一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的lc-qtof分析方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析化學領域，以虎杖來源的白藜蘆醇和葡萄藤來源的白藜蘆醇為研究對象，利用高靈敏度高分辨率的液質(zhì)聯(lián)用技術(LC-QTOF)以提供更多化合物結(jié)構(gòu)信息的特點，研究白藜蘆醇樣品中的微量成分差異，找到了可以區(qū)分不同來源白藜蘆醇的四種標示化合物，進一步確認了虎杖和葡萄藤來源白藜蘆醇樣品中的微量成分差異，對于區(qū)分不同原料來源的白藜蘆醇樣品提供了方法借鑒，對天然保健食品-白藜蘆醇的真實屬性識別具有重要的意義。同時，該技術方法也可以廣泛的推廣應用于進出口農(nóng)產(chǎn)品和生物原料的真實屬性檢測和鑒別標準中，為天然產(chǎn)物原料真實屬性的識別提供技術示范和參考標準的建立。
【專利說明】—種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學領域，提供了一種識別白藜蘆醇原料來源的LC-QTOF(液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用)分析方法。
【背景技術】
[0002]白藜蘆醇具有抗腫瘤、預防心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)及抗菌等廣泛的生物活性，它所具有的特殊保健功效使得其在市場上廣受歡迎。隨著白藜蘆醇的生物活性逐漸被認識，越來越多的保健品生產(chǎn)企業(yè)都非常看好白藜蘆醇的功能性，它作為終端產(chǎn)品的應用面有望不斷拓寬。現(xiàn)階段，國內(nèi)外市場對白藜蘆醇的需求量越來越大，白藜蘆醇將會更加廣泛、更安全的應用到各個領域當中。
[0003]通常白藜蘆醇的來源有化學合成、微生物、生物合成及天然植物提取。化學合成能大量的生產(chǎn)白藜蘆醇，但現(xiàn)階段化學合成白藜蘆醇的各種方法存在不同程度的環(huán)境污染等問題；而微生物發(fā)酵生物合成白藜蘆醇技術的投入較大，在市場上尚未大規(guī)模形成產(chǎn)業(yè)化前景。因此市場上98%原料級白藜蘆醇主要源自于天然植物虎杖中提取獲得和合成獲得，但市場上有5%-20%不同規(guī)格的產(chǎn)品分別來自虎杖和其他植物如葡萄藤等。
[0004]中藥虎杖原材料本身含有少量的白藜蘆醇，但其含有高達3%左右的虎杖苷，通過生物酵解的方法可以得到高含量的白藜蘆醇，所以虎杖是工業(yè)生產(chǎn)白藜蘆醇的極為重要的原材料。中藥虎杖中白藜蘆醇主要開發(fā)的產(chǎn)品規(guī)格為50%、98%，產(chǎn)品價格約為800-3000元/公斤左右，具有較為廣闊的應用市場。但由于虎杖為中國傳統(tǒng)藥材中的一種，并非藥食同源植物，在國外如日本，從虎杖中提取開發(fā)的白藜蘆醇產(chǎn)品只能應用于醫(yī)藥領域，在食品行業(yè)中使用具有一定的法律瓶頸。
