋白質(zhì) 可為融合蛋白，所述融合蛋白包含來自異源蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸，或在所述蛋白質(zhì)的氨 基（N)或羧基（C)末端添加的人工肽。
[0051] 術(shù)語"融合蛋白"指含來自兩種或更多種異源或不同的肽或多肽的氨基酸通過肽 鍵連接的多肽。融合蛋白可從重組核酸分子生產(chǎn)，所述重組核酸分子編碼所述兩種或更多 種異源肽或多肽，從而所述多肽在框內(nèi)連接。短語"在框內(nèi)連接"指連接編碼多肽的兩種或 更多種多核苷酸序列，從而所述連接的核酸序列翻譯為含有融合在一起的原始多肽的單鏈 多肽。所述融合蛋白還可通過所需氨基酸序列的肽合成來生產(chǎn)。
[0052] 術(shù)語"配體"指特異且可逆結(jié)合其他化學(xué)實(shí)體、化合物或多肽以形成復(fù)合物的化合 物或分子。
[0053] 術(shù)語分子量梯度和分子量標(biāo)志物可互換使用，指電泳分離時(shí)在凝膠上顯示為已知 大小的條帶的多肽。
[0054] 所選實(shí)施方式詳述
[0055] 本發(fā)明提供蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其用于對(duì)（例如凝膠電泳中的）樣品中感興趣多 肽（本文有時(shí)稱為靶蛋白或靶多肽）的含量或質(zhì)量定量。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì) 定量標(biāo)準(zhǔn)物還用作凝膠電泳中的分子量標(biāo)志物。因此所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物可具有雙重功 能，在凝膠電泳設(shè)備的單個(gè)泳道中作為質(zhì)量定量標(biāo)準(zhǔn)物和分子量標(biāo)志物。本發(fā)明還提供包 含所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的試劑盒。本發(fā)明還提供測(cè)定樣品中靶多肽的質(zhì)量的方法，包括 計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法。所述方法還可測(cè)定靶蛋白的質(zhì)量和大小。所述靶多肽可為已知或未知多 肽。
[0056] I.蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物
[0057] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀移率和不同質(zhì)量的多種多 肽，其適于在凝膠的一個(gè)泳道中產(chǎn)生蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物可用于從凝 膠的一條泳道生成蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)前對(duì)SDS-PAGE凝膠中蛋白質(zhì)定量的方法涉及 從已知含量的純化蛋白質(zhì)的系列稀釋液生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中使各稀釋液在凝膠的分開泳道 中與含感興趣靶蛋白的樣品平行電泳。因此現(xiàn)有的方法使用凝膠的多個(gè)泳道來生成標(biāo)準(zhǔn)曲 線（例如3-5個(gè)泳道或更多，取決于生成所述標(biāo)準(zhǔn)曲線所需的數(shù)據(jù)點(diǎn)），這就為感興趣的靶 蛋白的加樣留下很少的可用泳道。因此，使用現(xiàn)有方法時(shí)凝膠上很大一部分泳道無法用于 分析感興趣的蛋白質(zhì)。本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)通過使用具有不同電泳迀移率（或不同表 觀分子量）的不同含量的多肽，可從凝膠的單個(gè)泳道中生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0058] 在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含未染色多肽組，其中該未染色多 肽組的成員具有不同電泳迀移率且以不同質(zhì)量存在。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量 標(biāo)準(zhǔn)物包含預(yù)染色多肽組，其中該預(yù)染色多肽組的成員具有不同電泳迀移率和/或不同分 子量。在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含預(yù)染色多肽和未染色多肽的混合物。 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同分子量的預(yù)染色多肽組和具有不同分子量的 未染色多肽組，其中所述未染色多肽組的成員具有不同電泳迀移率且以不同的質(zhì)量存在， 從而所述標(biāo)準(zhǔn)物適于在凝膠的一條泳道中生成分子量梯度和蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。例如，在一 些實(shí)施方式中，所述未染色多肽組的各成員具有不同電泳迀移率且以不同量存在，從而在 電泳分離后觀察或檢測(cè)時(shí)，凝膠上的各條帶具有不同強(qiáng)度。所述多肽可為天然或重組蛋白 質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述多肽是融合蛋白。
[0059] A.所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色多肽
[0060] 所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色多肽可用作凝膠電泳的分子量梯度或標(biāo)志物，其中所述多肽 在經(jīng)凝膠電泳分離時(shí)在凝膠基質(zhì)中顯示為條帶。在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽用一 種或多種有色染料標(biāo)記。所述一種或多種有色染料還可為熒光染料。所述預(yù)染色多肽可 (例如）使用戶視覺監(jiān)控電泳的進(jìn)程，或視覺監(jiān)控凝膠向固體支持物的轉(zhuǎn)移，而無需用染料 例如考馬斯亮藍(lán)對(duì)所述凝膠進(jìn)行染色。所有預(yù)染色多肽可用相同有色染料染色或一些預(yù)染 色多肽可用不同有色染料和/或不同熒光染料染色，從而使用戶更容易區(qū)分具有不同分子 量的多肽。在一些實(shí)施方式中，所述一種或多種有色染料包含單一有色染料。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述一種或多種有色染料包含不同有色染料的組合。例如，所述標(biāo)準(zhǔn)物中的一些多 肽可染為粉色，作為已知分子量（例如25、50和75kDa)的參考條帶，而所述標(biāo)準(zhǔn)物中的其 他多肽可染為藍(lán)色。