一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法，利用該方法能快速實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤微環(huán)境中多組分原位成像、各組分的定量計(jì)算及腫瘤轉(zhuǎn)移單元的定量計(jì)數(shù)；本發(fā)明方法克服了傳統(tǒng)和現(xiàn)代方法中存在的不足，檢測(cè)速度快，穩(wěn)定性好，不需要人工計(jì)算，避免個(gè)體判斷誤差；可有效方便地對(duì)多組分構(gòu)成的轉(zhuǎn)移單元進(jìn)行快速定量計(jì)算，有利于推動(dòng)腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展。
【專利說明】一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織免疫熒光及圖像空間關(guān)系解析領(lǐng)域，具體涉及一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法，適用于人腫瘤組織微環(huán)境中由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管(血管內(nèi)皮細(xì)胞)三種組分構(gòu)成的腫瘤轉(zhuǎn)移單元的計(jì)數(shù)，還涉及檢測(cè)其他重要微環(huán)境組分共同構(gòu)成的單元的定量計(jì)算。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是全球首位致死病因，在過去20年中，其發(fā)生率和死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康(Jemal A, Bray F，Center MM, et al.Global cancer statistics.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2011，61:69-90.)。癌癥的發(fā)生及發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、逐步發(fā)展的過程，其所處的組織環(huán)境對(duì)其進(jìn)展影響巨大(Polyak K, HavivI，Campbell IG.Co-evolution of tumor cells and their microenvironment.Trendsin Genetics.2009, 25:30-38.)。腫瘤微環(huán)境是由多種成分構(gòu)成的，因缺乏有效的技術(shù)，當(dāng)前對(duì)腫瘤微環(huán)境的研究仍然以組織原位單一成分或離體蛋白質(zhì)芯片研究為主，主要包括間質(zhì)支架的主要成分膠原，腫瘤免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵成分巨噬細(xì)胞以及腫瘤新生血管等，無法原位闡明上述多種成分對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后的影響。另外，研究顯示腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過程中需要依賴巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管的共同參與，兩者缺一不可。因此，由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管共同構(gòu)成的腫瘤轉(zhuǎn)移單元是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的必備條件。并且，單一的巨噬細(xì)胞及腫瘤新生血管定量分析顯示其與腫瘤分級(jí)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，而腫瘤轉(zhuǎn)移單元每增加10個(gè),遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)便會(huì)提高2倍(Robinson BD, Sica GL, Liu YF, etal.Tumor Microenvironment of Metastasis in Human Breast Carcinoma:A PotentialPrognostic Marker Linked to Hematogenous Dissemination.Clinical CancerResearch.2009, 15:2433-2441.)。然而，目前并沒有可靠的方法學(xué)研究能預(yù)測(cè)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，因此腫瘤轉(zhuǎn)移單元的計(jì)數(shù)有可能成為良好的預(yù)測(cè)患者侵襲轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。
