形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法。所述基于生物樣品的質(zhì)譜來形成所述生物樣品的構(gòu)成物中的目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法包括：確定所述質(zhì)譜所屬于的區(qū)域，其中，所述區(qū)域選自于由細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域構(gòu)成的組；對于在之前的區(qū)域確定中確定的每個區(qū)域，根據(jù)從所述構(gòu)成物的質(zhì)譜中的所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度和從所述構(gòu)成物中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度，計算從所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度；以及基于從所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度，形成所述目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像，其中，針對所述區(qū)域中的每一個來選擇所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料。
【專利說明】形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法
[0001]本申請是申請日為2010年3月30日、國際申請?zhí)枮镻CT/JP2010/056120、國家申請?zhí)枮?01080015616.6、發(fā)明名稱為“形成質(zhì)量圖像的方法”的專利申請的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及使用質(zhì)譜分析法(mass spectrometry)來獲取關(guān)于分析物中的構(gòu)成物(constituent)的質(zhì)量的信息作為圖像的方法，特別是涉及通過信號強(qiáng)度的歸一化(normalize)來形成包含于組織切片(tissue section)中的諸如蛋白質(zhì)和肽(peptide)的生物物質(zhì)的二維分布狀態(tài)的圖像的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]已知有這樣的分析方法(美國專利N。.7446309 ):該分析方法使用飛行時間(time-of-flight) 二次離子質(zhì)譜分析儀(T0F-SMS)、基于信號強(qiáng)度將在腫瘤組織中表現(xiàn)(express)的蛋白質(zhì)的表現(xiàn)量全面地(comprehensively)可視化。
[0004]此外，使用標(biāo)準(zhǔn)材料的質(zhì)譜分析的信號強(qiáng)度的歸一化是已知的。在蛋白質(zhì)分析中，通過二維電泳(electrophoresis)來分離蛋白質(zhì)并且通過質(zhì)譜分析來分析所分離的蛋白質(zhì)。然后，使用具有已知含量的蛋白質(zhì)的強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)，將所關(guān)心的蛋白質(zhì)的強(qiáng)度歸一化以獲得定量(quantitative)的結(jié)果。
[0005]可通過使用諸如TOF-SMS和基質(zhì)輔助激光脫附離子化質(zhì)譜分析(matrix-assisted laser desorption-1onization mass spectrometry, MALD1-MS)而基于目標(biāo)蛋白質(zhì)的信號強(qiáng)度形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的二維分布圖像。在這種情況下，已知有這樣的方法:該方法使用一次離子的總劑量、脈沖激光的照射量、或者得到的二次離子的總計數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)而將信號強(qiáng)度歸一化。
[0006]還提出了使用外部標(biāo)準(zhǔn)材料的歸一化。這里，外部標(biāo)準(zhǔn)材料指的是不包含于測量樣本中但被添加到樣本中的、用于將通過質(zhì)譜分析而獲得的質(zhì)量信號強(qiáng)度歸一化的標(biāo)準(zhǔn)材料。在日本專利申請公開N0.2004-037120中示出了在TOF-SMS中使用外部標(biāo)準(zhǔn)材料。在該公布中，用作外部標(biāo)準(zhǔn)的材料被布置在樣本的測量范圍之外。然后，通過外部標(biāo)準(zhǔn)的信號強(qiáng)度將樣本中的所關(guān)心的蛋白質(zhì)的信號強(qiáng)度歸一化。通過該方法，可以在相同條件下獲得樣本和外部標(biāo)準(zhǔn)的信號強(qiáng)度。
[0007]在MALD1-MS中使用外部標(biāo)準(zhǔn)材料也是已知的。例如，一定量的特定的肽與基質(zhì)劑混合并且基質(zhì)被均勻地噴涂于樣本表面上以便使用所述肽作為外部標(biāo)準(zhǔn)以獲得組織切片的構(gòu)成物的質(zhì)譜的二維分布圖像是已知的。
[0008]還提出了使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的歸一化。這里，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料指的是事先包含于測量樣本中的用于將通過質(zhì)譜分析獲得的質(zhì)量信號強(qiáng)度歸一化的標(biāo)準(zhǔn)材料。例如，在 S.G.0strowski et al., Anal.Chem.79, 3554 (2007)中，使用從細(xì)胞的脂質(zhì)(lipid)成分獲得的碎片離子(fragmention)的信號強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞膜表面中的膽固醇(cholesterol)的信號強(qiáng)度歸一化，以通過T0F-SIMS形成二維分布圖像。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]在日本專利申請公開N0.2004-037120中，由于外部標(biāo)準(zhǔn)材料被布置在離開目標(biāo)構(gòu)成物的位置中，因此難以校正由局部地存在于測量范圍中的諸如鹽和脂質(zhì)的離子化抑制物質(zhì)導(dǎo)致的局部靈敏度(sensitivity)變化。
[0010]在S.G.0strowski et al.，Anal.Chem.79，3554 (2007)中，培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)受二維分布測量，并且，使用細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子的碎片離子(C5H9+)的信號作為圖像中的每個像素中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。但是，用于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的脂質(zhì)分子根據(jù)細(xì)胞膜的形狀具有偏倚的(biased)二維分布。例如，在組織切片的細(xì)胞外部或核中，很少存在脂質(zhì)分子。因此，歸一化信號被計算為比與實際豐度(abundance)對應(yīng)的信號高的值。出于這種原因，當(dāng)形成二維分布圖像時，難以形成適當(dāng)?shù)胤从硿y量對象的豐度的圖像。
