一種病人血液中百草枯的快速檢測方法
【專利摘要】一種病人血液中百草枯的快速檢測方法，1）百草枯高效液相色譜法的建立：HPLC條件：高效液相色譜儀，色譜柱shim-pack:vp-ODS柱（4.6mm*250mm,5μm），流動相：乙腈-0.02mol/L辛烷基磺酸鈉，辛烷基磺酸鈉用0.26moL/L的磷酸調(diào)pH值為2.5；流速：1.0mL·min-1；柱溫25℃；檢測波長254nm；2）PQ含藥血清的制備：對照品的制備：精密吸取健康人血清200μL，加入已知濃度的PQ水溶液100μL，加入乙腈400μL混漩，離心10min，取上清液,離心10min，取上清液進(jìn)行HPLC分析；3）樣品的制備：精密吸取病人血清200μL，加入乙腈400μL混漩1min，離心10min，取上清液,離心10min，取上清液進(jìn)行HPLC分析；4）空白溶液的制備：精密吸取健康人血清200μL，加入蒸餾水100μL，加入乙腈400μL混漩1min，離心10min，取上清液,離心10min，取上清液進(jìn)行HPLC分析。
【專利說明】一種病人血液中百草枯的快速檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種病人血液中百草枯的快速檢測方法。
【背景技術(shù)】[0002]我國是世界上農(nóng)藥生產(chǎn)和消費(fèi)的大國，由于大量的使用農(nóng)藥，農(nóng)藥中毒現(xiàn)象也越來越多。百草枯(paraquat, PQ),又名克無蹤、對草快,化學(xué)名稱為I, I' - 二甲基-4,4f -聯(lián)吡啶二氯化物，分子量257.2，為中等毒性的有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑，對人畜有較強(qiáng)的毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道、消化道吸收造成急性中毒，由于目前尚無特效解毒劑，PQ中毒后死亡率較高，其血漿濃度與死亡率密切相關(guān)。臨床上，口服百草枯中毒病情可分為以下三型:(1)輕度:口服百草枯< 20mg/kg，患者僅有輕度胃腸道癥狀，一般能完全恢復(fù)，沒有明顯的后遺癥。(2)重度:服毒量20-40mg/kg，僅有部分患者能存活。一般病程:1-4天內(nèi)出現(xiàn)腎功能損害、肝損害、血壓下降、心動過速等癥狀和體征，1-2周內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、咳血、胸腔積液、肺纖維化，2-3周后進(jìn)一步發(fā)展為呼吸窘迫綜合征而死亡。(3)極重度:服毒量>40mg/kg，幾天內(nèi)出現(xiàn)肝、腎功能衰竭、消化道潰瘍、胰腺炎、心肌炎、低血壓、昏迷、抽搐，1-4天內(nèi)死于多器官功能衰竭。由于百草枯中毒機(jī)制尚不完全明確，而且缺乏有效特異的治療手段，其中毒可導(dǎo)致極高的病死率，給急診醫(yī)療工作者帶來了巨大的挑戰(zhàn)。因此，了解百草枯中毒預(yù)后相關(guān)因素對于指導(dǎo)臨床治療有重要意義，在過去30年中，許多關(guān)于百草枯中毒預(yù)后的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究相繼開展，但多數(shù)實(shí)驗(yàn)均未找到一個評價百草枯中毒預(yù)后的早期、有效、實(shí)用的特異性指標(biāo)。
[0003]1966年英國醫(yī)學(xué)家Bul I ivant首先描述了 2例PQ意外中毒死亡事件，隨后世界各地相繼報道了 PQ中毒病例并對PQ毒性進(jìn)行了深入的研究。雖然各國學(xué)者對此作了廣泛深入的研究，但至今仍未完全明了 PQ中毒機(jī)制，亦無有效拮抗藥物，人口服致死量約為3.0g,因而死亡率達(dá)90%。若在攝入后6h、8h、24h，血液中？0濃度超過21^*卜1、1.21^.!^、
0.2mg * L-1,則難以存活。國外早在上世紀(jì)70年代，就開始對百草枯殘留的檢測方法進(jìn)行研究，近年來在這方面的研究工作取得了較快的進(jìn)展。高靈敏度的儀器分析法和快速有效的免疫分析法正逐漸被應(yīng)用于百草枯殘留的檢測，其中最廣泛的當(dāng)屬高效液相色譜儀。國內(nèi)雖已有關(guān)于血?dú)夥治雠c百草枯中毒預(yù)后相關(guān)的研究報道，目前臨床上常通過連二亞硫酸鈉間接測定中毒者血中百草枯濃度。但對血液中百草枯濃度測要求較高，國內(nèi)多數(shù)醫(yī)院尚無法開展該檢查。血漿百草枯濃度0.5~2小時即可達(dá)到峰值，而后迅速分布到周圍組織，故中毒早期監(jiān)測其濃度意義更大。
[0004]隨著PQ在我國生產(chǎn)和使用量的增加，急性PQ中毒人數(shù)也逐年增加。中毒致死患者約90%是自殺性口服所致，而且主要發(fā)生在農(nóng)村。PQ 口服病死率達(dá)60%-90%，且存活者中絕大多數(shù)存在肺纖維化，預(yù)后極差，基層地區(qū)由于缺乏對PQ中毒認(rèn)識病死率更高。PQ中毒已成為嚴(yán)重影響我國人民群眾健康的急危重癥，超越毒鼠強(qiáng)和有機(jī)磷中毒成為致死性最高的農(nóng)藥中毒事件。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)是目前迫切需要解決的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種病人血液中百草枯的快速檢測方法，主要采用高效液相色譜法對病人血液中百草枯的濃度進(jìn)行含量測定，并研究一種快速、準(zhǔn)確的制備含藥血清的方法，建立安全、有效、快速的百草枯檢測方法。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0007]一種病人血液中百草枯的快速檢測方法
