一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括將待測樣品用氫氧化鉀溶液提取，提取液用反相填料前處理小柱凈化，使用IonPac?AS19色譜柱分離，KOH淋洗液洗脫，之后在負(fù)離子模式下用Orbitrap高分辨檢測器全掃描模式檢測，測得的數(shù)據(jù)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)對比進行篩查和鑒定；該方法降低了對樣品前處理的要求，有效的節(jié)省了樣品前處理時間，極大的縮短了測出被測物的保留時間，可排除假陽性，采集的數(shù)據(jù)可根據(jù)檢測需求反復(fù)調(diào)用。
【專利說明】一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳制品中的有機酸具有抑制有害菌的繁殖、提供不同風(fēng)味的作用，在乳制品產(chǎn)品中廣泛存在。其主要來源分為生產(chǎn)添加和天然產(chǎn)物兩種途徑:生產(chǎn)加工過程常使用蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、富馬酸、磷酸等作為酸度調(diào)節(jié)劑；天然有機酸主要是由乳脂肪水解產(chǎn)生自由脂肪酸如乙酸、丁酸，牛的生理代謝產(chǎn)生檸檬酸、乳清酸、尿酸，細(xì)菌及乳酸菌的分解代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酮酸、丙酸、甲酸，同型乳酸發(fā)酵將幾乎全部的碳源經(jīng)丙酮酸代謝轉(zhuǎn)化為乳酸，也可以產(chǎn)生其它有機酸及風(fēng)味代謝產(chǎn)物。
[0003]由于其相對較高的安全性，除富馬酸外，我國的國家標(biāo)準(zhǔn)中對這些有機酸的使用并沒有限量規(guī)定，最大使用量為“根據(jù)生產(chǎn)需要”而定。但實驗研究表明，長期食用或食入過量有機酸同樣會對人體產(chǎn)生損害，秦淑貞等在小鼠中進行的急性毒性試驗結(jié)果顯示:檸檬酸本身毒性輕微，但與重金屬螯合后會導(dǎo)致肝細(xì)胞彌漫性壞死，肝小葉消失。
[0004]為避免在食品生產(chǎn)過程中不法商販無限制、無量的使用有機酸，世界上很多組織和國家都對有機酸的使用范圍和限量都作了相應(yīng)規(guī)定:國際食品法典委員會(ACA)規(guī)定水果汁中檸檬酸限量3000mg/kg，酒石酸限量4000mg/kg，嬰幼兒的補充食品中乳酸限量2000mg/kg,乙酸限量5000mg/kg,生面制品、面條中富馬酸限量700mg/kg ;歐盟規(guī)定干制粉狀甜品混合物中富馬酸限量4000g/kg，餅干和面包干中酒石酸限量5000g/kg ;我國臺灣尤其單獨規(guī)定嬰兒食品中不得使用蘋果酸。
[0005]目前，食品、環(huán)境、化工、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的檢測技術(shù)中，針對陰離子、陽離子、水溶性和極性小分子化合物常采用離子色譜分析技術(shù)。但是，離子色譜儀檢測時間較長，通常為40-60min，且僅憑保留時間作為定性定量依據(jù)，無法提供結(jié)構(gòu)信息，對于保留時間相同的物質(zhì)無法進一步進行結(jié)構(gòu)上的確認(rèn)，從而易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
[0006]質(zhì)譜技術(shù)可以在分析過程中提供更準(zhǔn)確的定性定量檢測，近年來有關(guān)離子色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已有報道，法蕓等利用毛細(xì)管離子色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析裝置進行有機酸、糖、醇等水溶性組分的分析，但其采用的低分辨質(zhì)譜僅能對已提供標(biāo)準(zhǔn)品的既定化合物進行分析，無法對難以獲取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的、或無法規(guī)要求的非既定化合物進行篩查，難以滿足當(dāng)今世界各地法律法規(guī)頻繁更新的檢測要求；且低分辨質(zhì)譜在采集開始前即已設(shè)定參數(shù)，一旦采集無法反復(fù)調(diào)用多層數(shù)據(jù)。
[0007]高分辨質(zhì)譜具有質(zhì)量分辨率高和精確分子量的功能，因此對樣品前處理的要求降低，有效的節(jié)省了樣品前處理時間；且由于其高分辨的優(yōu)勢，無需在色譜分離上進行分段分離即可將待測組分識別，色譜分離時間由此由原來的50-60min縮短為30min左右；高分辨質(zhì)譜在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測需求反復(fù)調(diào)用，在不提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下仍然能夠進行篩查分析，由此彌補傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜方法的不足；其數(shù)據(jù)依賴性掃描可以在篩查的同時，通過碎片離子進行定性確證。近年來通過與液相色譜串聯(lián)的方式在食品檢測、蛋白質(zhì)組學(xué)等方面已開始逐漸應(yīng)用，但在與離子色譜串聯(lián)應(yīng)用的檢測領(lǐng)域尚屬空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法。
[0009]一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括以下步驟:
[0010]將待測樣品用氫氧化鉀溶液提取，提取液用反相填料前處理小柱凈化，使用1nPac AS19色譜柱分離，KOH淋洗液洗脫，之后在負(fù)離子模式下用Orbitrap高分辨檢測器全掃描模式檢測，根據(jù)測得的數(shù)據(jù)進行篩查和鑒定；