[0011]作為用于解決上述問題的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人實現(xiàn)了本發(fā)明。
[0012]本發(fā)明涉及一種基于關(guān)于組織切片的構(gòu)成物的質(zhì)量的信息而形成組織切片的構(gòu)成物中的目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法，該方法包括:將構(gòu)成物所屬于的區(qū)域確定為細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域中的至少一個；對于在先前的區(qū)域確定中確定的每個區(qū)域，根據(jù)從構(gòu)成物的質(zhì)譜中的目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度和從構(gòu)成物中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度，計算從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度；以及基于從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度而形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像，其中，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料，(i)在細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中使用肌動蛋白(actin)、微管蛋白(tubulin)和GAPDH中的任一種；(ii)在核區(qū)域中使用組蛋白(histone)和核酸中的一種，以及(iii)在細(xì)胞外部區(qū)域中使用白蛋白(albumin)和細(xì)胞因子(cytokine)中的一種。
[0013]根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)基于關(guān)于分析物中的構(gòu)成物的質(zhì)量的信息的二維分布圖像被獲取時，可以獲得在對于各像素已校正了質(zhì)譜的情況下的諸如靈敏度差異的變化的信號強(qiáng)度。另外，由于通過像素所屬于的區(qū)域選擇內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，所以，更合適的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)被選擇。因此，歸一化的信號強(qiáng)度的分布與構(gòu)成物的實際分布相匹配。
[0014]參照附圖閱讀示例性實施例的以下描述，本發(fā)明的其它特征將變得清晰。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1示出分析物的光學(xué)顯微鏡圖像和測量范圍中的像素坐標(biāo)XY的示意圖。
[0016]圖2示出用于規(guī)定“像素所屬于的區(qū)域”的校正后的脂質(zhì)碎片二次離子信號分布(128X128 個像素)。
[0017]圖3 (a)、圖3 (b)和圖3 (C)分別示出分配給被規(guī)定為“像素所屬于的區(qū)域”的(a)細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、(b)核區(qū)域和(C)細(xì)胞外部區(qū)域的各內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度的二維信號分布(128 X 128個像素)。
[0018]圖4示出通過測量而獲得的并且不經(jīng)受歸一化處理的蛋白質(zhì)C的二次離子信號強(qiáng)度的分布(128 X 128個像素)。
[0019]圖5示出規(guī)定了“像素所屬于的區(qū)域”并且通過向各像素分配內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而執(zhí)行了歸一化處理的蛋白質(zhì)C的信號強(qiáng)度的二維分布(128X128個像素)。
[0020]圖6A和圖6B分別示出沒有規(guī)定“像素所屬于的區(qū)域”并且通過向測量范圍中的所有像素施加相同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而執(zhí)行了歸一化的蛋白質(zhì)C的信號強(qiáng)度的二維分布(128X128個像素)。通過分別使用(6-肌動蛋白(圖6A)和脂質(zhì)成分(圖6B)作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而將信號強(qiáng)度歸一化。
[0021]圖7 (a)、圖7 (b)和圖7 (C)分別示出分配給被規(guī)定為“像素所屬于的區(qū)域”的(a)細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、(b)核區(qū)域和(C)細(xì)胞外部區(qū)域的各內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度的二維分布(64 X 64個像素)。
[0022]圖8示出通過測量獲得的并且不經(jīng)受歸一化處理的蛋白質(zhì)C的二次離子信號強(qiáng)度的分布(64 X 64個像素)。
[0023]圖9示出半自動地規(guī)定了 “像素所屬于的區(qū)域”并且通過向各像素分配內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而執(zhí)行了歸一化的蛋白質(zhì)C的信號強(qiáng)度的二維分布(64X64個像素)。
[0024]圖1OA和圖1OB示出沒有規(guī)定“像素所屬于的區(qū)域”并且通過向所有像素施加相同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而執(zhí)行了歸一化的蛋白質(zhì)C的信號強(qiáng)度的二維分布(64X64個像素)。通過分別對于圖1OA使用(6-肌動蛋白并且對于圖1OB使用脂質(zhì)成分作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料，將信號強(qiáng)度歸一化。
【具體實施方式】
