一種快速鑒別鐵皮石斛的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速鑒別鐵皮石斛的方法，包括以下步驟：（1）通過(guò)觀察，確定待測(cè)樣品符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的鐵皮石斛的性狀特征；（2）將待測(cè)樣品制成厚度小于500μm的樣品切片；（3）取樣品切片置于物鏡下在藍(lán)色熒光下觀察其熒光顯微特征，若觀察到諸多大小相近的維管束，且鞘纖維細(xì)胞通常排列成雙帽狀，則該樣品屬于鐵皮石斛，否則該樣品不屬于鐵皮石斛。本發(fā)明引入熒光顯微鑒別用于鐵皮石斛的真?zhèn)舞b別中，具有簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)不需要有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者即可識(shí)別，能快速、高效地得到石斛品種的真?zhèn)涡畔?，為其科學(xué)準(zhǔn)確鑒別提供了一種有效的補(bǔ)充。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速鑒別鐵皮石斛的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及到一種快速鑒別中藥真?zhèn)蔚姆椒?，尤其是一種依據(jù)熒光顯微特征來(lái)鑒別鐵皮石斛的方法。
技術(shù)背景
[0002]鐵皮石斛為蘭科植物石斛屬鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥莖，是一味名貴的中藥，具有益胃生津，滋陰清熱之功效，被譽(yù)為“九大仙草”之一?，F(xiàn)代研究表明，鐵皮石斛含有多種化學(xué)成分，包括多糖、聯(lián)芐類(lèi)、菲類(lèi)、生物堿、黃酮、酚酸類(lèi)、氨基酸及鈣、鎂、鋅、鐵、錳、硒、銅、鉻、鎳等人體新陳代謝的必須微量元素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和有效減輕肝損傷等多種藥理活性。
[0003]由于鐵皮石斛具有多方面的藥理活性，現(xiàn)在已成為保健品市場(chǎng)的新寵，受到了消費(fèi)者的追捧。據(jù)報(bào)道，2011年僅浙江省鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值已超過(guò)20億元，預(yù)計(jì)到2015年，浙江省鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值將超過(guò)50億元。鐵皮石斛市場(chǎng)需求大、但資源稀缺，以致近年來(lái)價(jià)格不斷攀升。而石斛品種繁多，來(lái)源復(fù)雜，外形十分相似，尤其是加工成“楓斗”之后，不同品種的石斛很難辨認(rèn)。許多不法商家在利益的驅(qū)使下，把其它種的石斛加工成“楓斗”冒充鐵皮石斛，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益，影響用藥的安全性和有效性，造成“鐵皮楓斗”市場(chǎng)混亂，阻礙整個(gè)石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了正本清源，2010版藥典已把鐵皮石斛Dendrobium officinale單列出來(lái)作為該藥材的唯一來(lái)源。
[0004]近年來(lái)很多學(xué)者對(duì)鐵皮石斛的質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)行了研究，特別是鐵皮石斛的真?zhèn)舞b別研究。2010版中國(guó)藥典規(guī)定可用傳統(tǒng)顯微鑒別法或薄層鑒別法對(duì)鐵皮石斛的真?zhèn)芜M(jìn)行判斷[I]。Chen等將鐵皮石斛和其他品種石斛中糖類(lèi)及聯(lián)芐類(lèi)的化學(xué)成分進(jìn)行了比較，尋找了鐵皮石斛特征性成分，以此鑒別鐵皮石斛和其他品種石斛[2] ;Zhang等以分子生物學(xué)方法鑒別了鐵皮石斛和其他品種石斛[3]。色譜鑒定法準(zhǔn)確度高、能有效提供化學(xué)成分信息，可用于中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣的鑒別，但需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理及使用大量有機(jī)試劑，另外，化學(xué)成分對(duì)照品的難以獲得及大型精密儀器高昂的購(gòu)置成本等也限制了色譜鑒定的普及；而分子生物學(xué)技術(shù)鑒定法穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、所需樣品量少，但存在技術(shù)復(fù)雜、成本偏高、專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員缺乏等劣勢(shì)。