[0005]而葡萄藤來源的白藜蘆醇含量相對較低(含量一般在幾十到幾百ppm)，其產(chǎn)品的開發(fā)在我國相對滯后，但以藥食同源植物-葡萄藤為原料開發(fā)的白藜蘆醇相關產(chǎn)品其安全性在國際市場上能夠得到更廣泛地接受，可以在醫(yī)藥領域中使用，也可以廣泛應用到諸如保健品、食品領域中。同時，葡萄藤中不僅含有白藜蘆醇，而且還含有豐富的白藜蘆醇低聚物，如ε-viniferin、a-viniferin、Miyabenol C等,這些白藜蘆醇低聚物可以向單體轉(zhuǎn)化，從而提高白藜蘆醇的含量。葡萄藤中白藜蘆醇產(chǎn)品生產(chǎn)規(guī)格一般為5%或15-20%，價格分別在200歐元/公斤和1000歐元/公斤左右，遠高于傳統(tǒng)的虎杖來源白藜蘆醇產(chǎn)品價格，雖然價格昂貴，但受到健康食品制造商的青睞與歡迎。
[0006]不同植物來源生產(chǎn)的白藜蘆醇產(chǎn)品價格的巨大差異導致市場上一些不法商家為獲得高額利潤以相對低廉的虎杖來源的白藜蘆醇假冒較昂貴的葡萄藤來源白藜蘆醇應用到保健品、食品領域中，市場上存在將高純度的虎杖來源白藜蘆醇添加到低純度葡萄藤來源的白藜蘆醇中的現(xiàn)象，從而導致消費者的身體健康受到一定程度的損害和威脅，也擾亂了相關產(chǎn)品的國際國內(nèi)的市場秩序，引起不同程度的貿(mào)易糾紛。國際市場上明確規(guī)定，具有藥用保健的產(chǎn)品不能添加到保健食品當中，因此，為保證民眾身體健康、應對國際貿(mào)易壁壘，維護我國產(chǎn)品的國際聲譽，維護國家經(jīng)濟社會穩(wěn)定和國際貿(mào)易健康發(fā)展，亟待加強白藜蘆醇產(chǎn)品原料來源的真實屬性表征與識別技術研究。
[0007]目前應用得最多的白藜蘆醇的分析檢測方法如下:
[0008]( I)高效液相色譜法(HPLC)
[0009]白藜蘆醇的極性較小，分析檢測上普遍采用反相高效液相色譜進行分析，常采用乙腈-磷酸水、甲醇-冰乙酸等常用流動相分析。通用檢測器包括紫外分光光度計、二級管陣列、電化學、熒光掃描檢測等。吳波等人應用高效液相色譜熒光檢測法建立了一種快速、靈敏、適用于水果中順、反白藜蘆醇及其苷的定量分析方法，此法已得到較好的應用。
[0010](2)液質(zhì)聯(lián)用技術(LC-MS)
[0011]由于白藜蘆醇與其衍生物結(jié)構(gòu)相近，且白藜蘆醇代謝物在植物體內(nèi)含量較低，單一的分析技術一般難以獲得準確的結(jié)果，因此液質(zhì)聯(lián)用技術成為用于分析此類復雜組分的重要手段之一，楊潤濤等人以LichiOspher C18柱作為分析色譜柱，乙腈-水為流動相，采用電噴霧離子源，內(nèi)標法定量以及多反應監(jiān)測模式，在已選定的條件下，建立了對血漿中白藜蘆醇苷及其代謝產(chǎn)物同時測定的LC-MS定量分析方法。LC-QTOF指的是液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜，LC-MS指的是液相色譜-單級質(zhì)譜，LC-QTOF技術是一種近年才興起的更先進、更可靠、更準確的質(zhì)譜技術，能獲得的化合物信息比LC-MS要多很多。
[0012](3)氣質(zhì)聯(lián)用技術(GC-MS)
[0013]欒天罡等人通過采用甲基硅烷化與固相微萃取技術(SPME)相結(jié)合的預處理方法，應用GC-MS技術對葡萄藤酒中的19種極性有機物和多酚類化合物進行定性分析，同時對反式白藜蘆醇進行了定量分析。
[0014](4)毛細管電泳法(CE)