[0003]另外，目前有關(guān)腫瘤轉(zhuǎn)移單元的計(jì)算是采用免疫組織化學(xué)多色染色方法，不同顏色之間的分辨率低，誤差大，并且采用的是人工計(jì)數(shù)方法，個(gè)體差異大，尤其是在腫瘤轉(zhuǎn)移單元數(shù)量龐大時(shí)，人工計(jì)算幾乎不可能完成，這嚴(yán)重阻礙了其在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中的發(fā)展。
[0004]近年來發(fā)展起來的量子點(diǎn)多色成像技術(shù)，以其具有以下優(yōu)勢(shì):1)連續(xù)而寬的激發(fā)光譜，物理尺寸和組份比例可調(diào)性；2)可同時(shí)進(jìn)行多色標(biāo)記，檢測(cè)靈敏度高；3)抗光漂白能力強(qiáng)；4)熒光強(qiáng)度高而穩(wěn)定；5)生物相容性好，抗組織自發(fā)熒光干擾能力強(qiáng)；6)摩爾熒光量子產(chǎn)率高，突破了傳統(tǒng)熒光材料探針局限，已在腫瘤的分子成像中取得重要進(jìn)展(ChenC，Peng J, Sun SR, et al.Tapping the potentials of quantum dots into clinicalapplication for personalized oncology:current status and future perspectives.Nanomedicine, 2012, 7 (3):411-428.),為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)由腫瘤微環(huán)境中多組分構(gòu)成的單元計(jì)算奠定基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便。該方法不僅可對(duì)由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及腫瘤新生血管構(gòu)成的腫瘤轉(zhuǎn)移單元進(jìn)行快速計(jì)算，更重要地是其具有普適性，也能定量計(jì)算由其他與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要成分構(gòu)成的單元，為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供了很好的技術(shù)支持，有望預(yù)測(cè)患者預(yù)后及指導(dǎo)個(gè)體化治療。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明要用以下技術(shù)措施:
[0007]—種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法，其步驟如下:
[0008]I)腫瘤組織量子點(diǎn)雙染，并進(jìn)行光譜圖像的采集及信號(hào)分離；
[0009]2)以綠色細(xì)胞為中心，以N微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內(nèi)出現(xiàn)紅色信號(hào)，則計(jì)為1，否則為0，最終輸出此張圖片的腫瘤轉(zhuǎn)移單元數(shù)量，具體方法如下:
[0010]a)圖像預(yù)處理:提取腫瘤組織量子點(diǎn)雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲；采用閾值法將其轉(zhuǎn)換成二值化圖，通過形態(tài)學(xué)開重建操作消除突刺，切斷細(xì)小搭接部分以提高小區(qū)域輪廓光滑度?？斩刺畛洌コ∶娣e雜質(zhì)區(qū)域后所得圖像為綠色細(xì)胞初始分割圖；采用面積閾值M將綠色細(xì)胞初始分割圖像劃分為單個(gè)細(xì)胞圖像和粘連細(xì)胞圖像；
[0011]b)標(biāo)記提取:提取粘連細(xì)胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對(duì)圖像求反操作后擴(kuò)展局部最小區(qū)域，通過形態(tài)學(xué)閉重建和空洞填充操作后將其作為細(xì)胞的內(nèi)部標(biāo)記，將粘連區(qū)域外作為綠色細(xì)胞信號(hào)外部標(biāo)記；
[0012]所述的局部最小區(qū)域?yàn)榱炼戎迪嗤移渲車牧炼戎刀急人蟮膮^(qū)域；
[0013]c)采用分水嶺算法對(duì)粘連細(xì)胞分離，得到綠色細(xì)胞信號(hào)分割圖，統(tǒng)計(jì)綠色細(xì)胞信號(hào)總數(shù)；
[0014]d)對(duì)每一個(gè)綠色細(xì)胞，提取與其邊界距離小于或等于N微米的擴(kuò)展區(qū)域，如果該區(qū)域內(nèi)有紅色信號(hào)點(diǎn)則該綠色細(xì)胞滿足條件，統(tǒng)計(jì)所有滿足條件細(xì)胞數(shù)；