傳統(tǒng)性狀顯微鑒別作為藥材基源鑒定的重要手段，具有簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，也被用于鐵皮石斛的真?zhèn)舞b別中。但仍有分辨率低、精密度差、使用范圍局限于有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者、只能提供中藥材微觀形態(tài)學(xué)特征，而不能提供中藥中化學(xué)成分信息等不足之處。綜合比較上述方法的利弊，建立一種快速、科學(xué)、實(shí)用的方法進(jìn)行鐵皮石斛的質(zhì)量控制研究，在當(dāng)今的市場(chǎng)形勢(shì)下顯得尤其重要。
[0005]熒光顯微技術(shù)作為一種新的中藥鑒別模式和手段，在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用正日趨成熟。熒光顯微鏡的原理是利用一個(gè)高發(fā)光效率的點(diǎn)光源，經(jīng)過(guò)濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長(zhǎng)的光(如紫外光365nm或紫藍(lán)光420nm)作為激發(fā)光,激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的突光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過(guò)物鏡和目鏡的放大進(jìn)行觀察。與普通光學(xué)顯微鏡相比，在熒光顯微鏡下觀察有強(qiáng)烈的對(duì)襯背景，即使熒光很微弱也易辨認(rèn)，敏感性高，主要用于化學(xué)成分以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等的研究。按Wiff發(fā)色基團(tuán)學(xué)說(shuō)，化合物分子吸收了一定波長(zhǎng)的光量子的能量后，發(fā)生極化并產(chǎn)生偶極矩，使價(jià)電子在不同能級(jí)間躍遷而形成不同的顏色?；衔锓肿咏Y(jié)構(gòu)中共軛鏈越長(zhǎng)，顏色越深；分子量增加，特別是共軛雙鍵數(shù)增加，顏色加深。因此，熒光顯微鏡既能提供顯微形態(tài)信息，且不需要有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者，同時(shí)又能從一定的角度反應(yīng)出其化學(xué)成分信息，并且簡(jiǎn)便、快速、高效、實(shí)用，可實(shí)現(xiàn)中藥的即時(shí)鑒別，有效控制中藥質(zhì)量，在中藥真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別中的應(yīng)用有廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種鑒別鐵皮石斛的方法，該方法有快速、低成本且不需要有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者的優(yōu)勢(shì)。
[0007]一種快速鑒別鐵皮石斛的方法，包括以下步驟:
[0008](I)通過(guò)觀察，確定待測(cè)樣品符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的鐵皮石斛(拉丁學(xué)名CAULISDENDR0B11 OFFICINALIS)的性狀特征；
[0009](2)將待測(cè)樣品制成厚度小于500 u m的樣品切片；
[0010](3)取樣品切片置于物鏡下在藍(lán)色熒光下觀察其顯微特征，若觀察到諸多大小相近的維管束，且鞘纖維細(xì)胞通常排列成雙帽狀，則該樣品屬于鐵皮石斛，否則該樣品不屬于鐵皮石斛。
[0011]進(jìn)一步，所述步驟(3)中，鐵皮石斛樣品切片的熒光顯微特征還包括:在藍(lán)色熒光下，觀察到角質(zhì)層、表皮細(xì)胞壁、木質(zhì)部細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光；綠色熒光下，觀察到角質(zhì)層、表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。