[0025]本發(fā)明涉及一種基于關(guān)于組織切片的構(gòu)成物的質(zhì)量的信息而形成組織切片的構(gòu)成物中的目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法，該方法包括以下步驟:將構(gòu)成物所屬于的區(qū)域確定為細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、 核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域中的至少一個；對于在前一步驟中確定的每個區(qū)域，根據(jù)從構(gòu)成物的質(zhì)譜中的目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度和從構(gòu)成物中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度，計算從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度；以及基于從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度而形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像，其中，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料，(i)在細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中使用肌動蛋白、微管蛋白和GAPDH中的任一種；(ii)在核區(qū)域中使用組蛋白和核酸中的一種，以及(iii)在細(xì)胞外部區(qū)域中使用白蛋白和細(xì)胞因子中的一種。
[0026]本發(fā)明的方法是使用質(zhì)譜分析法來獲取關(guān)于分析物中的構(gòu)成物的質(zhì)量的信息并且基于獲取的關(guān)于質(zhì)量的信息而形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法。可通過以下步驟來執(zhí)行該方法:
[0027]( I)確定分析物的測量范圍的步驟；
[0028](2)將測量范圍劃分為像素的步驟；
[0029](3)通過質(zhì)譜分析法獲得像素的質(zhì)譜的步驟；
[0030](4)確定像素所屬于的區(qū)域的步驟；
[0031](5)確定像素的質(zhì)譜分析的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的步驟；
[0032](6)根據(jù)從像素的質(zhì)譜中的目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的信號強(qiáng)度和從內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量的信號強(qiáng)度而計算從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度的步驟；以及
[0033](7)在從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度的測量范圍中構(gòu)建二維分布圖像的步驟；
[0034]以下，將詳細(xì)描述各步驟。
[0035]( I)確定分析物的測量范圍的步驟[0036]通過觀察分析物來確定測量范圍。用于觀察的單元不被特別限制，而是可以使用附接于質(zhì)譜分析儀上的顯微鏡、和光學(xué)顯微鏡等。當(dāng)目標(biāo)是施加了熒光著色處理的組織切片時，可以使用熒光顯微鏡。
[0037]當(dāng)使用附接于質(zhì)譜分析儀上的顯微鏡時，先以低倍率觀察樣品，并且，在觀察期間，上面放置了樣品的臺架被移位以便粗略地確定要觀察的測量范圍。然后，可按高倍率觀察樣品以細(xì)微地調(diào)整，使得目標(biāo)細(xì)胞可包含于測量范圍內(nèi)。
[0038]注意，在本發(fā)明中，分析物是組織切片，并且測量范圍一般在細(xì)胞水平?！凹?xì)胞水平”意味著可至少識別單個細(xì)胞的水平。細(xì)胞的直徑一般在10 y m?20 y m的范圍內(nèi)，而諸如神經(jīng)細(xì)胞的大細(xì)胞具有約50 ii m的直徑。因此，對于本步驟中的觀察來說，空間分辨率需要為10 ii m或更小,優(yōu)選地為5 ii m或更小,更優(yōu)選地為2 ii m或更小,再更優(yōu)選地為I U m或更小。
[0039](2)將測量范圍劃分為像素的步驟
[0040]每個像素的一個邊的長度需要為10 ii m或更小，優(yōu)選地為5 ii m或更小，更優(yōu)選地為2 ii m或更小,再更優(yōu)選地為I U m或更小。
[0041]當(dāng)在附接于質(zhì)譜分析儀上的顯微鏡下觀察分析物時，可通過在軟件上選擇要測量的像素的數(shù)量來執(zhí)行成為像素的分割。像素的數(shù)量可選自例如由64X64U28X128、256X256和512X512個像素構(gòu)成的組。
[0042]注意，可在整個步驟中參照多個二維數(shù)據(jù)，并且，為了匹配像素的各數(shù)據(jù)，可以在各二維數(shù)據(jù)中設(shè)定二維坐標(biāo)。
[0043](3)通過質(zhì)譜分析法獲得像素的質(zhì)譜的步驟
[0044]使用質(zhì)譜分析儀，分析物的測量范圍經(jīng)過綜合二維質(zhì)譜分析以獲得與像素對應(yīng)的質(zhì)譜。當(dāng)使用附接于質(zhì)譜分析儀上的顯微鏡和軟件來執(zhí)行步驟(I)和(2)時，可以在本步驟中自動地獲得各像素的質(zhì)譜。另一方面，當(dāng)不使用附接于質(zhì)譜分析儀上的顯微鏡和軟件執(zhí)行步驟(I)和(2)時，或者當(dāng)需要時，各像素的各二維數(shù)據(jù)需要相互對應(yīng)。針對每個像素獲得的質(zhì)譜的數(shù)量可以為一個或更多個。當(dāng)獲得多個質(zhì)譜時，可以使用它們中的任一個，或者可以將多個譜平均化。
[0045]可事先確定或者可在每次確定用于質(zhì)譜分析的測量條件。質(zhì)譜分析的一次探測器的照射區(qū)域優(yōu)選地比在步驟(2)中確定的各像素的面積小。優(yōu)選地，還可以獲得足夠細(xì)微到這樣的程度的質(zhì)譜的二維分布圖像:該二維分布圖像允許區(qū)分各像素的區(qū)域是否屬于例如細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、細(xì)胞外部區(qū)域和核區(qū)域之一。出于這種目的，可手動或自動地控制一次探測器的孔徑(aperture)和透鏡系統(tǒng)電壓。
[0046]注意，在本步驟中使用的質(zhì)譜分析儀不被特別限制。以下，將詳細(xì)描述質(zhì)譜分析儀。
[0047]用于執(zhí)行質(zhì)譜分析的質(zhì)譜分析儀一般具有用于將樣品離子化的樣品引入部分和用于分析離子化了樣品的分析部分。質(zhì)譜分析儀可根據(jù)分析部分的系統(tǒng)被歸類入各種分析方法。
[0048]這里，樣品引入部分中的離子化的方法包含以下方法:
[0049](i)使用一次離子的方法；
[0050](ii)FAB (快速原子轟擊，F(xiàn)ast Atom Bombardment)方法；和[0051](iii) MALDI (基質(zhì)輔助激光脫附離子化，Matrix Assisted LaserAdsorption1nization)方法。
[0052]這里，F(xiàn)AB方法指的是將樣品與基質(zhì)混合并且允許中性原子以高速與得到的混合物碰撞以將樣品離子化的方法。
[0053]MALDI方法指的是將樣品與基質(zhì)混合以產(chǎn)生被激光照射以將樣品離子化的晶體的方法。
[0054]分析部分的系統(tǒng)包含以下方法:
[0055](i)四極(quadrupole)類型；
[0056](ii)磁偏轉(zhuǎn)類型；
