一種水環(huán)境中十種雌激素的共檢測技術的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時檢測水環(huán)境中十種雌激素的技術。通過固相萃取技術對水樣進行前處理后，使用液相色譜串聯質譜儀檢測其含量。本方法將采集后的水樣通過微孔濾膜除去水中懸浮的雜質顆粒，并通過固相萃取裝置將水樣中的雌激素濃縮富集到固相萃取柱上，然后用乙酸乙酯將富集在固相萃取柱的雌激素洗脫下來，用氮氣吹干，定容，最后用液相色譜串聯質譜儀檢測雌激素的含量。該方法操作簡便，回收率較高，耗時低，能同時檢測較多種類的雌激素。
【專利說明】一種水環(huán)境中十種雌激素的共檢測技術
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種運用液相色譜串聯質譜儀同時測定水環(huán)境中雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A等十種雌激素的方法。
【背景技術】
[0002]環(huán)境雌激素是一種外源性物質，能夠模擬和干擾人或動物體內雌激素的正常合成、運輸、結合等過程，能對機體的生殖系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)造成影響。環(huán)境中存在的雌激素主要包括天然雌激素如雌酮(Estrone, El), 17 β -雌二醇(17 β-Estradiol, E2)和雌三醇(Estriol, E3)以及人工合成雌激素如乙炔雌二醇(17 a-Ethynylestradiol, EE2),壬基酌'(^1-n-Nonylphenol, NP),辛基酌.(4-tert_0ctylphenol, 0P),戍酸雌二醇(17-beta-Estradiol 17-valerate, EV),己烯雌酌'(Diethylstibestrol, DES),己燒雌酌.(Hexestrol, HEX),雙酹A (Bisphenol A)等,種類豐富。人和動物的每天都會排出天然雌激素，據報道，成年男性每天排出雌酮5 μ g，而女性每天排出的17 β-雌二醇和雌酮分別為2-12 μ g和3-20 μ g。人工合成雌激素如乙炔雌二醇被用作避孕藥被大量使用，當被排入水體中也會對水體造成影響。研究表明，即使在極低的濃度，這些雌激素也會對水體中的魚類等生物產生性別干擾，如雄魚雌性化，并會引起人類的疾病。
[0003]近年來雌激素引起水體中魚類雌性化的現象越來越引起人們的關注，而采用現代的檢測技術來對水體的痕量雌激素的檢測顯得尤為重要。檢測雌激素的方法有很多，但能同時檢出的雌激素種類還較少 。主流檢測手段有氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)，特別是它們與質譜聯用液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)與氣相色譜(GC/MS)相比，無需衍生化，耗時少。建立重現性好，回收率和靈敏度高，多種雌激素同時檢出的檢測方法十分重要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明是針對自然水體中的雌激素的含量，擬開發(fā)一種回收率高，快速，準確地同時測量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A等十種雌激素的技術。
[0005]本發(fā)明的技術方案如下:
一種同時測量雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A十種雌激素法定方法，該方法的步驟如下步驟:
(I)水樣前處理
將采集的水樣用0.45 ym孔徑的濾膜過濾并將pH值調至3.0。量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對水樣進行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前進行活化，條件為，先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預處理。待富集結束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮氣流將其吹干。將樣品轉移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測；
(2)使用液相色譜串聯質譜儀檢測雌激素濃度
色譜柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒徑 2.6 μ m ;
流動相及梯度洗脫條件:流動相為0.5%的氨水(流動相A)和純甲醇(流動相B)，梯度洗脫條件為，流動相B的比例在前2min內保持在20%，2_8min內從20%升到60%，8_13min內從 60% 繼續(xù)增加到 90%, 13-16min 內維持在 90%, 16-16.1min 從 90% 降至 20%, 16.l_20min內維持在20%不變；
(3)標準曲線的繪制，以外標法繪制標準曲線；
(4)樣品含量的測定:
將采集的水樣按照1)的方法進行前處理，按照2)所述的條件進行雌激素的測定，并用3)中的方法計算雌激素的含量。
[0006]本發(fā)明所述的方法還包括采用Mill1-Q超純水，添加濃度為200 μ g/L，500 μ g/L的十種目標混合標樣，安裝(4)所述的含量測定方法，測定各雌激素的濃度。
[0007]本發(fā)明所述的雌激素為雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚Α。