[0012]進(jìn)一步，所述步驟(3)中，鐵皮石斛樣品切片的顯微特征還包括:草酸鈣針晶存在于近表皮的薄壁細(xì)胞內(nèi)，成束或散在。
[0013]所述步驟(I)中，所述的觀察采用常規(guī)操作，具體如下:將樣品置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，觀察形狀、表面、粗細(xì)、斷面特征、質(zhì)地及氣味特征，必要時(shí)將干燥樣品用水浸泡適當(dāng)時(shí)間，將螺旋拉伸后以肉眼、放大鏡或解剖鏡進(jìn)行觀察，以獲得樣品的性狀特征，將觀察到的性狀特征與中國(guó)藥典記載的鐵皮石斛的性狀特征進(jìn)行比較，確定其是否屬于石斛，中國(guó)藥典鐵皮石斛的性狀特征標(biāo)準(zhǔn)為:呈螺旋形，通常2?6個(gè)旋紋，莖拉直后長(zhǎng)3.5?8cm，有節(jié)和節(jié)間之分，直徑0.2?0.4cm ;表面灰綠色、黃綠色或略帶金黃色，有多數(shù)縱皺紋，有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根；質(zhì)堅(jiān)實(shí)，易折斷，斷面平坦，灰白色至灰綠色，略角質(zhì)狀；氣微，味淡，嚼之有粘性。
[0014]所述步驟(2)中，樣品切片的制作方法具體如下:取干燥莖或新鮮莖，將樣品沖洗干凈，新鮮莖直接切成約2.0cm的小段，干燥莖置于燒杯中以蒸餾水浸泡后，切成約2.0cm的小段，制作徒手切片，具體操作方法如下:左手三只手指固定材料，右手持刀，刀口輕接材料，自左前方緩慢向右后方下滑，刀面不斷加水潤(rùn)滑。
[0015]所述步驟(3)中，熒光顯微鏡包括兩種濾光片:一種發(fā)藍(lán)色熒光，具體激發(fā)波長(zhǎng)為450-500nm，吸收濾鏡的波長(zhǎng)為510_560nm 種發(fā)綠色熒光，具體激發(fā)波長(zhǎng)為510_590nm，吸收濾鏡的波長(zhǎng)為590-680nm。觀察樣品切片的熒光顯微特征采用常規(guī)操作，具體操作方法如下:將樣品切片置于載物臺(tái)上；開(kāi)啟電源，調(diào)節(jié)光亮度；選擇目鏡和物鏡；調(diào)節(jié)焦距，觀察材料。一般情況下是先在低倍物鏡下觀察，然后再置于高倍物鏡下觀察。先在普通光下觀察樣品切片的顯微形態(tài)特征。待找到合適的清晰的視野，記錄，關(guān)閉普通光源，打開(kāi)熒光激發(fā)光源，待穩(wěn)定后，將顯微鏡的濾光片撥到“B”，觀察藍(lán)色熒光下樣品切片的顯微特征。觀察好并記錄后，將顯微鏡的濾光片撥到“G”，繼續(xù)觀察綠色熒光下樣品切片的顯微特征，記錄。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明引入熒光顯微鑒別用于鐵皮石斛的真?zhèn)舞b別中，具有簡(jiǎn)捷、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)不需要有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者即可識(shí)另O，能快速、高效地得到石斛品種的真?zhèn)涡畔ⅲ瑸槠淇茖W(xué)準(zhǔn)確鑒別提供了一種有效的補(bǔ)充。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1是普通光及熒光下鐵皮石斛橫切面的顯微特征；
[0018]圖2是普通光及熒光下紫皮石斛橫切面的顯微特征；
[0019]圖3是普通光及熒光下水草石斛橫切面的顯微特征；
[0020]圖4是普通光及熒光下光節(jié)石斛橫切面的顯微特征。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1:已確認(rèn)品種來(lái)源的鐵皮石斛的鑒別
[0023]1.儀器與試劑
[0024]意大利OPTIKA B-600TIFL 顯微鏡。
[0025]稀甘油(實(shí)驗(yàn)室自配，丙三醇，浙江杭州雙林化工試劑廠，分析純)，水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠，分析純)，娃哈哈純凈水。
[0026]2.材料
[0027]15批鐵皮石斛中，8批干品分別收集于浙江天臺(tái)鐵皮石斛基地、云南普洱鐵皮石斛基地、浙江樂(lè)清市雙峰鄉(xiāng)鐵皮石斛基地，7批鮮品分別收集于云南、浙江磐安、方回春堂、胡慶余堂；紫皮石斛、水草石斛、光節(jié)石斛各3批，分別收集于緬甸、浙江磐安。經(jīng)過(guò)浙江工業(yè)大學(xué)章華偉副教授、浙江省藥檢所郭增喜主任鑒定，為蘭科植物鐵皮石斛Dendrobiumofficinale的新鮮或干燥莖。