[0008]I)百草枯高效液相色譜(HPLC)法的建立
[0009]高效液相色譜法條件:島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱shim-pack: vp-ODS(其中shim-pack: vp-ODS所代表的的是柱子的型號,是島津公司的一款反相高效液相色譜柱)，柱:4.6mm*250mm, 5 μ m,流動相:乙腈-0.02mol/L辛烷基磺酸鈉(40:60)，辛烷基磺酸鈉用0.26moL/L的磷酸調(diào)pH值為2.5 ;流速:1.0mL.min—1 ;柱溫25 °C ;檢測波長254nm ；
[0010]2) PQ含藥血清的制備
[0011]對照品的制備
[0012]精密吸取健康人血清200 μ L，加入已知濃度的PQ水溶液100 μ L，加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析，得對照品峰面積Ar ；
[0013]樣品的制備
[0014]精密吸取病人血清200 μ L,加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心lOmin，取上清液進(jìn)行HPLC分析，得樣品峰面積Ax ；
[0015]空白血清的制備
[0016]精密吸取健康人血清200 μ L，加入蒸餾水100 μ L，加入乙腈400 μ L混漩lmin，3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析；
[0017]3) PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0018]用空白血清分別配制0.1，0.2，0.5，I，5，10，25，50和100 μ g/ml的百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)系列液，分裝后于4°C保存?zhèn)溆?，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以百草枯濃度(X)為橫坐標(biāo)，百草枯面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得PQ的回歸方程(y=ax+b)。
[0019]根據(jù)計(jì)算公式:Cx=Cr*Ax/Ar,
[0020]其中:Cx為樣品濃度
[0021]Cr為對照品濃度
[0022]Ax為樣品峰面積
[0023]Ar為對照峰品面積
[0024]根據(jù)上述公式進(jìn)行計(jì)算，得到病人血樣中百草枯的濃度，或者根據(jù)PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線，將Ax代入曲線，也可得到病人血樣中百草枯的濃度。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026]1.創(chuàng)新含藥血清的制備方法，改變傳統(tǒng)繁瑣的操作工藝，縮短血樣制備時間，以更大限度的來為病人增加救治時間，挽救病人生命。
[0027]2.以更加創(chuàng)新的方法縮短樣品分析時間，使整個液相色譜分析過程在7min內(nèi)完成，更快的為臨床提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明空白血清色譜圖；
[0029]圖2為本發(fā)明對照品色譜圖(tR=5.194min為PQ峰)；
[0030]圖3為本發(fā)明病人血清色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0032]一種病人血液中百草枯的快速檢測方法
[0033]I)百草枯高效液相色譜(HPLC)法的建立
[0034]高效液相色譜法條件:島津LC-20AT高效液相色譜儀，色譜柱shim-pack: vp_0DS(其中shim-pack:vp-0DS所代表的的是柱子的型號,是島津公司的一款反相高效液相色譜柱)，柱:4.6mm*250mm, 5 μ m,流動相:乙腈-0.02mol/L辛烷基磺酸鈉(40:60)，辛烷基磺酸鈉用0.26moL/L的磷酸調(diào)pH值為2.5 ;流速:1.0mL.min—1 ;柱溫25 °C ;檢測波長254nm ；
[0035]2) PQ含藥血清的制備
[0036]對照品的制備
[0037]精密吸取健康人血清200 μ L，加入已知濃度的PQ水溶液100 μ L，加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析，得對照品峰面積Ar ;參見圖2 ；
[0038]樣品的制備
[0039]精密吸取病人血清200 μ L,加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心lOmin，取上清液進(jìn)行HPLC分析，得樣品峰面積Ax ；