[0015]其中:N=a+b+c;M=pi*b~2 ；
[0016]a為腫瘤細(xì)胞的平均半徑，b為綠色熒光細(xì)胞的平均半徑，c為紅色熒光細(xì)胞的平均半徑。
[0017]本發(fā)明所述的算法，如未特別說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知常用算法。
[0018]本發(fā)明所述的腫瘤轉(zhuǎn)移單元是由腫瘤細(xì)胞及其他兩種細(xì)胞一起構(gòu)成的一個(gè)整體，并且在空間分布上，必須滿足三者共同出現(xiàn)在一個(gè)以這三種細(xì)胞平均直徑之和為直徑的圓中。在實(shí)際工作中，并不局限于這些特定細(xì)胞，其他與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞一起也可定義為一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移單元，本發(fā)明的計(jì)數(shù)方法具備普適性。
[0019]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0020]1、可在同一張腫瘤組織切片上實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)多組分同時(shí)成像，并將腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵成分腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管作為一個(gè)整體來分析，充分考慮了三種成分的空間分布特征；
[0021]2、利用計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行計(jì)算，檢測(cè)速度快，穩(wěn)定性好，不需要人工計(jì)算，避免個(gè)體判斷誤差；[0022]3、操作步驟簡(jiǎn)單；
[0023]4、普適性好；
[0024]5、本發(fā)明提供的一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤進(jìn)展過程中由腫瘤微環(huán)境關(guān)鍵成分腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管構(gòu)成的腫瘤轉(zhuǎn)移單元快速準(zhǔn)確計(jì)算，并可拓展用于由其他腫瘤微環(huán)境成分構(gòu)成的單元計(jì)算，有利于推動(dòng)腫瘤個(gè)體化治療的發(fā)展。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0026]①在安裝有多光譜分析儀的熒光顯微鏡下采集腫瘤組織量子點(diǎn)成像圖片；②利用光譜分析軟件對(duì)兩種信號(hào)進(jìn)行分離；③計(jì)算腫瘤轉(zhuǎn)移單元的數(shù)量，輸出腫瘤轉(zhuǎn)移單元個(gè)數(shù)(每個(gè)框就代表1個(gè)轉(zhuǎn)移單元)?！痉糯蟊稊?shù):200X (a，b，c).圖像由CRi Nuance多光譜細(xì)胞成像系統(tǒng)(Cambridge Research&Instrumentation, Inc., Woburn, MA, USA)米集和信號(hào)分離】圖2為3例胃癌患者的組織切片量子點(diǎn)成像和腫瘤轉(zhuǎn)移單元分析示意圖及輸出的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]A.腫瘤組織石蠟切片:福爾馬林固定后石蠟包埋的腫瘤組織切片，厚度4 μ m，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上；
[0030]B.腫瘤組織切片的準(zhǔn)備:將組織切片置于烤箱60°C烘烤2小時(shí)，接著二甲苯脫蠟3次(不同的脫蠟缸)，每次5分鐘，脫蠟后將組織切片依次放入無水乙醇5分鐘、95%酒精2分鐘、90%酒精2分鐘和85%酒精2分鐘，流水沖洗3分鐘；
[0031]C.組織切片的抗原修復(fù):用檸檬酸三鈉29.41g，雙蒸水1000ml配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬酸10.5g，雙蒸水500ml配制檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20.25ml、檸檬酸緩沖液4.75ml加入225ml雙蒸水配制成檸檬酸抗原修復(fù)液(0.01M/L，pH6.0，250ml)ο將組織切片置入含上述抗原修復(fù)液的修復(fù)盒中進(jìn)行微波修復(fù)，中高火修復(fù)5分鐘后轉(zhuǎn)至中火修復(fù)20分鐘，然后待玻片自然冷卻；