[0028]3.實(shí)驗(yàn)步驟
[0029](I)樣品的性狀特征觀察:將樣品置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，觀察形狀、表面、粗細(xì)、斷面特征、質(zhì)地及氣味特征。必要時(shí)將干燥樣品用水浸泡適當(dāng)時(shí)間，將螺旋拉伸后以肉眼、放大鏡或解剖鏡進(jìn)行觀察。記錄觀察結(jié)果。
[0030](2)制備樣品切片:取干燥莖或新鮮莖，先進(jìn)行上述性狀觀察后，再將樣品沖洗干凈，新鮮莖直接切成約2.0cm的小段，干燥莖置于燒杯中以蒸餾水浸泡后，切成約2.0cm的小段，制作徒手厚度在500 μ m內(nèi)的切片。具體操作方法如下:左手三只手指固定材料，右手持刀，刀口輕接材料，自左前方緩慢向右后方下滑，刀面不斷加水潤(rùn)滑。
[0031](3)顯微鏡觀察及記錄:具體操作方法如下:將切片置于載物臺(tái)上；開(kāi)啟電源，調(diào)節(jié)光亮度；選擇目鏡和物鏡；調(diào)節(jié)焦距，觀察材料。一般情況下是先在低倍物鏡下觀察，然后再置于高倍物鏡下觀察。先在普通光下觀察樣品切片的顯微形態(tài)特征。待找到合適的清晰的視野，記錄，關(guān)閉普通光源，打開(kāi)熒光激發(fā)光源，將顯微鏡的濾光片撥到“B”，觀察藍(lán)色熒光下樣品切片的熒光顯微特征。觀察好并記錄后，將顯微鏡的濾光片撥到“G”，繼續(xù)觀察綠色熒光下樣品切片的熒光顯微特征，記錄。
[0032](4)不同產(chǎn)地不同采收時(shí)間的鐵皮石斛樣品的顯微特征觀察:將不同產(chǎn)地不同采收時(shí)間的鐵皮石斛樣品經(jīng)步驟(I) (2)相同處理后，按步驟(3)觀察、記錄，并總結(jié)歸納鐵皮石斛的顯微特征及熒光特性區(qū)別。
[0033]4.結(jié)果與分析
[0034]鐵皮石斛的性狀特征:呈螺旋形或彈簧狀。通常為2?6個(gè)旋紋，莖拉直后長(zhǎng)
3.5?8cm，直徑0.2?0.4cm。表面黃綠色或略帶金黃色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，易折斷，斷面平坦，灰白色至灰綠色，略角質(zhì)狀。氣微，味淡，嚼之有黏性。
[0035]鐵皮石斛的顯微特征:
[0036](I)普通光下顯微特征:表皮細(xì)胞I列，扁平，直徑17-45 μ m，側(cè)壁微木化。表皮細(xì)胞上方可見(jiàn)一層黃色至橘紅色的角質(zhì)層。表皮組織外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)一層由薄壁細(xì)胞和維管束組成的葉鞘層。維管束有限外韌型，大小相近，78-134個(gè)，偶見(jiàn)50余個(gè)維管束的鐵皮石斛樣品，通常呈4-5輪排列。維管束外側(cè)有纖維群，通常呈雙帽狀排列，偶爾排列成單帽狀或環(huán)列。薄壁細(xì)胞大小相近，近維管束的薄壁細(xì)胞稍小。薄壁細(xì)胞部分網(wǎng)狀增厚，含有黃綠色小顆粒物。薄壁細(xì)胞中可見(jiàn)草酸鈣針晶束、硅質(zhì)塊或淀粉粒。草酸鈣針晶束分布于近表皮的薄壁細(xì)胞內(nèi)。硅質(zhì)塊分布于維管束外側(cè)的薄壁細(xì)胞內(nèi)。
[0037](2)熒光下顯微特征:藍(lán)色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光。維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光，在暗的視野下，雙帽狀的纖維細(xì)胞群特別容易觀察到。
[0038]綠色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。此外，維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁在某些樣品中可觀察到紅色熒光；而在某些樣品中則不發(fā)光，但這些不發(fā)光的樣品，其木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)纖維細(xì)胞群鄰近的薄壁細(xì)胞內(nèi)可觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。
[0039]總結(jié)鐵皮石斛顯微特征鑒別點(diǎn)在于:
[0040](I)維管束:大小相近，大致排成4?5圈，鞘纖維細(xì)胞通常排列成雙帽狀，此特征在藍(lán)色熒光下清晰醒目，無(wú)需有經(jīng)驗(yàn)的鑒別者即可識(shí)別。維管束個(gè)數(shù)多，一般在90以上，但極少數(shù)鐵皮石斛維管束個(gè)數(shù)僅為60左右(圖1)。