所用染劑可為本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的市售蛋白質(zhì)染劑和染料。例 如，蛋白質(zhì)結(jié)合染料可為共價(jià)結(jié)合至多肽的任何染料。在一些實(shí)施方式中，所述染料肉眼可 見，例如發(fā)色團(tuán)。本領(lǐng)域熟知將染料偶聯(lián)到蛋白質(zhì)上的方法，例如到蛋白質(zhì)N末端、組氨酸、 色氨酸、賴氨酸殘基的氨基基團(tuán)；半胱氨酸的巰基基團(tuán)；天冬氨酸和谷氨酸的羧基基團(tuán)；甲 硫氨酸的硫醚，和酪氨酸的酷根（參見例如Hermanson, Bioconjugate Techniques(《生物偶 聯(lián)技術(shù)》），學(xué)術(shù)出版社（Academic Press),圣地亞哥（1996) ;Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking(《蛋白偶聯(lián)和交聯(lián)化學(xué)》），CRC出版社，卡拉頓，1993; Haugland, MOLECULAR PROBES HANDBOOK (《分子探針手冊(cè)》）（2002))。對(duì)多肽染色的方法示 例參見美國(guó)專利號(hào)第7265206號(hào)，其通過引用全文納入本文。在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染 色多肽用熒光染料標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，預(yù)染色多肽組用有色染料和熒光染料的組合 標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，預(yù)染色多肽組的各成員可用不同有色染料或不同熒光染料標(biāo)記。 在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽在凝膠上產(chǎn)生觀察或檢測(cè)時(shí)看起來具有相似染色強(qiáng)度 的條帶。
[0061] 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色多肽具有不同分子量但具有相似的質(zhì) 量。換句話說，一種或多種所述預(yù)染色多肽在凝膠上分離時(shí)具有不同的表觀大小，但看起來 在所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)條帶中具有相似含量的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物 的預(yù)染色多肽具有不同分子量和不同質(zhì)量，從而當(dāng)在凝膠中分離時(shí)，一種或多種預(yù)染色多 肽看起來在所述凝膠的一個(gè)或多個(gè)條帶中具有不同含量的蛋白質(zhì)。
[0062] 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色多肽大小范圍為約2kDa -約250kDa。在 一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽大小范圍為約2kDa-約500kDa。應(yīng)理解，如本文所述， 范圍可包括端點(diǎn)和其間所有點(diǎn)。例如，所述預(yù)染色多肽可為約2kDa、5kDa、IOkDa、15kDa、 20kDa、25kDa、37kDa、50kDa、75kDa、lOOkDa、150kDa 和 250kDa。所述標(biāo)準(zhǔn)物可包括大小范圍 為約2kDa -約500kDa的預(yù)染色多肽的混合物。
[0063] 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種具有不 同分子量和/或不同電泳迀移率的預(yù)染色多肽。
[0064] 在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽可用無染劑成像觀察或檢測(cè)。例如，所述無染 劑成像可使用鹵代有機(jī)化合物。暴露在UV輻射下時(shí)，所述鹵代有機(jī)化合物與所述多肽中的 色氨酸殘基共價(jià)反應(yīng)，形成用UV光（例如來自UV透照器）照射時(shí)發(fā)熒光的化合物。例如， 所述多肽可用約280nm -約320nm的UV光照射。所述熒光多肽可肉眼觀察或用成像儀器觀 察。所述鹵代有機(jī)化合物可在電泳之前或之后納入凝膠中。多種鹵代有機(jī)化合物可用于本 發(fā)明的實(shí)施方式中，實(shí)際上，可以使用會(huì)與色氨酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)以形成暴露在激發(fā)光下會(huì) 產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的任何鹵代有機(jī)化合物。特別感興趣的鹵代有機(jī)化合物是三鹵代化合物， 尤其是三氯化合物和分子量為200或更低的那些。三鹵代脂肪醇、三鹵代脂肪酸、三鹵代脂 肪胺和二齒代脂肪燒都是有用的。特定的不例是氯仿、二氯乙酸和二氯乙醇。齒代有機(jī)化 合物可單獨(dú)使用或聯(lián)用，例如兩種或三種這類化合物以大致相等的摩爾比聯(lián)用。用無染劑 成像檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法如美國(guó)專利號(hào)第7, 569, 130和8, 007, 646所述，其通過引用全文納 入本文。
[0065] 在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽可用熒光成像觀察或檢測(cè)。例如，在一些 實(shí)施方式中，染上藍(lán)色的多肽在用合適波長(zhǎng)照射時(shí)顯示為紅色條帶（例如當(dāng)所述多肽用 Uniblue A?(藍(lán)色染料）標(biāo)記并用紅光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生另一紅移的熒光）。在一些實(shí)施方式中， 染上紅色的多肽在用合適波長(zhǎng)照射時(shí)顯示為黃色條帶（例如當(dāng)所述多肽用TRITC(紅色染 料）標(biāo)記并用綠光激發(fā)時(shí)，產(chǎn)生淡黃的熒光）。對(duì)所述多肽的熒光成像的可視化可通過使用 約280nm-約320nm的UV光激發(fā)源實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽可用激發(fā)源 例如激光或LED光以窄波長(zhǎng)范圍照射，例如約488nm (藍(lán)）、約555nm (綠）或約630nm (紅）。 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，所述激發(fā)波長(zhǎng)的熒光發(fā)射光譜具有比激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，且所 述發(fā)射光譜可在將接近和低于所述激發(fā)波長(zhǎng)的光濾除之后檢測(cè)。例如，在一些實(shí)施方式中， 所述激發(fā)波長(zhǎng)用530nm、605nm和/或695nm帶通濾波器過濾。然而，應(yīng)知曉合適的濾波器 的選擇取決于蛋白質(zhì)染料或染劑的激發(fā)和發(fā)射特征。在一些實(shí)施方式中，用于預(yù)染色多肽 的染料在短波長(zhǎng)（UV)(例如來自UV透照器）和長(zhǎng)波長(zhǎng)（例如約555nm綠光或約630nm的 紅光）處均具有強(qiáng)的熒光激發(fā)，且會(huì)在甚至更長(zhǎng)的波長(zhǎng)（例如在約576nm用綠光激發(fā)）發(fā) 射熒光能量。在一些實(shí)施方式中，所述染料在肉眼可見的波長(zhǎng)內(nèi)具有明亮色彩，但用熒光成 像觀察時(shí)信號(hào)減弱。