[0057](iii)傅立葉變換離子回旋加速器(cyclotron)共振類型；
[0058](iv)離子講(trap)類型；
[0059](v)飛行時間二次離子質(zhì)譜分析(TOF-SMS)類型；和
[0060](vi)級聯(lián)(tandem)類型。
[0061]這里，(i)四極類型指的離子穿過四個電極并且向這些電極施加高頻電壓以由此使得樣品中的擾動(perturbation)僅經(jīng)過目標(biāo)離子的分析方法；
[0062](ii)磁偏轉(zhuǎn)類型指的是使離子通過磁場并且利用通過向磁場中的離子施加的洛倫茲(Lorentz)力而導(dǎo)致的離子的飛行路徑的變化的分析方法；
[0063](iii)傅立葉變換離子回旋加速器共振類型指的是這樣的分析方法，其中，離子被引入到已被施加了靜電場和靜磁場的細(xì)胞，并且施加用于激發(fā)離子運(yùn)動的高頻電壓以檢測離子的軌道周期，并且根據(jù)回旋加速器狀況來計算質(zhì)量；
[0064](iv)離子阱類型指的是離子被保持在由電極構(gòu)成的阱室內(nèi)并且其電勢被改變以由此有選擇地釋放離子以使這些離子分開的分析方法；
[0065](Vi)級聯(lián)類型指的是將以上分析方法中的兩種或更多種組合起來的方法；
[0066]可優(yōu)選地使用第(V)種方法，S卩，對于離子化使用一次離子的飛行時間二次離子質(zhì)譜分析(T0F-SIMS方法)。TOF-SIMS方法是能夠在質(zhì)譜分析中以非常高的精確度(accuracy)測量非常少量的樣品的方法。另外，由于通過使用一次離子的對于樣品表面的脈沖狀的照射而將樣品離子化，因此，可以減少對于樣品的損害，并且，可以正確地獲得關(guān)于目標(biāo)成分的分布信息。
[0067]在TOF-SMS方法中，通過用一次離子照射樣品而執(zhí)行樣品的離子化。從離子化效率和質(zhì)量分辨率(resolution)等的觀點看，作為一次離子種類，不僅可以使用諸如鎵離子(Ga+)的一般液體金屬離子，而且可以使用諸如三價金離子(Au3+)和三價鉍離子(Bi3+)的簇離子(cluster ion)。注意，優(yōu)選地使用Bi離子，原因是可以用非常高的靈敏度執(zhí)行分析。
[0068]在TOF-SMS方法中，通過一次離子的入射而從成分的正面(faceside)產(chǎn)生二次離子。在通過TOF-SMS方法進(jìn)行的分析中，在成分和飛行時間二次離子質(zhì)譜分析儀之間施加幾kV的電場，并且，通過電場將二次離子取入檢測器中以便進(jìn)行分析。
[0069]在使用TOF-SIMS的成像中，諸如質(zhì)量分辨率、分析區(qū)域和諸如一次離子脈沖頻率、一次離子束能量和一次離子脈沖寬度的測量條件的條件與成像能力緊密相關(guān)。出于這種原因，不唯一地決定優(yōu)選的分析條件。但是，從可以分析的觀點看，測量條件的各設(shè)定值需要處于一定范圍內(nèi)。在本發(fā)明中，一次離子束脈沖頻率優(yōu)選地處于IkHz?50kHz的范圍中。一次離子束能量優(yōu)選地處于12keV?25keV的范圍中，并且，一次離子束脈沖寬度優(yōu)選地處于0.5ns?IOns的范圍中?？赏ㄟ^在10 y m2?500 y m2的測量范圍中的64?512像素平方的像素表面上重復(fù)掃描一次離子束16?512次而獲得各像素中的離子質(zhì)量信號強(qiáng)度?？梢愿鶕?jù)各坐標(biāo)取出和布置這里獲得的比質(zhì)量數(shù)(specific mass number)的各像素中的信號強(qiáng)度以獲得圖像。
[0070]類似地，當(dāng)使用MALDI來成像時，不唯一地決定優(yōu)選的分析條件，但各值處于一定范圍內(nèi)。在本發(fā)明中，脈沖激光頻率優(yōu)選地處于IHz?200Hz的范圍中。脈沖激光能量優(yōu)選地處于10?300mW的范圍中，并且，脈沖激光脈沖寬度優(yōu)選地處于0.5ns?IOns的范圍中。在MALDI的情況下，通過以Ium為單位移動樣品臺架以掃描脈沖激光的照射位置，獲得各像素的質(zhì)量信號。可通過在IOiim2?500 ii m2的范圍中的10?500個像素平方的像素表面上掃描樣品臺架一次，獲得各像素中的離子質(zhì)量信號強(qiáng)度?？梢愿鶕?jù)各坐標(biāo)取出和布置這里獲得的比質(zhì)量數(shù)的各像素中的信號強(qiáng)度以獲得圖像。
[0071]在TOF-SMS和MALDI兩者中，當(dāng)目標(biāo)構(gòu)成物是蛋白質(zhì)或脂質(zhì)時，優(yōu)選地檢測正離子，相反，當(dāng)目標(biāo)構(gòu)成物是諸如DNA和RNA的低聚物(oligomer)或糖鏈(sugar chain)的碎片時，優(yōu)選地檢測負(fù)離子，但是，不特別限于這些條件。可以在相同的測量范圍中執(zhí)行正離子和負(fù)離子的測量，以獲得關(guān)于許多構(gòu)成物的信息。此外，為了有利于質(zhì)譜分析，特別當(dāng)目標(biāo)構(gòu)成物是蛋白質(zhì)時，分析物樣品可經(jīng)受諸如事先添加消化酶或敏化材料的預(yù)處理。但是，這需要極其仔細(xì)，使得目標(biāo)構(gòu)成物的分布可以被維持并且不可擴(kuò)展。
[0072](4)確定像素所屬于的區(qū)域的步驟
[0073]在本發(fā)明中，分析物主要是組織切片，并且，像素所屬于的區(qū)域可例如選自細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域。注意，細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域指的是被細(xì)胞膜包圍的部分，并且可以包含細(xì)胞膜或者可以不包含細(xì)胞膜。此外，細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域可以包含或者可以不包含核。此夕卜，可將諸如微粒體(microsome)、Golgi體、內(nèi)涵體(endosome)、溶酶體(Iysosome)、線粒體(mitochondrion)和過氧物酶體(peroxisome)的細(xì)胞器官(cell organelle),或者骨組織，以及脂肪組織規(guī)定為區(qū)域。
[0074]可以從基于步驟(I)中的觀察的形狀來確定像素所屬于的區(qū)域，或者，可在其中添加以下的步驟。即，通過使用更高精度的光學(xué)顯微鏡而獲得測量范圍中的分析物樣品的數(shù)字圖像并且根據(jù)該數(shù)字圖像的對比度差值來區(qū)分分析物中的細(xì)胞的斷面輪廓，規(guī)定各像素所屬于的區(qū)域。在光學(xué)顯微鏡的觀察中，通常使用反射型顯微鏡，但是，當(dāng)向分析物樣品施加了 著色或熒光著色時，也可使用熒光顯微鏡。
[0075]作為替代方案，可基于在步驟(3)中獲得的質(zhì)譜的二維分布來確定像素所屬于的區(qū)域。在這種情況下，基于來自步驟(3)中的質(zhì)譜分析的結(jié)果而得到的比質(zhì)量的信號強(qiáng)度的二維分布來確定該區(qū)域。希望比質(zhì)量是與可表示細(xì)胞或細(xì)胞膜的斷面輪廓的分布的脂質(zhì)成分的碎片離子和已知主要存在于細(xì)胞質(zhì)(cytoplasmic)區(qū)域(以下，稱為細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域)的核的位置中的蛋白質(zhì)、肽、DNA和RNA等的碎片離子對應(yīng)的質(zhì)量。更具體而言，希望比質(zhì)量是與細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中的肌動蛋白、微管蛋白和GAPDH，核區(qū)域中的組蛋白和核酸，以及細(xì)胞外部區(qū)域中的白蛋白和細(xì)胞因子的碎片離子對應(yīng)的質(zhì)量?？梢曰谶@種信號強(qiáng)度的二維分布圖像來確定特定的像素屬于哪種類型的區(qū)域。
