一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其制備和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及1,5-脫水山梨醇檢測領(lǐng)域，具體涉及一種1,5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其制備和檢測方法，其特征在于，包括：抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體、用于檢測抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體-1,5-脫水山梨醇復(fù)合物的指示試劑；所述抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體由1,5-脫水山梨醇免疫原免疫動物得到。本發(fā)明的有益之處在于：1,5-脫水山梨醇免疫原的免疫原性高，制備出的抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體特異性強、效價高；含有上述抗1,5-脫水山梨醇特異性抗體的均相酶免疫檢測試劑可以方便、快速、準(zhǔn)確地確定樣品中的1,5-脫水山梨醇含量，并且可以在全自動生化分析儀上同時測定多個樣品，實現(xiàn)1,5-脫水山梨醇的高通量快速化測定，準(zhǔn)確度高，特異性強。
【專利說明】一種1 ’ 5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其制備和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及1，5-脫水山梨醇檢測領(lǐng)域，具體涉及一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑及其制備和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]1,5-脫水山梨醇(I, 5-anhydro glue i to I, I，5-AG),結(jié)構(gòu)式如式(III)所示:
[0003]
【權(quán)利要求】
1.一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，包括:抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體、用于檢測抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體-1，5-脫水山梨醇復(fù)合物的指示試劑；所述抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體由1，5-脫水山梨醇免疫原免疫動物得到，所述1，5-脫水山梨醇免疫原的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述的R為-(CH2)4-COO-;所述的載體為血清蛋白、血藍(lán)蛋白或甲狀腺球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述指示試劑選自酶試劑，包括:酶標(biāo)偶聯(lián)物和酶的底物；所述酶標(biāo)偶聯(lián)物包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物；所述酶的底物為葡萄糖-6-磷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標(biāo)偶聯(lián)物由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與1，5-脫水山梨醇衍生物偶聯(lián)形成，所述1，5-脫水山梨醇衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(II)所示:
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的1，5_脫水山梨醇免疫檢測試劑，其特征在于，R為-(CH2)4-COO'
6.一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)權(quán)利要求4所述的1，5-脫水山梨醇衍生物的合成與純化，并進行結(jié)構(gòu)鑒定； (2)1，5-脫水山梨醇免疫原的合成:使1，5-脫水山梨醇衍生物的-(CH2)n-COO-基團與具有免疫原性的蛋白質(zhì)載體連接，η為I至20之間的整數(shù)； (3)用1，5-脫水山梨醇免疫原免疫動物，制備并純化抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體； (4)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物的制備:制備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液，激活1，5-脫水山梨醇衍生物，使G6TOH與1，5-脫水山梨醇衍生物連接，純化連接產(chǎn)物； (5)I, 5-脫水山梨醇均相酶免疫檢測試劑的制備: 試劑A的制備:由抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體和均相酶底物混合而成； 試劑B的制備:由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)中，蛋白質(zhì)載體為BSA, η=4,具體合成步驟如下: 1)將20mgBSA溶解于5ml0.2M，pH8.5的磷酸緩沖液PBS中，上述溶液置于燒杯A中； 2)將如下化學(xué)品加入到燒杯B中攪拌溶解:20mgl，5-脫水山梨醇衍生物，0.35ml 二甲基酰胺，0.35ml乙醇，0.7mll0mM pH5.0的磷酸鉀緩沖液，40mgl_乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺，5mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺，于室溫下攪拌溶解，反應(yīng)30分鐘； 3)將燒杯B中的溶液滴加至燒杯A中，得到混合溶液，在2~8°C下攪拌過夜；將上述攪拌后的混合溶液經(jīng)過中性磷 酸鹽緩沖液透析純化，得到BSA-1，5-脫水山梨醇免疫原，儲存于-20°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，所述的步驟(4)具體過程為: O葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)溶液的制備: a.稱取15mg 規(guī)格為 100KU 的 G6PDH,室溫溶解于 12mL 含有 72.6mg (0.05M)Tris、8mgMgCl2 (3.3mM)和 IOOmgNaCl 的溶液中，該溶液 ρΗ=9.0 ； b.加入225mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，135mg葡萄糖-6-磷酸G-6-P以及0.75mL卡必醇； c.逐滴加入2mL二甲基亞諷； 2)I, 5-脫水山梨醇衍生物的激活 a)在無水狀態(tài)下稱取IOmgl,5-脫水山梨醇衍生物，溶解于600 μ LDMF中； b)使上述溶液溫度降到-2~-8°C; c)加入3yL三丁胺； d)加入1.5μ L氯甲酸異丁酯； e)-2~-8°C攪拌30分鐘； 3)G6PDH與1，5-脫水山梨醇衍生物的連接 a)將上述激活的1，5-脫水山梨醇衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中； b)2-8°C攪拌過夜； 4)純化產(chǎn)物 通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8°C下儲存。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于，步驟(5)的具體過程如下: 試劑A的制備:將4.036g (11.25mM)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸G6P用lL55mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將制備的抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積比為 1:100 ~1:10000 ； 試劑B的制備:將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mM、pH=8.2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100 ~ 1:10000。
10.利用權(quán)利要求1至5任意一項所述的1，5-脫水山梨醇免疫檢測試劑的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將待測樣本與抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體接觸； 2)根據(jù)待測樣本中1，5-脫水山梨醇與抗1，5-脫水山梨醇特異性抗體的結(jié)合情況，利用指示試劑判斷樣本中甘膽酸的含量；所述待測樣本為血清、血漿、唾液或尿液。
【文檔編號】G01N33/531GK103760366SQ201410047754
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月11日
【發(fā)明者】虞留明, 成志鵬, 王英, 張曼, 顧國浩 申請人:蘇州博源醫(yī)療科技有限公司