[0066] 在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)染色多肽可用近紅外成像觀察。例如，本文所述用染料 標(biāo)記的多肽可用650-800nm波長(zhǎng)能量激發(fā)，且激發(fā)的染料會(huì)在約670-820nm波長(zhǎng)釋放能量。
[0067] B.所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽
[0068] 所述定量標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽可用于對(duì)靶多肽的含量或質(zhì)量定量。例如，在一些 實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用于在凝膠用染料（例如考馬斯亮藍(lán)）染色后視覺評(píng)估靶 多肽的質(zhì)量。在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用于使用所述標(biāo)準(zhǔn)物中的一種或多種 未染色多肽的已知蛋白質(zhì)質(zhì)量生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不 同分子量的多種未染色多肽或未染色多肽組，其中具有相同分子量的未染色多肽具有與標(biāo) 準(zhǔn)物中其他未染色多肽不同的質(zhì)量。因此，標(biāo)準(zhǔn)物中具有相同大小的一種或多種未染色多 肽的含量可與標(biāo)準(zhǔn)物中具有不同大小的其他未染色多肽的含量不同。例如，具有第一分子 量的第一未染色多肽的質(zhì)量可與具有第二分子量的第二未染色多肽的質(zhì)量不同。各未染色 多肽的含量可經(jīng)選擇，從而生成涵蓋預(yù)期質(zhì)量的感興趣靶蛋白的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量曲線。用于生成 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的各未染色多肽的含量可通過例如密度分析掃描凝膠泳道中的條帶來測(cè)定。
[0069] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用本文所述的無染劑成像觀察或檢測(cè)。在 一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用于測(cè)量蛋白質(zhì)的量，使用對(duì)所述凝膠中條帶強(qiáng)度的 無染劑成像。在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用于測(cè)量蛋白質(zhì)的量，使用對(duì)所述凝膠 轉(zhuǎn)移到固體支持物后的條帶強(qiáng)度的無染劑成像。固體支持物的示例本領(lǐng)域已知，包括硝酸 纖維素或聚偏二氟乙烯（PVDF)膜。
[0070] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可用本文所述近紅外成像觀察。例如，所述 未染色多肽可用合適的染料例如考馬斯亮藍(lán)染色，并用近紅外成像觀察。所述未染色多肽 還可轉(zhuǎn)移到固體支持物上（例如Western印跡中的尼龍膜），與合適的抗體-染料或蛋白 質(zhì)-染料偶聯(lián)物接觸，并用近紅外成像觀察。
[0071] 所述未染色多肽還可在凝膠基質(zhì)中或在轉(zhuǎn)移到固體支持物之后使用熒光染劑例 如SYPRO? Ruby (生命技術(shù)公司）或Flamingo?染劑（生物輻射公司）來觀察。在一些 實(shí)施方式中，所述未染色多肽還可使用本文所述的一種或多種可視化方法在電泳進(jìn)行時(shí)在 凝膠基質(zhì)中觀察。
[0072] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可通過將所述未染色多肽與對(duì)所述未染色多 肽具有高親和性或高特異性的抗體或配體接觸來檢測(cè)。所述抗體或配體可用可檢測(cè)部分標(biāo) 記或偶聯(lián)，例如熒光染料或生色或化學(xué)發(fā)光試劑。
[0073] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽包含具有親和標(biāo)簽的融合蛋白。親和標(biāo)簽的 示例包括N末端或C末端聚組氨酸標(biāo)簽，其可通過結(jié)合至含結(jié)合金屬離子（如鎳鈷）的柱 或樹脂來進(jìn)行所述多肽的親和純化。所述親和標(biāo)簽還可包括結(jié)合鏈霉親和素、工程改造的 鏈霉親和素（例如StrepTag? II)或其他配體的其他短氨基酸肽。
[0074] 所述未染色多肽還可包括含生色和/或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)標(biāo)簽的融合蛋白。例如，所 述標(biāo)準(zhǔn)物的多肽可重組生產(chǎn)為融合蛋白，其含有用作檢測(cè)標(biāo)簽的短氨基酸序列。在一些實(shí) 施方式中，所述檢測(cè)標(biāo)簽與特異結(jié)合該檢測(cè)標(biāo)簽但不結(jié)合樣品中其他蛋白質(zhì)的抗體接觸。 在一些實(shí)施方式中，結(jié)合所述檢測(cè)標(biāo)簽的抗體直接偶聯(lián)至可用于產(chǎn)生生色或化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 的酶。在一些實(shí)施方式中，所述酶是用于生色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的堿性磷酸酶（AP)或用于化 學(xué)發(fā)光檢測(cè)的HRP。若使用AP，所述帶標(biāo)簽多肽可用生色底物磷酸對(duì)硝基苯酯檢測(cè)，其產(chǎn)生 在405nm處可檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。