[0076]為了去除對于由鹽雜質(zhì)所施予的對于離子檢測靈敏度的影響，可通過對于以上各圖像的各像素將各圖像乘以Na的信號強(qiáng)度來校正信號強(qiáng)度。
[0077]在任何情況下，當(dāng)兩個或更多個區(qū)域成分在像素所屬于的區(qū)域中的一個像素中重疊時，還可以計算包含于像素中的各區(qū)域成分的面積比，并且在下一步驟中在應(yīng)用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)時使用加權(quán)形式的面積比。
[0078](5)確定像素的質(zhì)譜分析的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的步驟
[0079]可通過像素所屬于的區(qū)域的屬性確定像素的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。注意，希望選擇內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料使得它滿足以下兩個條件:
[0080](i)所述材料穩(wěn)定地存在于斷面(cross-sectional)細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、細(xì)胞中的斷面核區(qū)域、或者細(xì)胞外部區(qū)域中的每一個中；和
[0081](ii)豐度處于范圍為10?IO3件/ii m3的水平。
[0082]特別地，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料，優(yōu)選地應(yīng)用蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、脂質(zhì)、磷酸、糖鏈和核酸。更具體而言，當(dāng)區(qū)域?qū)儆诩?xì)胞內(nèi)部區(qū)域時，優(yōu)選地被應(yīng)用的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料包含肌動蛋白、微管蛋白和GAPDH ;當(dāng)區(qū)域?qū)儆诤藭r，優(yōu)選地被應(yīng)用的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料包含組蛋白和核酸；并且，當(dāng)區(qū)域?qū)儆诩?xì)胞外部區(qū)域時，優(yōu)選地被應(yīng)用的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料包含諸如白蛋白和細(xì)胞因子的蛋白質(zhì)分子。
[0083](6)根據(jù)從像素的質(zhì)譜中的目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的信號強(qiáng)度和從內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量的信號強(qiáng)度而計算從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度的步驟
[0084]通過基于在步驟(5)中確定的分配給各像素的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料而向在步驟(3)中獲得的質(zhì)譜應(yīng)用“目標(biāo)構(gòu)成物的信號強(qiáng)度和所分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度”，對于各像素歸一化和計算目標(biāo)構(gòu)成物的信號強(qiáng)度。此時，所分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度不需要是內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料自身的分子的強(qiáng)度，而可以是可規(guī)定內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號。例如，如果蛋白質(zhì)經(jīng)受作為步驟(2)中的預(yù)處理的消化(digestion)處理，那么可以使用通過消化蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的碎片分子的檢測信號作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號。
[0085]例如，可以使用比值(目標(biāo)構(gòu)成物的信號強(qiáng)度)/ (所分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度)作為歸一化信號強(qiáng)度。
[0086]此外，例如，可通過將比值(目標(biāo)構(gòu)成物的信號強(qiáng)度)/ (所分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度)乘以諸如所分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料等的權(quán)重的適當(dāng)?shù)某?shù)而對于歸一化信號強(qiáng)度的值進(jìn)行進(jìn)一步的計算。
[0087]如上所述，當(dāng)多個內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料被分配給一個像素時，也可通過根據(jù)像素中的各占據(jù)面積比的加權(quán)來校正信號強(qiáng)度。
[0088]此外，當(dāng)存在多個要經(jīng)受歸一化處理的目標(biāo)構(gòu)成物時，可對于多個目標(biāo)構(gòu)成物同時執(zhí)行本步驟。
[0089](7)在從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化信號強(qiáng)度的測量范圍中構(gòu)建二維分布圖像的步驟
[0090]為了重構(gòu)圖像，基于測量范圍中的各像素的位置而形成在步驟(4)中獲得的各像素的歸一化信號強(qiáng)度作為二維分布圖像。
[0091]此外，可以有多個如上面所述的那樣用于重構(gòu)圖像的目標(biāo)構(gòu)成物。
[0092]例子
[0093]以下，將參例子更具體地描述本發(fā)明。以下的具體例子是本發(fā)明的最佳實施例的例子，但是，本發(fā)明不限于這樣的【具體實施方式】。
[0094]例子I
[0095]以下，示出了使用組織切片作為分析物并且通過TOF-SMS方法獲取圖像的例子。
[0096]依次用丙酮、乙醇和去離子水沖洗不包含雜質(zhì)的硅(Si )基板，在該硅(Si )基板上沉積IOOnm的金(Au)以形成分析基板。