[0008]本發(fā)明的有益效果是運用固相萃取技術所需的有機溶劑較少，減少對環(huán)境的污染，并且富集倍數高，所用的液相色譜串聯質譜儀靈敏度高，操作簡便，檢測限低，與氣相色譜相比更節(jié)約時間。本發(fā)明提供一種回收率高，重現性好，靈敏度高的共檢測方法，能同時測定較多種(十種)雌激素的含量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1 為 100 μ g/L 標樣的譜圖，出峰順序為 EE2:10.06min, NP:14.58min, OP:13.07min, EV:14.20min, HEX: 10.53min, E3:6.46min, DES:9.79min, BPA:8.44min，El:9.92min, E2:9.90mino
圖2為100 μ g/L的NP的標樣的譜圖，出峰時間為14.58min。
圖3為100 μ g/L的OP的標樣的譜圖，出峰時間為13.07min。
圖4為100 μ g/L的EV的標樣的譜圖，出峰時間為14.20min。
圖5為100 μ g/L的HEX的標樣的譜圖，出峰時間為10.53min。
圖6為100 μ g/L的E3的標樣的譜圖，出峰時間為6.46min。
圖7為100 μ g/L的DES的標樣的譜圖，出峰時間為9.79min。
圖8為100 μ g/L的BPA的標樣的譜圖，出峰時間為8.44min。
圖9為100 μ g/L的El的標樣的譜圖，出峰時間為9.92min。
圖10為100 μ g/L的E2的標樣的譜圖，出峰時間為9.90min。
【具體實施方式】
[0010]下面結合實例和附圖對本發(fā)明做進一步的描述:
(I)水樣前處理
將采集的水樣用0.45 ym孔徑的濾膜過濾并將pH值調至3.0。量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對水樣進行富集,速度控制在10ml/min。固相萃取小柱使用前進行活化，條件為先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預處理。待富集結束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質，然后抽真空干燥20 min以去除水分。干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮氣流將其吹干。將樣品轉移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測；
(2)使用液相色譜串聯質譜儀檢測雌激素濃度:
液相色譜串聯質譜儀的條件:液相為島津LC-20A，帶自動進樣器，日本島津公司，質譜儀為AB的3200QTRAP線性離子阱質譜儀，帶電噴霧離子源(ESI)，美國Applied Biosystem公司；
色譜柱:Thermo Accucore C18, 100X 2.1mm,粒徑2.6 μ m。離子源:電噴霧離子源(ESI)，檢測模式:負離子檢測模式，離子噴霧電壓:-4500V，溫度:450°C，離子源氣體I壓力為35psi,離子源氣體2壓力為40psi,氣簾氣體(N2)壓力為12psi,碰撞氣(N2)壓力:High。流動相采用純甲醇和0.5%氨水，梯度洗脫條件如表1 ;
通過液相色譜串聯質譜儀所測得的的雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚A的定量限分別為0.4 μ g/L, 8 μ g/L,8 μ g/L, 8 μ g/L, 2 μ g/L, 4 μ g/L, 8 μ g/L, 0.8 μ g/L, 0.8 μ g/L 和 8 μ g/L ；
表1流動相洗脫條件；
【權利要求】
1.一種水環(huán)境中同時測定十種雌激素的方法，包含以下十種:雌酮，17 β -雌二醇，雌三醇，乙炔雌二醇，壬基酚，辛基酚，戊酸雌二醇，己烷雌酚，己烯雌酚，雙酚Α。
2.該十種雌激素共檢測方法包含以下步驟: (1)水樣前處理 將采集的水樣用0.45 μ m孔徑的濾膜過濾并將pH調值至3.0，量取1.0 L的水樣，用Waters公司的C18 (6 mL, 200 mg)固相萃取小柱對水樣進行富集,速度控制在10ml/min,固相萃取小柱使用前進行活化，條件為先后用6 mL乙酸乙酯，6mL甲醇和6 mL pH=3的鹽酸水溶液預處理，待富集結束后，用6mL 10%(v/v)的甲醇水溶液洗柱去除其它雜質，然后抽真空干燥20 min以去除水分，干燥后，用6 mL的乙酸乙酯將目標化合物洗脫至氮吹管中，用溫和的氮氣流將其吹干，將樣品轉移至樣品瓶中并保存在4°C的冰箱中待測； (2)使用液相色譜串聯質譜儀檢測雌激素濃度:
色譜柱:Therm。Accucore C18, 100 X 2.1mm,粒徑 2.6 μ m ; 流動相及梯度洗脫條件:流動相為0.5%的氨水(流動相A)和純甲醇(流動相B)，梯度洗脫條件為，流動相B的比例在前2min內保持在20%，2_8min內從20%升到60%，8_13min內從 60% 繼續(xù)增加到 90%, 13-16min 內維持在 90%, 16-16.1min 從 90% 降至 20%, 16.l_20min內維持在20%不變 ； (3)標準曲線的繪制 以外標法繪制標準曲線； (4)樣品含量的測定 將采集的水樣按照I)的方法進行前處理，按照2)所述的條件進行雌激素的測定，并用3)中的方法計算雌激素的含量。
【文檔編號】G01N30/88GK103792314SQ201410031449
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權日:2014年1月23日
【發(fā)明者】羅專溪, 王大鵬, 張嫻, 顏昌宙, 林立峰 申請人:中國科學院城市環(huán)境研究所