對(duì)于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，HRP酶可與底物魯米諾（Iuminol)和 任選的增強(qiáng)劑一起孵育。若使用HRP，所述帶標(biāo)簽多肽還可用生色底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB) 檢測(cè)，其在過氧化氫存在下產(chǎn)生在450nm處可檢測(cè)的可溶產(chǎn)物。在一些實(shí)施方式中，所述親 和標(biāo)簽還可作為檢測(cè)標(biāo)簽。例如，聚組氨酸標(biāo)簽可結(jié)合Ni-NTA-堿性磷酸酶偶聯(lián)物，然后將 其與氯化硝基氮藍(lán)四唑（NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸對(duì)甲苯胺鹽（BCIP) -起孵育，從 而檢測(cè) Western 印跡中的多肽（參見 Hochuli, E·，和 Piesecki, S·，Methods:A Companion to Methods in Enzymology(《方法：酶學(xué)方法手冊(cè)》）4:68-72(1992))。
[0075] 在一些實(shí)施方式中，使結(jié)合所述檢測(cè)標(biāo)簽的抗體與二級(jí)抗體接觸，所述二級(jí)抗體 偶聯(lián)至可用于產(chǎn)生生色或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶。在一些實(shí)施方式中，所述檢測(cè)標(biāo)簽?zāi)芙Y(jié)合鏈 霉親和素或工程改造的鏈霉親和素。例如，在一些實(shí)施方式中，使含有檢測(cè)標(biāo)簽的融合蛋白 與偶聯(lián)HRP的工程改造的鏈霉親和素（例如StepTactin?-HRP)接觸。所述多肽還可包含 融合蛋白，所述融合蛋白包括特異結(jié)合IgG抗體的肽序列。在一些實(shí)施方式中，用戶可使用 一級(jí)和二級(jí)抗體檢測(cè)所述標(biāo)準(zhǔn)物的多肽，所述一級(jí)和二級(jí)抗體與在凝膠中加樣的樣品中蛋 白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)所用的相同。
[0076] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽包含氨基酸色氨酸（Trp或W)用于改善無染 劑定量。例如，所述未染色多肽可經(jīng)選擇或工程改造以具有特定的色氨酸量用于本文所述 的無染劑方法的定量。在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽包含相同、幾 乎相同或基本相似 (例如差異不多于5%)比例的色氨酸，這樣可用所述多肽的質(zhì)量來評(píng)定色氨酸的含量。在 一些實(shí)施方式中，所述多肽經(jīng)工程改造以具有平均色氨酸含量，其與在凝膠上加樣的樣品 中蛋白質(zhì)的平均色氨酸含量匹配。在一些實(shí)施方式中，所述色氨酸的含量為所述標(biāo)準(zhǔn)物中 多肽的約1. 5% -約2. 5% (即所述標(biāo)準(zhǔn)物的各多肽中約1. 5% -約2. 5%的氨基酸是色氨 酸）。
[0077] 在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽的大小可經(jīng)選擇，從而進(jìn)行凝膠電泳時(shí)所述 未染色多肽的分子量集中在相對(duì)窄的范圍內(nèi)。例如，如圖2所不（實(shí)施例1)，在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述未染色多肽的分子量落在所述分子量梯度的兩種連續(xù)預(yù)染色多肽的分子量之 間。在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽可在凝膠上加樣的樣品中感興趣的靶蛋白的大小 范圍內(nèi)進(jìn)行選擇。例如，單個(gè)未染色多肽的分子量可選為鄰近感興趣的靶蛋白的分子量， 從而一些未染色多肽的分子量小于所述靶蛋白，而一些未染色多肽的分子量大于所述靶蛋 白。
[0078] 在其他實(shí)施方式中，所述未染色多肽的大小可經(jīng)選擇，從而單個(gè)多肽的分子量在 預(yù)染色多肽的分子量之間分布或分散。例如，如圖2所不（實(shí)施例2)，在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述未染色多肽條帶經(jīng)過凝膠電泳分布在分子量梯度的多重預(yù)染色多肽條帶之間。在一個(gè) 實(shí)施方式中，未染色多肽在凝膠中鄰近兩種預(yù)染色多肽。因此，在一些實(shí)施方式中，所述未 染色多肽組的一個(gè)成員的分子量小于第一預(yù)染色多肽的分子量，且大于第二預(yù)染色多肽的 分子量。在一些實(shí)施方式中，所述未染色多肽大小范圍為約2kDa_約500kDa、約2kDa_約 250kDa、約 2kDa-約 lOOkDa、約 20kDa-約 IOOkDa 或約 20kDa-約 50kDa。
[0079] 在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)物包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種具有不 同分子量和/或不同電泳迀移率的未染色多肽。
[0080] 在一些實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含未標(biāo)記形式或未染色形式的預(yù)染 色多肽（即具有與預(yù)染色多肽相同的氨基酸序列的未染色多肽）。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含相同多肽的未染色形式和預(yù)染色形式的混合物。在一些實(shí)施方式 中，所述預(yù)染色多肽與具有相同氨基酸序列的未染色多肽在凝膠中表現(xiàn)出相同的表觀分子 量和迀移。
[0081] II.方法