[0097]在本例子中，使用患病的組織切片作為分析物?；疾〉慕M織被嵌入OCT化合物中，被冷凍，并然后被切片機(jī)(microtome)切成約m的厚度以獲得切片。得到的切片被布置在切片機(jī)中的事先被安裝和冷卻的基板上，使得分析物表面面朝上。通過用毛刷(woolbrush)按壓切片的邊緣以使其粘附從而將切片固定于基板上。在樣品被冷凍干燥之后，在樣品的表面上滴落具有適當(dāng)?shù)臐舛鹊腎Oii L的胰蛋白酶(trypsin)溶液。在37°C在使?jié)穸缺３趾愣ǖ臓顟B(tài)下使樣品消化一整夜，以使得樣品構(gòu)成物的蛋白質(zhì)成分破碎。
[0098]如上面描述的那樣的被固定于基板上并已經(jīng)受消化處理的組織切片被引入TOF-SMS儀器。在附接于儀器的顯微鏡下觀察切片，并且，基于顯微鏡圖像的對比度差異來選擇測量范圍。同時，在附接于TOF-SMS儀器的軟件上確定構(gòu)成測量范圍的像素的數(shù)量。此時的樣品臺架位置被記錄為XY坐標(biāo)。另外，作為數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，存儲在組織切片上疊加了測量范圍的外框線的光學(xué)顯微鏡圖像。圖像中的測量范圍的位置被記錄為XY坐標(biāo)。圖1表示示出了此時的光學(xué)顯微鏡圖像和測量范圍中的像素坐標(biāo)XY的獲取的情況的示意圖。在圖1中，附圖標(biāo)記I表示組織切片，附圖標(biāo)記2表示細(xì)胞，附圖標(biāo)記3表示核，附圖標(biāo)記4表示測量范圍(由128X128個測量像素構(gòu)成)，附圖標(biāo)記5表示測量像素。在本例子中，使用由ION-TOF制造的TOF-SMS型號5儀器(商標(biāo)名稱)和由ION-TOF制造的10NSPEC (商標(biāo)名稱)和10NIMAGE (商標(biāo)名稱)作為附接于其上的軟件，在下述條件下執(zhí)行TOF-SMS分析和分析工作。注意，為了獲得更清楚的測量范圍，可以在TOF-SMS測量之后在獲得光學(xué)顯微鏡圖像之前將組織切片樣品中的細(xì)胞核和膜部分染色。
[0099]一次離子:25kV Bi3+，0.3pA (脈沖電流值)，鋸齒掃描模式
[0100]一次離子的脈沖頻率:2.5kHz (400ii s/發(fā)(shot))
[0101]一次離子的脈沖寬度:約0.8ns
[0102]一次離子束的直徑:約0.8 ii m
[0103]測量范圍:26umX26um
[0104]要測量的二次離子的像素的數(shù)量:128 X 128
[0105]積分(integration)時間:128次掃描(約 500 秒)
[0106]二次離子的檢測模式:正離子
[0107]對于各像素，根據(jù)所獲得的質(zhì)譜的二維分布的和關(guān)于“像素所屬于的區(qū)域”的信息確定內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料。此時，需要連續(xù)地執(zhí)行樣品的測量和后面要描述的分析處理，但是，關(guān)于事先測量的質(zhì)譜的二維分布的信息可被存儲為電子數(shù)據(jù)。此時，如果測量中區(qū)分“像素所屬于的區(qū)域”所需的信息也被單獨地存儲并且可被任選地參照，那么也可以例如在與TOF-SIMS儀器不同的計算機(jī)上稍后僅執(zhí)行分析處理操作。將在隨后的例子2中描述細(xì)節(jié)。在本例子中，為了區(qū)分“像素所屬于的區(qū)域”，使用這樣的信號分布作為質(zhì)譜二維分布:該信號分布已通過將從細(xì)胞膜檢測的脂質(zhì)碎片離子(磷酸膽堿(Phosphocholine):m/z 184)的信號強(qiáng)度乘以各像素中的納離子(Na+:m/z23)的信號強(qiáng)度和適當(dāng)?shù)某?shù)而被歸一化，以便去除鹽的影響。如圖2所示，與各像素坐標(biāo)XY (0~127、0~127)對應(yīng)的位置使用通過脂質(zhì)碎片的信號強(qiáng)度分布繪制的除細(xì)胞輪廓和細(xì)胞核以外的細(xì)胞膜部分作為主要標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)定
(a)細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域(附圖標(biāo)記6)、(b)核區(qū)域(附圖標(biāo)記7)以及(c)細(xì)胞外部區(qū)域(附圖標(biāo)記8)中的一個。為了在區(qū)域之間清楚地區(qū)分，在圖2中用白色封閉線示出規(guī)定的區(qū)域的邊界。注意，在本例子中，沒有設(shè)定包含多個區(qū)域的像素。在規(guī)定像素所屬于的區(qū)域時，可以從如上面描述的那樣獲得的圖1所示的光學(xué)顯微鏡照片規(guī)定各像素坐標(biāo)XY所屬于的(a)~(c)的各區(qū)域。
[0108]然后，適當(dāng)?shù)膬?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料被分配給各像素坐標(biāo)XY中的“像素所屬于的區(qū)域”Ca)~(C)中的每一個。在本例子中，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料分別分配以下的碎片離子:區(qū)域Ca)中的蛋白質(zhì)(6-肌動蛋白(氨基酸序列LDLAGR+H:m/z644)的碎片離子；區(qū)域(b)中的蛋白質(zhì)組蛋白(LLGR+H:m/z457)的碎片離子；和區(qū)域(c)中的蛋白質(zhì)血白蛋白(FPK+Na:m/z413)的碎片離子。對于圖3中的各區(qū)域呈現(xiàn)出分配給區(qū)域(a)~(c)中的每一個的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的信號強(qiáng)度的二維分布。這里使用的上述蛋白質(zhì)中的每一個的碎片離子是具體地從TOF-SMS方法中的各母蛋白質(zhì)檢測的材料。因此，可以間接地表現(xiàn)作為原內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的分布和量，并且它適用為用于歸一化的檢測信號。但是，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料及其碎片離子不一定限于以上描述的那些，而是可以取決于測量方法以及樣品和目標(biāo)構(gòu)成物的狀態(tài)來使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料及其碎片離子。
[0109]在本例子中，使用主要具體地在患病細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中發(fā)展的蛋白質(zhì)細(xì)胞角蛋白(cytokeratin) 19 (以下,稱為蛋白質(zhì)C)作為目標(biāo),并且,對于分析使用具體地從蛋白質(zhì)C檢測的碎片離子(IRDWYQK+H:m/zl008)的信號強(qiáng)度。圖4示出沒有經(jīng)受歸一化處理的碎片離子信號強(qiáng)度的分布。