[0040]空白血清的制備
[0041]精密吸取健康人血清200 μ L，加入蒸餾水100 μ L，加入乙腈400 μ L混漩lmin，3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析；參見圖1 ;
[0042]根據(jù)計(jì)算公式:Cx=Cr*Ax/Ar,
[0043]其中:Cx為樣品濃度
[0044]Cr為對照品濃度
[0045]Ax為樣品峰面積
[0046]Ar為對照峰品面積
[0047]根據(jù)上述公式進(jìn)行計(jì)算，得到病人血樣中百草枯的濃度，或者根據(jù)PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線，將Ax代入曲線，也可得到病人血樣中百草枯的濃度。
[0048]如病人XX于2013年9月18日送來第二份經(jīng)過灌流后的血液，要求檢測血液中百草枯濃度。
[0049]實(shí)驗(yàn)方法:
[0050]精密吸取病人血清200 μ L,加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_l離心IOmin,取上清液，10000r/min-l離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析，得到樣品峰面積Ax,樣品濃度Cx ；[0051]精密吸取健康人血清200 μ L，加入已知濃度的PQ水溶液100 μ L，加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_l離心IOmin,取上清液，10000r/min-l離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析，得到對照品峰面積Ar，對照品濃度Cr ;參見圖3 ；
[0052]計(jì)算公式:Cx=Cr*Ax/Ar,
[0053]其中:Cx為樣品濃度
[0054]Cr為對照品濃度
[0055]Ax為樣品峰面積
[0056]Ar為對照峰品面積
[0057]根據(jù)上述公式進(jìn)行計(jì)算，得到病人血樣中百草枯的濃度，或者根據(jù)PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線，將Ax代入曲線，也可得到病人血樣中百草枯的濃度。
[0058]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【權(quán)利要求】
1.一種病人血液中百草枯的快速檢測方法，其特征在于:包括以下方法步驟 1)百草枯高效液相色譜法的建立 條件:高效液相色譜儀，色譜柱shim-pack: vp-ODS柱4.6mm*250mm, 5 μ m ;流動相:乙腈-0.02mol/L辛烷基磺酸鈉，辛烷基磺酸鈉用0.26moL/L的磷酸調(diào)pH值為2.5 ;流速:1.0mL.mirT1 ;柱溫 25°C ;檢測波長 254nm ； 2)PQ含藥血清的制備 對照品的制備 精密吸取健康人血清200 μ L，加入已知濃度的PQ水溶液100 μ L，加入乙腈400 μ L混游lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirf1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析；得對照品峰面積Ar ； 樣品的制備 精密吸取病人血清200 μ L,加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/min_1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析；得樣品峰面積Ax ； 空白血清的制備 精密吸取健康人血清200 μ L,加入蒸懼水100 μ L,加入乙腈400 μ L混鏇lmin, 3500r/mirT1離心IOmin,取上清液，lOOOOr/mirT1離心IOmin,取上清液進(jìn)行HPLC分析； 3)PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線 用空白血清分別配制0.1,0.2,0.5,1,5,10,25,50和100 μ g/ml的百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)系列液，分裝后于4°C保存?zhèn)溆?，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，以百草枯濃度(X)為橫坐標(biāo)，百草枯面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得PQ的回歸方程(y=ax+b)。 根據(jù)計(jì)算公式:Cx=Cr*Ax/Ar, 其中:Cx為樣品濃度 Cr為對照品濃度 Ax為樣品峰面積 Ar為對照峰品面積 根據(jù)上述公式進(jìn)行計(jì)算，得到病人血樣中百草枯的濃度，或者根據(jù)PQ標(biāo)準(zhǔn)曲線，將Ax代入曲線，也可得到病人血樣中百草枯的濃度。
【文檔編號】G01N30/88GK103837630SQ201410012726
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】楊京霞, 黃銀生, 蘭偉, 王中亮, 楊一紅, 屈長青 申請人:楊京霞