[0082] 本發(fā)明還提供測(cè)定靶多肽質(zhì)量的方法。在所述方法的一個(gè)示例中，使含靶蛋白或 多肽的樣品和所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行凝膠電泳以根據(jù)大小、電荷和/或形狀分離所述 多肽。在一些實(shí)施方式中，所述多肽在變性凝膠中電泳分離。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 多肽在SDS-PAGE凝膠中電泳分離。在一些實(shí)施方式中，所述多肽在非變性凝膠（即天然凝 膠電泳）中電泳分離。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽在無SDS的聚丙烯酰胺凝膠中電 泳分離。所述多肽可在有或無SDS的Tris-甘氨酸凝膠中電泳分離。在一些實(shí)施方式中， 所述靶蛋白和所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物在凝膠的不同泳道中電泳迀移。在一些實(shí)施方式中， 所述標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀移率和不同量的未染色多肽組。在一些實(shí)施方式中，所述 標(biāo)準(zhǔn)物包含預(yù)染色多肽組，所述預(yù)染色多肽組可用于在電泳進(jìn)行和多肽在凝膠基質(zhì)中迀移 時(shí)視覺監(jiān)控所述多肽條帶迀移。因此在一些實(shí)施方式中，本方法還包括檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物 的預(yù)染色多肽條帶以確定所述靶蛋白的表觀分子量。所述預(yù)染色多肽可與未染色多肽一同 包含在所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中，或其可在本領(lǐng)域已知的單獨(dú)分子量標(biāo)準(zhǔn)物中提供。
[0083] 確定所述標(biāo)準(zhǔn)物的多肽在凝膠中充分分離后，所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽可被染 色。例如，所述未染色多肽可用染料例如考馬斯亮藍(lán)染色。在一些實(shí)施方式中，所述未染色 多肽包含已知質(zhì)量的各多肽，其可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以對(duì)靶蛋白的質(zhì)量定量。在一些實(shí)施 方式中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線通過對(duì)條帶進(jìn)行密度分析測(cè)量生成，所述條帶對(duì)應(yīng)于所述標(biāo)準(zhǔn)物的 未染色多肽。所述定量標(biāo)準(zhǔn)物還可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以基于其分子量評(píng)估靶蛋白的大小。 圖1顯示代表性的凝膠，顯示用考馬斯亮藍(lán)染色的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。圖3顯示圖1中的凝膠 圖像生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了測(cè)定相同凝膠上上樣的靶蛋白含量，用戶可通過比較其和凝膠 中或標(biāo)準(zhǔn)曲線上所述蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的條帶強(qiáng)度來視覺評(píng)估該未知靶蛋白的量，或者根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線擬合一條曲線并基于測(cè)量的條帶強(qiáng)度計(jì)算該未知蛋白質(zhì)含量。在其他實(shí)施方式中， 所述預(yù)染色多肽包含已知質(zhì)量的各多肽，其可用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以對(duì)靶蛋白的質(zhì)量定量。
[0084] 在一些實(shí)施方式中，靶多肽的質(zhì)量通過基于用凝膠中多肽條帶的無染劑成像定量 所述標(biāo)準(zhǔn)物的未染色多肽所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。在一些實(shí)施方式中，靶多肽的質(zhì)量通 過基于用Western印跡定量所述未染色多肽所生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。例如，可將凝膠中 的多肽轉(zhuǎn)移到固體支持物上，并通過使該固體支持物上的多肽接觸特異結(jié)合各多肽的抗體 來檢測(cè)所述多肽。因此在一些實(shí)施方式中，靶多肽的質(zhì)量通過比較結(jié)合至所述靶蛋白的抗 體含量和結(jié)合至標(biāo)準(zhǔn)物中的已知質(zhì)量的各多肽的抗體含量來確定。在一個(gè)實(shí)施方式中，標(biāo) 準(zhǔn)曲線可由Western印跡中的條帶強(qiáng)度生成。在一些實(shí)施方式中，所述抗體結(jié)合用化學(xué)發(fā) 光試驗(yàn)檢測(cè)。
[0085] 在一些實(shí)施方式中，所述方法可測(cè)定微流體電泳裝置或毛細(xì)管電泳裝置中靶蛋 白的質(zhì)量。例如，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物可在微流體電泳裝置（例如生物輻射公司的 Experion?自動(dòng)化電泳工作站）中電泳。在一些實(shí)施方式中，所述自動(dòng)化方法還可測(cè)定革巴 蛋白的分子量。
[0086] 微流體電泳分析使用填充有聚合凝膠的微流體通道，以根據(jù)大小分離變性蛋白 質(zhì)。在典型的微流體電泳試驗(yàn)中，運(yùn)行含未染色分子量標(biāo)志物組的參比樣品，用于計(jì)算連續(xù) 通道中運(yùn)行的感興趣蛋白質(zhì)的分子量。在一些實(shí)施方式中，使所述參比樣品與本文所述蛋 白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物一起運(yùn)行。含有感興趣靶蛋白的樣品在不同通道中分離。然后靶蛋白的質(zhì) 量可用由所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物生成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定。在一些實(shí)施方式中，在含有 靶蛋白的樣品中添加已知量的參比蛋白，并且所述質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線可與樣品的參比蛋白（作 為標(biāo)準(zhǔn)化因子）聯(lián)用以更精確地確定靶蛋白的質(zhì)量。
[0087] A.計(jì)算機(jī)執(zhí)行的方法和系統(tǒng)
[0088] 本文所述任何方法均可全部或部分地使用包括一個(gè)或多個(gè)處理器的計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 進(jìn)行，可對(duì)其進(jìn)行配置以完成所述方法的步驟。因此，實(shí)施方式可涉及經(jīng)配置以進(jìn)行本文所 述任意方法的步驟的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其中不同組分可能進(jìn)行相應(yīng)步驟或相應(yīng)步驟組合。雖然 以編號(hào)或順序的步驟形式顯示，但本文中方法的步驟可同時(shí)或以不同順序進(jìn)行。此外，這些 步驟的部分可與來自其他方法的其他步驟的部分一同使用。同樣，步驟的全部或部分可以 是任選的。此外，任何方法的任何步驟都可使用模塊、循環(huán)或用于進(jìn)行這些步驟的其他手段 進(jìn)行。