[0110]下面，基于如上面描述的那樣被歸一化的蛋白質(zhì)C碎片離子的強(qiáng)度值構(gòu)成測量圖像。圖5示出結(jié)果。在圖5中，由于信號強(qiáng)度被歸一化，因此，對于各像素的測量的變化被校正。此外，在圖5中，如果碎片離子種類之間的檢測效率差異被忽略，那么也可根據(jù)用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的材料的豐度和歸一化的離子強(qiáng)度值來估計蛋白質(zhì)C的大致豐度。在本例子的情況下，通過從這樣的事實來估計值，斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域的平面中的蛋白質(zhì)C的豐度可被估計為約30~I X IO2件/ y m2:用作斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域(a)中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)@ -肌動蛋白的豐度被視為每個細(xì)胞約IO5~IO6件。此外，關(guān)于圖5中的歸一化的信號強(qiáng)度的每個計數(shù)的量，斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域的平面中的蛋白質(zhì)C的豐度將為4~100件/計數(shù)。
[0111]比較例
[0112]出于比較的目的，圖6A和圖6B分別示出對于整個測量范圍中的所有像素使用相同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料(上述的蛋白質(zhì)P -肌動蛋白碎片離子和脂質(zhì)碎片離子之一)通過歸一化而重構(gòu)測量圖像的情況下的結(jié)果。在歸一化中，當(dāng)因內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的信號強(qiáng)度為零的事實而出現(xiàn)劃分誤差時，通過向內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的信號適當(dāng)?shù)丶尤胄〉闹?例如，I)而進(jìn)行校正。
[0113]當(dāng)使用蛋白質(zhì)(6-肌動蛋白的碎片離子作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)時，獲得圖6A的圖像。由于對于整個測量范圍的像素使用了相同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的碎片離子信號強(qiáng)度，因此，對于例如很少存在蛋白質(zhì)(6-肌動蛋白的細(xì)胞外部區(qū)域和核區(qū)域中的實際豐度，蛋白質(zhì)C碎片離子的信號強(qiáng)度是比該信號強(qiáng)度高的值。在圖5中，在幾乎所有的像素中，細(xì)胞外部歸一化信號強(qiáng)度不為0~10。另一方面,在圖6A中，通過像素,細(xì)胞外部歸一化信號強(qiáng)度在0~10和90?100之間大大改變。圖6A缺少與實際蛋白質(zhì)C的豐度的相關(guān)性，原因是蛋白質(zhì)C原本僅在細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中。
[0114]當(dāng)使用脂質(zhì)碎片離子作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)時，將獲得圖6B。然后，在很少存在脂質(zhì)的細(xì)胞外部區(qū)域和核區(qū)域中，呈現(xiàn)出缺少與實際豐度的相關(guān)性的歸一化信號強(qiáng)度。
[0115]由于圖5使用適于每個區(qū)域的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)而被歸一化，因此，區(qū)域之間的對比度被調(diào)整以創(chuàng)建比圖6A和圖6B清楚的圖像。
[0116]表I示出在上述的例子I和比較例中沒有經(jīng)受歸一化處理的蛋白質(zhì)C的信號分布(圖4)和通過歸一化處理方法獲得的蛋白質(zhì)C的信號分布(圖5、圖6A和圖6B)中的斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、細(xì)胞中的斷面核區(qū)域、以及細(xì)胞外部區(qū)域中的每一個中的信號強(qiáng)度(計數(shù)或任意單位)及其分布百分比。表I示出了，在以上的例子中的通過歸一化過程獲得的蛋白質(zhì)C的信號分布(圖5)中，以所有信號的97%或更大的高百分比從斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域檢測蛋白質(zhì)C的信號。這示出了適于主要存在于細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中的蛋白質(zhì)C的原本的分布的存在分布。另一方面，在比較例中的沒有經(jīng)受歸一化處理的信號分布(圖4)和通過歸一化處理方法獲得的信號分布(圖6A和圖6B)中，斷面細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中的檢測率不那么高，并且，即使在斷面核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域中也檢測到信號。這些分布沒有正確地示出蛋白質(zhì)C的原本的分布。以上的結(jié)果還示出通過本例子的過程執(zhí)行適當(dāng)?shù)男盘枤w一化。因此，通過在沒有規(guī)定“像素所屬于的區(qū)域”的情況下使用向分析物的測量范圍中的所有像素施加內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料的常規(guī)的歸一化過程，在細(xì)胞水平上將蛋白質(zhì)可視化是非常困難的，并且，也難以獲得穩(wěn)定的定量結(jié)果。
[0117]如上所述，例子I和比較例驗證了可通過借助于根據(jù)“像素所屬于的區(qū)域”施加內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料并且執(zhí)行圖像重構(gòu)而使TOF-SMS測量結(jié)果經(jīng)受目標(biāo)構(gòu)成物的歸一化來更定量地獲得關(guān)于存在于患病組織切片中的特定蛋白質(zhì)的二維分布狀態(tài)的信息。
[0118]例子2
[0119]以下，示出保持從確定的測量范圍獲得的分析物中的構(gòu)成物的質(zhì)量的信息作為電子數(shù)據(jù)并且對于所述電子數(shù)據(jù)使用計算機(jī)軟件以半自動地形成目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法。
[0120]用于處理的數(shù)據(jù)是存儲通過測量在例子I中獲得的胰蛋白酶消化組織切片獲得的質(zhì)譜二維分布的電子數(shù)據(jù)。處理的過程如下。
[0121](步驟I)規(guī)定測量范圍中的像素的數(shù)量。該質(zhì)譜的二維分布數(shù)據(jù)由XY方向上的128X128個測量像素構(gòu)成。出于減少處理時間的目的，通過將XY方向上的2X2個測量像素重新定義為一個像素，將測量范圍劃分成64X64個像素。并且，向XY坐標(biāo)中的每個像素新賦予0?63的編號。
[0122](步驟2)從各像素提取質(zhì)譜，并且，每個譜與XY坐標(biāo)一起作為單個數(shù)據(jù)被保存在存儲器區(qū)域中。