[0041](2)薄壁細(xì)胞大小較均勻，部分網(wǎng)狀增厚，含有黃綠色小顆粒物，此特征在綠色熒光下清晰可辨，鐵皮石斛薄壁細(xì)胞內(nèi)含顆粒物有強(qiáng)烈紅色熒光。(圖1)
[0042](3)草酸鈣針晶存在于近表皮的薄壁細(xì)胞內(nèi)，成束或散在。(圖1)
[0043]5.鐵皮石斛品種的確證
[0044]將以上經(jīng)專(zhuān)家鑒定的鐵皮石斛樣品按2010年中國(guó)藥典鑒別項(xiàng)下顯微鑒別和薄層鑒別進(jìn)行真?zhèn)舞b別。
[0045]鑒別標(biāo)準(zhǔn)及具體方法如下:(I)采用普通顯微鏡對(duì)鐵皮石斛的橫切面進(jìn)行鑒別，可觀察到:表皮細(xì)胞I列，扁平，外壁及側(cè)壁稍增厚、微木化，外被黃色角質(zhì)層，有的外層可見(jiàn)無(wú)色的薄壁細(xì)胞組成的葉鞘層。基本薄壁組織細(xì)胞多角形，大小相似，其間散在多數(shù)維管束，略排成4?5圈，維管束外韌型，外圍排列有厚壁的纖維束，有的外側(cè)小型薄壁細(xì)胞中含有硅質(zhì)塊。含草酸鈣針晶束的黏液細(xì)胞多見(jiàn)于近表皮處。[0046](2)取樣品粉末lg，加甲醇50ml，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5ml使溶解，用石油醚(60?90°C)洗滌2次，每次20ml，棄去石油醚液，水液用乙酸乙酯洗滌2次，每次20ml，棄去洗液，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液。另取鐵皮石斛對(duì)照藥材lg，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2010版附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2?5 μ 1，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，使成條狀，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水(15:15:5:85)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，烘干，噴以三氯化鋁試液，在105°C烘約3分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。
[0047]結(jié)果表明，以上15批鐵皮石斛樣品經(jīng)藥典法的顯微鑒別，均符合藥典中描述的特征。按藥典法的薄層鑒別制備各樣品的供試品溶液，與從中檢所購(gòu)得的鐵皮石斛對(duì)照藥材相比，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。表明以上樣品均為鐵皮石斛 D.0fficinale.[0048]實(shí)施例2:未知鐵皮石斛的鑒別
[0049]1、儀器與試劑
[0050]同實(shí)施例1。
[0051]2、材料
[0052]石斛3批，分別購(gòu)買(mǎi)于胡慶余堂、壽仙谷及華東大藥房。
[0053]3、實(shí)驗(yàn)步驟
[0054]同實(shí)施例1。
[0055]4、結(jié)果與分析
[0056](I)性狀鑒別結(jié)果:呈螺旋形或彈簧狀。2?6個(gè)旋紋，莖拉直后長(zhǎng)3.5?8cm，直徑0.2?0.4cm。表面黃綠色或略帶金黃色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，易折斷，斷面平坦，灰白色至灰綠色，略角質(zhì)狀。氣微，味淡，嚼之有黏性。
[0057](2)顯微鑒別結(jié)果:
[0058]①普通光下顯微特征:表皮細(xì)胞I列，扁平，直徑17-45 μ m，側(cè)壁微木化。表皮細(xì)胞上方可見(jiàn)一層黃色至橘紅色的角質(zhì)層。表皮組織外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)一層由薄壁細(xì)胞和維管束組成的葉鞘層。維管束有限外韌型，大小相近，78-134個(gè)，偶見(jiàn)50余個(gè)維管束的鐵皮石斛樣品，通常呈4-5輪排列。維管束外側(cè)有纖維群，通常呈雙帽狀排列，偶爾排列成單帽狀或環(huán)列。薄壁細(xì)胞大小相近，近維管束的薄壁細(xì)胞稍小。薄壁細(xì)胞部分網(wǎng)狀增厚，含有黃綠色小顆粒物。薄壁細(xì)胞中可見(jiàn)草酸鈣針晶束、硅質(zhì)塊或淀粉粒。草酸鈣針晶束分布于近表皮的薄壁細(xì)胞內(nèi)。硅質(zhì)塊分布于維管束外側(cè)的薄壁細(xì)胞內(nèi)。