[0089] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，提供計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法以確定靶多肽的質(zhì)量。在一個(gè)實(shí)施 方式中，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法受用可執(zhí)行指令配置的一種或多種計(jì)算機(jī)系統(tǒng)控制，其包括 如下步驟：
[0090] i.確定凝膠圖像中存在蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物；
[0091] ii.鑒定所述標(biāo)準(zhǔn)物中的定量多肽條帶；
[0092] iii.對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)物中的定量多肽條帶定量；
[0093] iv.生成線性或非線性回歸擬合，例如強(qiáng)度對(duì)比質(zhì)量的校準(zhǔn)曲線；和
[0094] V.從所述回歸擬合計(jì)算所述革El蛋白質(zhì)量；和
[0095] vi.提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
[0096] 在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)執(zhí)行，該系統(tǒng)與能夠檢 測(cè)凝膠或凝膠圖像中條帶的圖像掃描儀電子通訊。所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法可基于對(duì)凝膠的一 個(gè)泳道中的多肽條帶定量來確定在所述凝膠另一泳道上加樣的靶蛋白的質(zhì)量。在一些實(shí)施 方式中，所述計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法使用下述方式確定標(biāo)準(zhǔn)曲線：點(diǎn)對(duì)點(diǎn)半對(duì)數(shù)（point-to-point semi-log)、或ES (^Elder-Southern)、邏輯、線性、二次、三次或三次樣條函數(shù)的回歸分析。
[0097] 本發(fā)明還提供能進(jìn)行本文所述方法的任一或所有步驟的計(jì)算機(jī)產(chǎn)品。因此在一些 實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品包括永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其儲(chǔ)存用于控制處理器進(jìn)行本 發(fā)明所述方法的一種或多種步驟操作的多項(xiàng)指令。在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品包 括永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其儲(chǔ)存多項(xiàng)指令，所述指令用于控制處理器進(jìn)行一種或多種下 述步驟的操作：
[0098] i.確定凝膠圖像中存在蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物；
[0099] ii.鑒定所述標(biāo)準(zhǔn)物中的定量多肽條帶；
[0100] iii.對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)物中的定量多肽條帶定量；
[0101] iv.生成線性或非線性回歸擬合，例如強(qiáng)度對(duì)比質(zhì)量的校準(zhǔn)曲線；和
[0102] v.從所述回歸擬合計(jì)算所述靶蛋白質(zhì)量；和
[0103] Vi.提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
[0104] 在一些實(shí)施方式中，所述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品包括永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其儲(chǔ)存多項(xiàng)指 令，所述指令用于控制處理器進(jìn)行一種或多種下述步驟的操作：
[0105] (i)接收數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)包括蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中的未染色多肽的量，所述蛋白質(zhì) 定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳迀移率并以不同量存在的未染色多肽組；
[0106] (ii)基于所接收的數(shù)據(jù)生成回歸擬合；
[0107] (iii)從所述回歸擬合計(jì)算所述靶多肽的質(zhì)量；和
[0108] (iv)提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
[0109] 在一些實(shí)施方式中提供系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括上述計(jì)算機(jī)產(chǎn)品，和用于執(zhí)行儲(chǔ)存在計(jì) 算機(jī)可讀介質(zhì)上的指令的一個(gè)或多個(gè)處理器。
[0110] 圖4顯示示例性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)800的框圖，其可用于本文所述實(shí)施方式的系統(tǒng)和方 法。
[0111] 本文所述任何計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可利用任何適當(dāng)數(shù)目的子系統(tǒng)。這類子系統(tǒng)的示例如圖 4中計(jì)算機(jī)設(shè)備800所示。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)包括單個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)備，其中子系 統(tǒng)可以是該計(jì)算機(jī)設(shè)備的組件。在其他實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括多個(gè)計(jì)算機(jī)設(shè)備，其 各是一個(gè)子系統(tǒng)，具有內(nèi)部組件。