[0011]優(yōu)選地，色譜條件為:
[0012]柱溫:35O;
[0013]流速:0.25mT ,/mi η ；
[0014]流動相:30mMKOH ；
[0015]質(zhì)譜條件為:
[0016]電噴霧離子源；
[0017]噴霧電壓:5.0OkV
[0018]質(zhì)荷比范圍:50-300
[0019]毛細(xì)管電壓:-21.0OV
[0020]管透鏡電壓:-128.70V
[0021]毛細(xì)管溫度:350°C;
[0022]鞘氣(N2)流速:17L/min(即30arb)；
[0023]輔助氣(N2)流速:8L/min(即IOarb)；
[0024]分辨率R=60000。
[0025]進一步地，氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為1%。
[0026]進一步地，所述反相填料前處理小柱是RP前處理小柱。
[0027]RP前處理小柱為Thermo RP前處理小柱。進一步地，RP前處理小柱使用前依次用IOmL水、IOmL甲醇、IOmL水活化,之后再將提取液上樣。實際操作中，棄去前5mL液體后，收集過濾液,過濾液用色譜柱分離。
[0028]進一步地，色譜柱米用1nPac AS19, 250mmX 2.1mm, 2.5 μ m。
[0029]進一步地,色譜條件中,樣品室溫度:10°C ;進樣量:10μ L ;分析時間:30min。
[0030]KOH淋洗液梯度洗脫是自動發(fā)生器在線自動產(chǎn)生KOH淋洗液進行梯度洗脫。
[0031]可采用Xcalibar軟件對樣品中各化合物的分子式、保留時間、一級質(zhì)譜質(zhì)荷比、天然同位素分布等信息進行采集。
[0032]使用的儀器為:離子色譜系統(tǒng):Dionex ICS-2000 ；高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)=ThermoLTQ-Orbitrap XL0
[0033]本發(fā)明的有益效果如下:[0034]1、本發(fā)明建立了一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，應(yīng)用的離子色譜-高分辨質(zhì)譜新型分析裝置具有高分辨率、高靈敏性的特征，降低了對樣品前處理的要求，有效的節(jié)省了樣品前處理時間。
[0035]2、本發(fā)明無需在色譜分離上進行分段分離即可將待測組分識別，極大的縮短了測出被測物的保留時間，從原有的離子色譜儀40-60min縮短為30min左右。
[0036]3、本發(fā)明能在提供保留時間的同時提供精確分子量，將此雙向信息結(jié)合應(yīng)用分析，可利用其結(jié)構(gòu)信息排除假陽性，利用其保留時間分辨同分異構(gòu)體。
[0037]4、本發(fā)明在全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以根據(jù)檢測需求反復(fù)調(diào)用，由此彌補傳統(tǒng)低分辨質(zhì)譜采集開始前即已設(shè)定參數(shù)，一旦采集無法反復(fù)調(diào)用多層數(shù)據(jù)的不足。
[0038]5、本發(fā)明可以在不提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下進行非既定目標(biāo)物的篩查分析，是應(yīng)對當(dāng)今世界各地法律法規(guī)頻繁更新的檢測要求的極為有效的應(yīng)用。
[0039]6、本發(fā)明的數(shù)據(jù)依賴性掃描可以在篩查的同時實現(xiàn)通過碎片離子進行定性確證的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細(xì)的說明；
[0041]圖1為實例I中樣品的全掃描高分辨質(zhì)譜圖；
[0042]圖2為硫酸的XIC Ca)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b)；
[0043]圖3為磷酸的XIC Ca)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b)；
[0044]圖4為乳酸的XIC Ca)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b)；
[0045]圖5是實例2中的多個樣品的樣品全掃描高分辨質(zhì)譜圖(a)和酒石酸(b)、乳酸(C)、檸檬酸(d)和蘋果酸(e)的XIC圖；
[0046]圖6是實例2中酒石酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0047]圖7是實例2中乳酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0048]圖8是實例2中酒檸檬酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0049]圖9是實例2中蘋果酸的高分辨質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0050]為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)包括權(quán)利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0051]實施例1
[0052]一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，包括以下步驟:
[0053]樣品提取:待測乳制品ImL用IOmLl %氫氧化鉀溶液提取充分混合，在4°C、12000r/min離心lOmin。取上清液,待凈化；
[0054]前處理柱凈化:Thermo RP前處理小柱，使用前RP前處理小柱依次用IOmL水、IOmL甲醇、IOmL水活化；之后再將上清液上樣；
[0055]收集:棄去RP柱流出的前5mL過濾液，收集后端清液，待測；