[0059]②熒光下顯微特征:藍(lán)色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光。維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光，在暗的視野下，雙帽狀的纖維細(xì)胞群特別容易觀察到。
[0060]綠色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。此外，維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁在某些樣品中可觀察到紅色熒光；而在某些樣品中則不發(fā)光，但這些不發(fā)光的樣品，其木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)纖維細(xì)胞群鄰近的薄壁細(xì)胞內(nèi)可觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。[0061]依據(jù)本發(fā)明的結(jié)果判斷分析，鑒定其為鐵皮石斛D.0fficinale的干燥莖。
[0062]5、鑒定結(jié)果的再驗(yàn)證
[0063]將以上三批樣品按中國(guó)藥典2010版中鐵皮石斛項(xiàng)下的鑒別法進(jìn)行真?zhèn)舞b別，表明其確實(shí)為鐵皮石斛品種。
[0064]實(shí)施例3:市場(chǎng)易混淆品紫皮石斛的鑒別
[0065]1、儀器與試劑
[0066]同實(shí)施例1。
[0067]2、材料[0068]紫皮石斛3批，分別收集于緬甸、浙江磐安。經(jīng)過(guò)浙江工業(yè)大學(xué)章華偉副教授、浙江省藥檢所郭增喜主任鑒定，為蘭科植物鐵皮石斛D.devonianum的新鮮及干燥莖。
[0069]3、實(shí)驗(yàn)步驟
[0070]同實(shí)施例1.[0071]4、結(jié)果與分析
[0072](I)性狀鑒別結(jié)果:
[0073]呈螺旋形或彈簧狀。2~7個(gè)旋紋，直徑0.2~0.7cm。表面暗綠黃色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。不易折斷，斷面纖維性。氣微，味淡，嚼之有黏性。
[0074](2)顯微鑒別結(jié)果:
[0075]①普通光下顯微特征:表皮細(xì)胞I列，扁平，直徑17-85 μ m，側(cè)壁微木化。表皮細(xì)胞上方可見(jiàn)一層黃色至橘紅色的角質(zhì)層。表皮組織外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)一層由薄壁細(xì)胞和維管束組成的葉鞘層。維管束有限外韌型，大小懸殊，57-91個(gè)。維管束外側(cè)有纖維群，通常呈單帽狀排列，偶爾排列成雙帽狀。薄壁細(xì)胞大小懸殊，近維管束的薄壁細(xì)胞稍小。薄壁細(xì)胞部分網(wǎng)狀增厚，含有黃綠色小顆粒物。薄壁細(xì)胞中可見(jiàn)草酸鈣針晶束、硅質(zhì)塊或淀粉粒。草酸鈣針晶束分布于近表皮及近維管束的薄壁細(xì)胞內(nèi)。硅質(zhì)塊分布于維管束外側(cè)的薄壁細(xì)胞內(nèi)。
[0076]②熒光下顯微特征:藍(lán)色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光。維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光，在暗的視野下，可觀察到單帽狀的纖維細(xì)胞群。
[0077]綠色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。此外，維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁在某些樣品中可觀察到紅色熒光；而在某些樣品中則不發(fā)光，但這些不發(fā)光的樣品，其木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)纖維細(xì)胞群鄰近的薄壁細(xì)胞內(nèi)可觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。
[0078]紫皮石斛的性狀特征與鐵皮石斛極為相似。進(jìn)一步觀察其顯微特征可發(fā)現(xiàn)維管束無(wú)雙帽狀排列，僅為單帽狀，維管束個(gè)數(shù)少，一般不超過(guò)95個(gè)(圖2)。草酸鈣針晶位于近表皮和近維管束處，以上三批樣品非鐵皮石斛品種。
[0079]5、鑒定結(jié)果的再驗(yàn)證