[0112] 圖4所示的子系統(tǒng)經(jīng)由系統(tǒng)總線875互聯(lián)。顯示了其他子系統(tǒng)，如打印機(jī)874、鍵 盤878、儲(chǔ)存裝置879、與顯示適配器882偶聯(lián)的監(jiān)視器876等。與輸入/輸出（I/O)控制 器871偶聯(lián)的周邊和I/O裝置可通過任何數(shù)量的本領(lǐng)域已知方式（如串行端口 877)連接 至計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。例如，串行端口 877或外部接口 881 (例如以太網(wǎng)、Wi-Fi等）可用于將計(jì) 算機(jī)系統(tǒng)800連接至廣域網(wǎng)（如因特網(wǎng)）、鼠標(biāo)輸入裝置或掃描儀。經(jīng)由系統(tǒng)總線875的互 聯(lián)允許中央處理器873與各子系統(tǒng)連通并控制來自系統(tǒng)內(nèi)存872或儲(chǔ)存裝置879 (例如固 定磁盤，如硬盤或光盤）指令的執(zhí)行以及子系統(tǒng)間信息的交換。系統(tǒng)存儲(chǔ)器872和/或儲(chǔ) 存裝置879可包含計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。本文所述的任何數(shù)據(jù)都可從一種組件輸出至另一種組 件并可輸出至用戶。
[0113] 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括多種相同的組件或子系統(tǒng)，例如通過外部接口 881或通過內(nèi)部 接口連接在一起。在一些實(shí)施方式中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或設(shè)備可通過網(wǎng)絡(luò)連通。在這種 情況下，可將一臺(tái)計(jì)算機(jī)作為客戶端并將另一臺(tái)計(jì)算機(jī)作為服務(wù)器，其中各計(jì)算機(jī)都可以 是同一計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的部分?？蛻舳撕头?wù)器可各包括多個(gè)系統(tǒng)、子系統(tǒng)或組件。
[0114] 應(yīng)理解，上述實(shí)施方式可使用硬件（例如專用集成電路或現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列）以 控制邏輯的形式和/或采用一般可編程的處理器使用計(jì)算機(jī)軟件以模塊化或集成化的方 式來實(shí)施。如本文中所用，處理器包括同一集成芯片上的多核處理器或者單個(gè)電路板上或 網(wǎng)絡(luò)連接的多個(gè)處理單元?；诒景l(fā)明的公開和教導(dǎo)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)知曉并理解 使用硬件以及硬件和軟件的組合來實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式的其他方式和/或方法。
[0115] 本申請(qǐng)中描述的任何軟件組件或函數(shù)都可作為軟件代碼使用，以由處理器使用任 何適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)語言（如Java、C++或Perl)、使用例如常規(guī)或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)來執(zhí)行。軟件 代碼可作為一系列指令或命令儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上用于儲(chǔ)存和/或傳輸，合適的介質(zhì) 包括隨機(jī)存取存儲(chǔ)器（RAM)、只讀存儲(chǔ)器（ROM)、磁性介質(zhì)（如硬盤或軟盤）、光學(xué)介質(zhì)（如 光盤（CD)或DVD (數(shù)字多功能光盤）、閃速存儲(chǔ)器等）。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以是這類儲(chǔ)存或 傳輸裝置的任意組合。
[0116] 也可使用適用于傳輸?shù)妮d波信號(hào)經(jīng)由遵循多種協(xié)議的有線、光纖和/或無線網(wǎng)絡(luò) (包括因特網(wǎng)）編碼和傳輸這類程序。同樣，可使用這類程序編碼的數(shù)據(jù)信號(hào)根據(jù)本發(fā)明的 實(shí)施方式創(chuàng)建計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。程序代碼編碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可與兼容裝置打包或由其 他裝置單獨(dú)地提供（例如通過因特網(wǎng)下載）。任何這類計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可存在于單個(gè)計(jì)算 機(jī)產(chǎn)品（例如硬盤、CD或整個(gè)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）之上或之內(nèi)，且可存在于系統(tǒng)或網(wǎng)絡(luò)中不同計(jì) 算機(jī)產(chǎn)品之上或之內(nèi)。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可包括監(jiān)視器、打印機(jī)或其他合適的顯示器，用于向用戶 提供任何本文所述結(jié)果。
[0117] III.試劑盒
[0118] 本發(fā)明還提供包含所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的試劑盒。例如，所述試劑盒可提供含 預(yù)染色多肽組和未染色多肽組的容器，其中各預(yù)染色多肽組具有不同的分子量，且各未染 色多肽組就給定的分子量以不同含量提供。所述試劑盒還可在分開的容器中提供具有相同 分子量的各預(yù)染色多肽，并在分開的容器中提供具有相同分子量的各未染色多肽。這使得 用戶可根據(jù)需要將預(yù)染色和未染色多肽組合為混合物。所述試劑盒還可提供用于檢測(cè)和定 量標(biāo)準(zhǔn)中多肽的其他試劑，以及使用試劑盒的說明。
[0119] 在所附的權(quán)利要求書中，術(shù)語"一個(gè)"或"一種"是用來表示"一個(gè)（種）或多個(gè) (種）"。在述及步驟或要素時(shí)，其前導(dǎo)術(shù)語"包含"及其變化形式例如"包括"和"含有"旨 在表示其它步驟或要素的增加是可任選且不被排除的。本說明書中引用的所有專利、專利 申請(qǐng)和其它公開的參考材料都通過引用全文納入本文中。當(dāng)本說明書的內(nèi)容與本發(fā)明引用 的任何參考材料或任何現(xiàn)有技術(shù)之間存在矛盾之處的時(shí)候，以本說明書為準(zhǔn)。所述矛盾之 處包括現(xiàn)有技術(shù)對(duì)詞或詞組的定義與本說明書對(duì)相同的詞或詞組明確給出的定義之間的 差異。
【權(quán)利要求】