[0123](步驟3)根據(jù)所獲得的質(zhì)譜確定各像素所屬于的區(qū)域。(I)作為用于區(qū)分區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定在例子I中使用的以下離子峰值(ionpeak)中的每一個:(a)的蛋白質(zhì)P -肌動蛋白(氨基酸序列LDLAGR+H:m/z644)的碎片離子、(b)的蛋白質(zhì)組蛋白(LLGR+H:m/z457)的碎片離子、以及(c)的蛋白質(zhì)血清白蛋白(FPK+Na:m/z413)的碎片離子。(2)計算各像素的質(zhì)譜中的(a)、(b)和(C)中的每一個的信號強(qiáng)度。通過分別將離子峰值(a)、(b)和(C)指定為N = 1、2和3并且使用各像素的坐標(biāo)XY作為指數(shù)，在陣列P (X、Y、Z)中存儲信號強(qiáng)度的值。(3)確定所有測量像素中的離子峰值(a)、(b)和(c)中的每一個的各平均強(qiáng)度值，并且，得到的值被存儲在陣列Q (N)中。(4)在所有的像素中，N從I依次變?yōu)?，并且，檢索P (X、Y、N)>Q (N)的情況。各像素所屬于的區(qū)域是以下中的任何一個:當(dāng)N = I時的細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域，即(a);當(dāng)N = 2時的核區(qū)域，即(b);以及當(dāng)N = 3時的細(xì)胞外部區(qū)域，即(C)。當(dāng)所檢索的結(jié)果與以上情況中的任一個都不對應(yīng)時，由于像素沒有它所屬于的區(qū)域，因此隨后的步驟4~6中的處理被省略。出于參照目的，圖7示出64X64個像素中的(a)、
(b)和(c)中的每一個的離子峰值強(qiáng)度(歸一化值)。
[0124](步驟4)根據(jù)各像素所屬于的每個區(qū)域，對于已確定屬于哪個區(qū)域的像素確定要施加到歸一化計算的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料。在本例子中，上述的用于區(qū)分區(qū)域的(a)的蛋白質(zhì)^ -肌動蛋白及其碎片離子(氨基酸序列LDLAGR+H:m/z644 )、( b )的蛋白質(zhì)組蛋白及其碎片離子(LLGR+H:m/z457)、以及(c)的蛋白質(zhì)血清白蛋白及其碎片離子(FPK+Na:m/z413)作為從這些材料導(dǎo)出的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料和碎片離子分別被分配給像素所屬于的細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域
(a)、核區(qū)域(b)和細(xì)胞外部區(qū)域(C)。
[0125](步驟5)使用從各像素中的質(zhì)譜的目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的信號強(qiáng)度和從在步驟4中分配的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的碎片離子的強(qiáng)度，計算歸一化的信號強(qiáng)度。在由像素的XY坐標(biāo)表示的陣列存儲區(qū)域R (X，Y)中存儲所得到的歸一化值。在本例子中，與例子I類似，使用蛋白質(zhì)C作為目標(biāo)構(gòu)成 物，并且，對于歸一化的目標(biāo)使用其碎片離子(IRDWYQK+H:m/zl008)的信號強(qiáng)度。圖8示出歸一化之前的蛋白質(zhì)C碎片離子的信號強(qiáng)度的分布。
[0126](步驟6)使用從目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度的歸一化值，構(gòu)建測量范圍中的二維分布圖像。在圖9中構(gòu)建所構(gòu)建的歸一化質(zhì)量信號的二維分布圖像。
[0127]出于比較目的，示出了對于整個測量范圍中的所有像素通過使用相同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料執(zhí)行歸一化的情況的結(jié)果。使用上述的(6-肌動蛋白碎片離子(LDLAGR+H:m/z644)和脂質(zhì)碎片離子(磷酸膽堿:m/zl84)中的一種作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料。分別在圖1OA和圖1OB中示出了結(jié)果。在歸一化中，當(dāng)由于內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的信號強(qiáng)度為零的事實而出現(xiàn)劃分誤差時，事先跳過計算并且將0 (零)值輸入到陣列存儲區(qū)域(X，Y)中。顯然，與通過其它方法進(jìn)行歸一化的信號分布(圖1OA和圖10B)相比，通過以上的處理，使用適于各區(qū)域的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)而歸一化的信號分布(圖9)正確地表現(xiàn)了存在于細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域中的蛋白質(zhì)C的原本的分布。
[0128]表1
[0129]通過各種歸一化處理方法的各區(qū)域的蛋白質(zhì)C的信號分布比較
[0130]
【權(quán)利要求】
1.一種基于生物樣品的質(zhì)譜來形成所述生物樣品的構(gòu)成物中的目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像的方法，所述方法包括: 確定所述質(zhì)譜所屬于的區(qū)域，其中，所述區(qū)域選自于由細(xì)胞內(nèi)部區(qū)域、核區(qū)域和細(xì)胞外部區(qū)域構(gòu)成的組； 對于在之前的區(qū)域確定中確定的每個區(qū)域，根據(jù)從所述構(gòu)成物的質(zhì)譜中的所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度和從所述構(gòu)成物中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料導(dǎo)出的質(zhì)量信號強(qiáng)度，計算從所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度；以及 基于從所述目標(biāo)構(gòu)成物導(dǎo)出的質(zhì)量的歸一化強(qiáng)度，形成所述目標(biāo)構(gòu)成物的二維分布圖像， 其中，針對所述區(qū)域中的每一個來選擇所述內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，通過TOF-SMS方法測量所述構(gòu)成物的質(zhì)譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，關(guān)于所述構(gòu)成物的質(zhì)量的信息與像素對應(yīng)，并且每個像素的一個邊的長度為5 ii m或更小。
【文檔編號】G01N27/62GK103760220SQ201410046838
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2010年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2009年4月10日
【發(fā)明者】小松學(xué), 橋本浩行 申請人:佳能株式會社