[0080]將以上三批樣品按中國(guó)藥典2010版中鐵皮石斛項(xiàng)下的鑒別法進(jìn)行真?zhèn)舞b別，顯微鑒別中，維管束無(wú)明顯的4-5圈排列，且草酸鈣針晶分布位置與鐵皮石斛品種不相符。薄層鑒別項(xiàng)下，供試品溶液與對(duì)照品溶液在同一色譜上有不完全相應(yīng)的斑點(diǎn)，故上述樣品非鐵皮石斛，因而驗(yàn)證了本發(fā)明的結(jié)論。[0081]實(shí)施例4易混淆品水草石斛的鑒別
[0082]1、儀器與試劑
[0083]同實(shí)施例1.[0084]2、材料
[0085]水草石斛3批，分別收集于緬甸、浙江磐安。經(jīng)過(guò)浙江工業(yè)大學(xué)章華偉副教授、浙江省藥檢所郭增喜主任鑒定，為蘭科植物鐵皮石斛D.aphyllum的新鮮或干燥莖。
[0086]3、實(shí)驗(yàn)步驟
[0087]同實(shí)施例1.[0088]4、結(jié)果與分析
[0089](I)性狀鑒別結(jié)果:
[0090]呈螺旋形或彈簧狀。2~5個(gè)旋紋，直徑0.2~1.1cm0表面暗黃綠色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。不易折斷，斷面纖維性。氣微，味微苦，嚼之無(wú)黏性。
[0091](2)顯微鑒別結(jié)果:
[0092]①普通光下顯微特征:表皮細(xì)胞I列，扁平，直徑13-38 μ m，側(cè)壁微木化。表皮細(xì)胞上方可見(jiàn)一層黃色至橘紅色的角質(zhì)層。表皮組織外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)一層由薄壁細(xì)胞和維管束組成的葉鞘層。維管束有限外韌型，大小相近，53-85個(gè)。維管束外側(cè)有纖維群，呈單帽狀排列。薄壁細(xì)胞大小相近，近維管束的薄壁細(xì)胞稍小。薄壁細(xì)胞部分網(wǎng)狀增厚，含有黃綠色小顆粒物。薄壁細(xì)胞中可見(jiàn)草酸鈣針晶束、硅質(zhì)塊或淀粉粒。草酸鈣針晶散在或成束，分布于整個(gè)橫切面內(nèi)。硅質(zhì)塊分布于維管束外側(cè)的薄壁細(xì)胞內(nèi)。
[0093]②熒光下顯微特征:藍(lán)色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光。維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光，在暗的視野下，可觀察到單帽狀的纖維細(xì)胞群。
[0094]綠色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。此外，維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁在某些樣品中可觀察到紅色熒光；而在某些樣品中則不發(fā)光，但這些不發(fā)光的樣品，其木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)纖維細(xì)胞群鄰近的薄壁細(xì)胞內(nèi)可觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。
[0095]水草石斛的性狀特征與鐵皮石斛極為相似，但該石斛嚼之略有苦味，無(wú)黏性。同時(shí)進(jìn)一步觀察顯微特征可發(fā)現(xiàn)到維管束無(wú)雙帽狀排列，僅為單帽狀，維管束個(gè)數(shù)少，一般不超過(guò)85個(gè)。草酸鈣針晶分布散在(圖3)。表明以上三批樣品非鐵皮石斛品種。
[0096]5、鑒定結(jié)果的再驗(yàn)證
[0097]將以上三批樣品按中國(guó)藥典2010版中鐵皮石斛項(xiàng)下的鑒別法進(jìn)行真?zhèn)舞b別，顯微鑒別中，維管束無(wú)明顯的4-5圈排列，且草酸鈣針晶分布位置與鐵皮石斛品種不相符。薄層鑒別項(xiàng)下，供試品溶液與對(duì)照品溶液在同一色譜上有不完全相應(yīng)的斑點(diǎn)，故上述樣品非鐵皮石斛，因而驗(yàn)證了本發(fā)明的結(jié)論。
[0098]實(shí)施例5易混淆品光節(jié)石斛的鑒別
[0099]1、儀器與試劑
[0100]同實(shí)施例1.[0101]2、材料[0102]光節(jié)石斛3批，分別收集于緬甸、浙江磐安。經(jīng)過(guò)浙江工業(yè)大學(xué)章華偉副教授、浙江省藥檢所郭增喜主任鑒定，為蘭科植物鐵皮石斛D.aphyllum的新鮮或干燥莖。
[0103]3、實(shí)驗(yàn)步驟
[0104]同實(shí)施例1.[0105]4、結(jié)果與分析