[0032]D.清洗組織切片:先用流水沖洗3分鐘，然后用三羥基氨基甲烷(Tris) 6.05g，氯化鈉38.0g，雙蒸水5000ml，配制0.01M/L、pH7.2-7.4的TBS作為洗滌液，洗滌3次，每次3分鐘；
[0033]E.封閉組織切片:將上述組織切片放入孵育盒中，用2%wt/vol牛血清白蛋白封閉(用上述TBS配置)30分鐘，37 0C ；
[0034]F.一抗孵育:甩掉上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細(xì)胞單克隆抗體(稀釋比:1/100)和山羊抗人⑶105多克隆抗體(腫瘤新生血管標(biāo)志物，稀釋比:1/300)混合物(用上述封閉液稀釋)，濕盒孵育，4°C冰箱過夜；
[0035]G.沖洗組織切片，沖洗液為含0.5%vol/vol吐溫#20的TBS，TBS按上述步驟D的配方制備，洗滌3次，每次3分鐘；[0036]H.再次封閉組織切片，同步驟E ；
[0037]1.二抗孵育:甩掉上述封閉液后，滴加QDs525_F (ab) 2和QDs655_F (ab)2混合物(稀釋液同步驟F)，濕盒孵育，37°C，2h ；
[0038]J.沖洗切片；沖洗液與上述步驟G所用相同，TBS按上述步驟D的配方制備，洗滌3次，每次3分鐘；
[0039]K.封片觀察:用甘油90ml和TBSlOml配成90%緩沖甘油，緩沖甘油封片，用熒光顯微鏡觀察圖像。
[0040]實(shí)施例2:
[0041]圖像采集及腫瘤轉(zhuǎn)移單元的計(jì)數(shù)，具體如下:
[0042]I)CRi Nuance多光譜細(xì)胞成像系統(tǒng)(Cambridge Research&Instrumentation, Inc.，Woburn，MA，USA)，用紫外光激發(fā)，采集腫瘤組織量子點(diǎn)雙染圖像(圖1b);在腫瘤組織區(qū)域分離出綠色巨噬細(xì)胞信號(hào)和紅色腫瘤新生血管信號(hào)(圖1c)；
[0043]2)腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)，以綠色信號(hào)為中心，以30微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內(nèi)出現(xiàn)紅色信號(hào)，則計(jì)為1，否則為0，最終輸出此張圖片的腫瘤轉(zhuǎn)移單元數(shù)量，具體如下:
[0044]a)圖像預(yù)處理:由于腫瘤組織量子點(diǎn)雙染圖像受噪聲影響存在大量的偽極小值點(diǎn)而容易導(dǎo)致分水嶺嚴(yán)重的過分割現(xiàn)象，在分割執(zhí)行前對(duì)圖像執(zhí)行降噪等預(yù)處理。提取腫瘤組織量子點(diǎn)雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲。采用自適應(yīng)大津閾值法將其轉(zhuǎn)換成二值化圖，通過形態(tài)學(xué)開重建操作消除突刺，切斷細(xì)小搭接部分以提高小區(qū)域輪廓光滑度。空洞填充，去除小面積雜質(zhì)區(qū)域后所得圖像為綠色巨噬細(xì)胞初始分割圖；由于綠色巨噬細(xì)胞存在部分粘連現(xiàn)象，采用面積閾值300 (巨噬細(xì)胞直徑大小一般為10-30微米，取中位數(shù)20計(jì)算面積pi*r~2)將綠色巨噬細(xì)胞信號(hào)初始分割圖劃分為單個(gè)細(xì)胞圖像和粘連細(xì)胞圖像；
[0045]b)標(biāo)記提取:準(zhǔn)確提取與綠色巨噬細(xì)胞信號(hào)區(qū)域密切相關(guān)的標(biāo)記是控制分水嶺算法過分割的關(guān)鍵問題，由于綠色巨噬細(xì)胞信號(hào)內(nèi)部強(qiáng)度均勻且亮度較周圍區(qū)域明顯，采用擴(kuò)展局部最小區(qū)域提取內(nèi)部標(biāo)記。提取粘連細(xì)胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對(duì)圖像求反操作后采用強(qiáng)度閾值30擴(kuò)展局部最小區(qū)域(局部最小區(qū)域即亮度值相同且其周圍的亮度值都比它大)，通過形態(tài)學(xué)閉重建和空洞填充操作后將其作為細(xì)胞的內(nèi)部標(biāo)記(每一個(gè)內(nèi)部標(biāo)記對(duì)應(yīng)著一個(gè)鋸齒細(xì)胞)，將粘連區(qū)域外作為綠色巨噬細(xì)胞信號(hào)外部標(biāo)記；
[0046]c)采用分水嶺算法(一種基于拓?fù)淅碚摰臄?shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的分割方法，其基本思想是把圖像看作是測(cè)地學(xué)上的拓?fù)涞孛?，圖像中每一點(diǎn)像素的灰度值表示該點(diǎn)的海拔高度，每一個(gè)局部極小值及其影響區(qū)域稱為集水盆，而集水盆的邊界則形成分水嶺。分水嶺的概念和形成可以通過模擬浸入過程來說明。在每一個(gè)局部極小值表面，刺穿一個(gè)小孔，然后把整個(gè)模型慢慢浸入水中，隨著浸入的加深，每一個(gè)局部極小值的影響域慢慢向外擴(kuò)展，在兩個(gè)集水盆匯合處構(gòu)筑大壩，即形成分水嶺)對(duì)粘連細(xì)胞分離。綜合后得到綠色細(xì)胞信號(hào)分割圖，統(tǒng)計(jì)綠色細(xì)胞信號(hào)總數(shù)；