[0056]上機檢測:通過離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對樣品進行篩查和鑒定；[0057]色譜條件為:
[0058]離子色譜系統(tǒng):DionexICS2000
[0059]色譜柱:Dionex1nPac AS19, 250mmX 2.1mm, 2.5 μ m ;
[0060]柱溫:35°C;
[0061]樣品室溫度:10 C ;
[0062]進樣量:IOyL;
[0063]流速:0.25mT ,/mi η ；
[0064]流動相:30mMK0H；
[0065]分析時間:30min。
[0066]質(zhì)譜條件:
[0067]高分辨質(zhì)譜系統(tǒng):ThermoLTQ-Orbitrap XL
[0068]電噴霧離子源；負(fù)離子模式；
[0069]噴霧電壓:5.0OkV
[0070]質(zhì)荷比范圍:50-300
[0071]毛細(xì)管電壓:-21.0OV
[0072]管透鏡電壓:-128.70V
[0073]毛細(xì)管溫度:350°C ；
[0074]鞘氣(N2)流速:17L/min(即30arb)；
[0075]輔助氣(N2)流速:8L/min(即 IOarb)；
[0076]掃描模式:0rbitrap檢測器全掃描(Full Scan)模式檢測；
[0077]全掃描的分辨率R=60000。
[0078]由Xcalibar軟件的XIC manager對樣品中各化合物的分子式、保留時間、一級質(zhì)譜質(zhì)荷比和天然同位素分布等信息進行采集。可通過用本方法對幾個已知的具有某種酸的樣品做陽性對照，測得數(shù)據(jù)與該數(shù)據(jù)進行比對，來進行篩查和鑒定。或者，用該數(shù)據(jù)與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫資源，如中國科學(xué)院化合物參考型數(shù)據(jù)庫等，中的數(shù)據(jù)來比對。經(jīng)比對，實施例1得到三種有機酸:硫酸、磷酸、乳酸。實驗結(jié)果如圖1、圖2、圖3和圖4所示。
[0079]圖1為實例I中樣品的全掃描高分辨質(zhì)譜圖；
[0080]圖2為硫酸的XIC Ca)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b)；
[0081]圖3為磷酸的XIC (a)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b);
[0082]圖4為乳酸的XIC (a)和高分辨質(zhì)譜鑒定圖示(b)。
[0083]實施例2
[0084]將28個市購乳制品使用同實施例1的方法進行樣品處理、儀器測量、數(shù)據(jù)分析，得到4種有機酸:酒石酸、乳酸、檸檬酸和蘋果酸的篩查結(jié)果。實驗結(jié)果如圖5?9所示。
[0085]圖5是實例2中的多個樣品的樣品全掃描高分辨質(zhì)譜圖(a)和酒石酸(b)、乳酸(C)、檸檬酸(d)和蘋果酸(e)的XIC圖；
[0086]圖6是實例2中酒石酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0087]圖7是實例2中乳酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0088]圖8是實例2中酒檸檬酸的高分辨質(zhì)譜圖；
[0089]圖9是實例2中蘋果酸的高分辨質(zhì)譜圖。[0090] 顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【權(quán)利要求】
1.一種同時快速篩查鑒定乳制品中多種有機酸的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，包括以下步驟: 將待測樣品用氫氧化鉀溶液提取，提取液用反相填料前處理小柱凈化，使用1nPacAS19色譜柱分離，KOH淋洗液洗脫，之后在負(fù)離子模式下用Orbitrap高分辨檢測器全掃描模式檢測，根據(jù)測得的數(shù)據(jù)進行篩查和鑒定； 優(yōu)選地，色譜條件為: 柱溫:35°C ；
流速:0.25mT,/mi η ； 流動相:30mM KOH ； 質(zhì)譜條件為: 電噴霧離子源； 噴霧電壓:5.0OkV ； 質(zhì)荷比范圍:50-300 ； 毛細(xì)管電壓:-21.0OV ； 管透鏡電壓:-128.7OV ； 毛細(xì)管溫度:350°C ； 鞘氣流速:17L/min ； 輔助氣流速:8L/min ； 分辨率R=60000。
2.如權(quán)利要求1所述的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，所述氫氧化鉀溶液的質(zhì)量濃度為I %。
3.如權(quán)利要求1所述的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，所述反相填料前處理小柱是RP前處理小柱。
4.如權(quán)利要求1所述的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，所述RP前處理小柱使用前依次用IOmL水、IOmL甲醇、IOmL水活化，之后再將提取液上樣。
5.如權(quán)利要求1所述的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，所述1nPacAS19 色譜柱是 SOmmX 2.1mm, 2.5 μ m。
6.如權(quán)利要求1所述的離子色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用方法，其特征在于，色譜條件中，樣品室溫度:10°c ;進樣量:10μ L ;分析時間:30min。
【文檔編號】G01N30/06GK103743849SQ201410012038
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】云環(huán), 張春艷, 劉鑫, 盧華衛(wèi), 鄭書展, 潘國卿, 王博 申請人:內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心