[0106](I)性狀鑒別結(jié)果:[0107]呈螺旋形或彈簧狀。2~5個(gè)旋紋，直徑0.2~0.8cm。表面暗綠黃色，有細(xì)縱皺紋，節(jié)明顯，節(jié)上有時(shí)可見(jiàn)殘留的灰白色葉鞘；一端可見(jiàn)莖基部留下的短須根。不易折斷，斷面纖維性。氣微，味微苦，嚼之無(wú)黏性。
[0108](2)顯微鑒別結(jié)果:
[0109]①普通光下顯微特征:表皮細(xì)胞I列，扁平，直徑11-35 μ m，側(cè)壁微木化。表皮細(xì)胞上方可見(jiàn)一層黃色至橘紅色的角質(zhì)層。表皮組織外側(cè)有時(shí)可見(jiàn)一層由薄壁細(xì)胞和維管束組成的葉鞘層。維管束有限外韌型，大小懸殊，57-84個(gè)，偶見(jiàn)120余個(gè)維管束的樣品。維管束外側(cè)有纖維群，呈單帽狀排列。薄壁細(xì)胞大小懸殊，近維管束的薄壁細(xì)胞稍小。薄壁細(xì)胞部分纖維狀增厚，含有黃綠色小顆粒物。薄壁細(xì)胞中可見(jiàn)草酸鈣針晶束、硅質(zhì)塊或淀粉粒。草酸鈣針晶束分布于近維管束的薄壁細(xì)胞內(nèi)。硅質(zhì)塊分布于維管束外側(cè)的薄壁細(xì)胞內(nèi)。
[0110]②熒光下顯微特征:藍(lán)色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光。維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光，在暗的視野下，可觀察到單帽狀的纖維細(xì)胞群。
[0111]綠色熒光下，角質(zhì)層及表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。此外，維管束的木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)的纖維細(xì)胞群，其細(xì)胞壁在某些樣品中可觀察到紅色熒光；而在某些樣品中則不發(fā)光，但這些不發(fā)光的樣品，其木質(zhì)部導(dǎo)管及維管束外側(cè)纖維細(xì)胞群鄰近的薄壁細(xì)胞內(nèi)可觀察到強(qiáng)烈的紅色熒光。
[0112]光節(jié)石斛的性狀特征與鐵皮石斛極為相似，但該石斛嚼之略有苦味，無(wú)黏性。同時(shí)進(jìn)一步觀察顯微特征可發(fā)現(xiàn)其維管束無(wú)雙帽狀排列，僅為單帽狀，維管束個(gè)數(shù)少，一般不超過(guò)85個(gè)，偶見(jiàn)120多個(gè)。草酸鈣針晶分布于近維管束處。表明以上三批樣品非鐵皮石斛品種。(圖4)
[0113]5、鑒定結(jié)果的再驗(yàn)證
[0114]將以上三批樣品按中國(guó)藥典2010版中鐵皮石斛項(xiàng)下的鑒別法進(jìn)行真?zhèn)舞b別，顯微鑒別中，維管束無(wú)明顯的4-5圈排列，且草酸鈣針晶分布位置與鐵皮石斛品種不相符。薄層鑒別項(xiàng)下，供試品溶液與對(duì)照品溶液在同一色譜上有不完全相應(yīng)的斑點(diǎn)，故上述樣品非鐵皮石斛，因而驗(yàn)證了本發(fā)明的結(jié)論。
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒別鐵皮石斛的方法，包括以下步驟: (1)通過(guò)觀察，確定待測(cè)樣品符合《中國(guó)藥典》規(guī)定的鐵皮石斛的性狀特征； (2)將待測(cè)樣品制成厚度小于500μ m的樣品切片； (3)取樣品切片置于物鏡下在藍(lán)色熒光下觀察其熒光顯微特征，若觀察到諸多大小相近的維管束，且鞘纖維細(xì)胞通常排列成雙帽狀，則該樣品屬于鐵皮石斛，否則該樣品不屬于鐵皮石斛。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，鐵皮石斛樣品切片的熒光顯微特征還包括:在藍(lán)色熒光下，觀察到角質(zhì)層、表皮細(xì)胞壁、木質(zhì)部細(xì)胞壁發(fā)綠色熒光；綠色熒光下，觀察到角質(zhì)層、表皮細(xì)胞壁發(fā)紅色熒光。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，鐵皮石斛樣品切片的顯微特征還包括:草酸鈣針晶存在于近表皮的薄壁細(xì)胞內(nèi)，成束或散在。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103837511SQ201410037603
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】楚楚, 尹慧敏, 顏繼忠, 程冬萍, 李行諾, 童勝?gòu)?qiáng) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)