1. 一種可在電泳凝膠的一條泳道中上樣的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，所述標(biāo)準(zhǔn)物包括未染色 多膚組，其中所述未染色多膚組的成員具有不同的電泳遷移率并且W不同量存在，從而所 述標(biāo)準(zhǔn)物適于從凝膠的一條泳道中生成蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，還包括具有不同電泳遷移率的預(yù)染色多膚 組，從而所述標(biāo)準(zhǔn)物適于從凝膠的一條泳道中生成分子量梯度和蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述多膚大小范圍為約2kDa-約 250kDa、或約 2kDa-約 lOOkDa、或約 20kDa-約 lOOkDa。
4. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述預(yù)染色多膚組的成員具有不同電 泳遷移率。
5. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述預(yù)染色多膚組的成員W相似的量 存在。
6. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中至少一種預(yù)染色多膚和至少一種未染 色多膚具有不同的電泳遷移率。
7. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述未染色多膚包含親和標(biāo)簽。
8. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述未染色多膚包含檢測(cè)標(biāo)簽。
9. 如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述未染色多膚包含基本相似百分比 的色氨酸。
10. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，其中所述預(yù)染色多膚用一種或多種有色 染料染色，其中所述一種或多種有色染料包含單一有色染料、不同有色染料的組合或巧光 染料。
11. 如權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物，還包括氨基酸序列與預(yù)染色多膚相同的 未染色多膚。
12. 包含如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物的試劑盒。
13. 確定祀多膚的質(zhì)量的方法，包括： 使所述祀多膚在凝膠的一條泳道中電泳遷移，并使權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn) 物在所述凝膠的另一泳道中電泳遷移； 檢測(cè)所述祀多膚和所述蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)物； 將所述祀多膚的檢測(cè)量與由所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物生成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較，從而 確定所述祀多膚的質(zhì)量。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，還包括檢測(cè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物的預(yù)染色多膚條帶W確定所 述祀蛋白的表觀分子量。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述檢測(cè)包括無染劑成像。
16. 如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述檢測(cè)包括巧光成像。
17. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述檢測(cè)包括使所述未染色多膚與染劑或染料接 觸并觀察所述多膚。
18. 如權(quán)利要求13所述的方法，還包括使所述未染色多膚接觸一種或多種配體，所述 配體特異結(jié)合所述標(biāo)準(zhǔn)物的多膚。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種配體與生色或化學(xué)發(fā)光試劑偶 聯(lián)。
20. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述凝膠是變性凝膠或非變性凝膠。
21. 測(cè)定祀多膚的質(zhì)量的方法，包括： 使所述祀多膚和權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物在微流體裝置中電泳遷移； 檢測(cè)所述祀多膚和所述蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)物； 將所述祀多膚的檢測(cè)量與由所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物生成的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線做比較，從而 確定所述祀多膚的質(zhì)量。
22. 確定凝膠或凝膠成像中祀多膚的質(zhì)量的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，包括： 在用可執(zhí)行指令配置的一種或多種計(jì)算機(jī)系統(tǒng)控制下； 對(duì)蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物中的未染色多膚定量，所述蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)物包含具有不同電泳 遷移率并W不同量存在的未染色多膚組； 基于所述定量步驟生成回歸擬合； 從所述回歸擬合計(jì)算所述祀多膚的質(zhì)量；和 提供所述經(jīng)計(jì)算的質(zhì)量。
23. 如權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，其中所述回歸擬合是線性回歸。
24. 如權(quán)利要求22所述的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，其中所述回歸擬合是非線性回歸。
【文檔編號(hào)】G01N33/00GK104471395SQ201380034817
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年6月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月28日
【發(fā)明者】J·S·西諾, D·C·伊, L·O·洛馬斯 申請(qǐng)人:生物輻射實(shí)驗(yàn)室股份有限公司