[0047]d)對(duì)每一個(gè)綠色細(xì)胞，提取與其邊界距離小于或等于30微米的擴(kuò)展區(qū)域，如果該區(qū)域內(nèi)有紅色信號(hào)點(diǎn)則該綠色細(xì)胞滿足條件，統(tǒng)計(jì)所有滿足條件細(xì)胞數(shù)。
[0048]采用上述相同的計(jì)算方法，分別對(duì)5張按照上述方法采集的圖片進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移單元的計(jì)算，進(jìn)行疊加后即為該患者的腫瘤轉(zhuǎn)移單元總數(shù)。
[0049]本發(fā)明所述的腫瘤轉(zhuǎn)移單元是由胃癌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和腫瘤新生血管共同構(gòu)成的，三種細(xì)胞的平均半徑均為10微米，并且在空間分布上，必須滿足上述計(jì)算條件。在實(shí)際工作中，并不局限于這些特定細(xì)胞，其他與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞一起也可定義為一種新的單元，本發(fā)明的計(jì)數(shù)方法具備普適性。
[0050]實(shí)施例3:
[0051]腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)的有效性:
[0052] 申請(qǐng)人:對(duì)30例胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)研究，高分化管狀腺癌10例，低分化管狀腺癌10例，印戒細(xì)胞癌10例,其臨床基本參數(shù)沒有差異,但是單個(gè)巨噬細(xì)胞、新生血管及腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)在三組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證實(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)算及分析的有效性。
[0053]
表1.30例胃癌患者的臨床病理特征
【權(quán)利要求】
1.一種基于量子點(diǎn)光譜分析及圖像解析的腫瘤轉(zhuǎn)移單元計(jì)數(shù)方法，其步驟如下: 1)腫瘤組織量子點(diǎn)雙染，并進(jìn)行光譜圖像的采集及信號(hào)分離； 2)以綠色細(xì)胞為中心，以N微米為半徑向周圍拓展，在該范圍內(nèi)出現(xiàn)紅色信號(hào)，則計(jì)為1，否則為O，最終輸出此張圖片的腫瘤轉(zhuǎn)移單元數(shù)量，具體方法如下: a)圖像預(yù)處理:提取腫瘤組織量子點(diǎn)雙染圖像RGB顏色通道中的綠色通道，通過3*3模板中值濾波平滑噪聲；采用閾值法將其轉(zhuǎn)換成二值化圖，通過形態(tài)學(xué)開重建操作消除突刺，切斷細(xì)小搭接部分以提高小區(qū)域輪廓光滑度；空洞填充，去除小面積雜質(zhì)區(qū)域后所得圖像為綠色細(xì)胞初始分割圖；采用面積閾值M將綠色細(xì)胞初始分割圖像劃分為單個(gè)細(xì)胞圖像和粘連細(xì)胞圖像； b)標(biāo)記提取:提取粘連細(xì)胞圖像與原綠色通道圖像疊加，對(duì)圖像求反操作后擴(kuò)展局部最小區(qū)域，通過形態(tài)學(xué)閉重建和空洞填充操作后將其作為細(xì)胞的內(nèi)部標(biāo)記，將粘連區(qū)域外作為綠色細(xì)胞信號(hào)外部標(biāo)記； 所述的局部最小區(qū)域?yàn)榱炼戎迪嗤移渲車牧炼戎刀急人蟮膮^(qū)域； c)采用分水嶺算法對(duì)粘連細(xì)胞分離，得到綠色細(xì)胞信號(hào)分割圖，統(tǒng)計(jì)綠色細(xì)胞信號(hào)總數(shù)； d)對(duì)每一個(gè)綠色細(xì)胞，提取與其邊界距離小于或等于N微米的擴(kuò)展區(qū)域，如果該區(qū)域內(nèi)有紅色信號(hào)點(diǎn)則該綠色細(xì)胞滿足條件，統(tǒng)計(jì)所有滿足條件細(xì)胞數(shù)；
其中:N=a+b+c ;M=pi*b~2 ； a為腫瘤細(xì)胞的平均半徑，b為綠色熒光細(xì)胞的平均半徑，c為紅色熒光細(xì)胞的平均半徑。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103760140SQ201410006423
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】方敏, 李雁, 屈愛平, 劉娟, 袁靜萍 申請(qǐng)人:李雁