[0015]目前已經(jīng)用于白藜蘆醇定量檢測研究的電泳模式包括毛細管區(qū)帶電泳、非水介質(zhì)毛細管電泳等，能同時對白藜蘆醇的正、反異構(gòu)體進行分離檢測。毛細管電泳檢測白藜蘆醇的技術通過與連續(xù)進樣技術和固相萃取技術相結(jié)合，已經(jīng)實現(xiàn)了樣品的自動化預處理過程。曹佳等人以芐基三甲基碘化胺為內(nèi)標，建立了 7分鐘內(nèi)使白藜蘆醇與白藜蘆醇苷達到基線分離、且線性動態(tài)范圍和檢出限效果均較好的方法。鄭妍鵬等采用三(羥甲基)氨基甲烷-硼酸(THAM-H3B03)作為支持電解質(zhì)，甲醇作為分離介質(zhì)，用電導檢測技術對虎杖中的白藜蘆醇進行了測定分析，結(jié)果表明采用非水介質(zhì)毛細管電泳電導檢測對白藜蘆醇進行測定時其干擾物質(zhì)分離效果優(yōu)于氣質(zhì)聯(lián)用技術。
[0016](5)薄層掃描色譜法(TLC)
[0017]周國海等人以氯仿:丙酮:乙酸:水(4:4:0.5:0.2)為展開劑，硅膠G作為薄層吸附劑，對虎杖各部位白藜蘆醇的含量測定進行了方法學考察。舒友琴等人以苯:甲醇:甲酸(10:5:1)為展開劑，首次采用聚酰胺薄膜作固定相，利用熒光掃描法定量分析對虎杖白藜蘆醇4種異構(gòu)體進行了測定，結(jié)果表明其測定靈敏度比硅膠作固定相的薄層掃描法提高了將近100倍，此法同樣也可應用于其他樣品中的白藜蘆醇及其異構(gòu)體含量測定。
[0018]此外，目前用于白藜蘆醇的檢測方法還包括二次微分簡易示波伏安法，電化學方法、酶標法、離子共振光譜法、電子順磁共振法等。
[0019]至今為止，關于白藜蘆醇原料來源真實屬性識別與質(zhì)量控制的研究相對較少，國外對不同植物來源的白藜蘆醇的識別研究鮮有報道，國內(nèi)僅劉岱琳等對葡萄藤來源白藜蘆醇樣品進行研究，采用高效液相色譜法建立了葡萄藤來源白藜蘆醇樣品的分析譜圖，并對譜圖中主要色譜峰進行識別與含量測定，且對易混淆的虎杖來源白藜蘆醇樣品進行大黃素檢測，結(jié)果顯示葡萄藤白藜蘆醇樣品中含有其特有成分ε-viniferin, ε-viniferin與白藜蘆醇成一定比例存在于植物提取物中，并且葡萄藤來源的白藜蘆醇樣品中不應檢出大黃素。
[0020]國內(nèi)劉岱琳的對葡萄白藜蘆醇提取物研究的具體方法為:利用高效液相色譜法建立葡萄來源白藜蘆醇提取物的分析圖譜，對其主要色譜峰白藜蘆醇及ε -viniferin進行了識別，并建立了含量測定方法。
[0021]葡萄來源白藜蘆醇提取物的高效液相圖譜分析條件為:
[0022]色譜柱:C18，250mm*4.6mm, 5um
[0023]流速:1.0ml/min 柱溫:25°C 檢測波長:310nm
[0024]流動相:A: 1%冰醋酸水溶液B: 1%冰醋酸甲醇溶液
[0025]白藜蘆醇及ε -viniferin的含量測定方法均為:
[0026]高效液相檢測條件:流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(30:70)，檢測波長:303nm
[0027]色譜柱:C18,150mm*4.6mm, 5um 流速:1.0ml/min
[0028]大黃素的含量測定方法為:
[0029]高效液相檢測條件:流動相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(85:15)，檢測波長:254nm
[0030]色譜柱:C18,150mm*4.6mm, 5um 流速:1.0ml/min
[0031]劉岱琳文章中采用不同的分析方法對葡萄白藜蘆醇提取物中白藜蘆醇、ε-葡萄素及大黃素進行了分析和含量測定，其結(jié)果表明，葡萄來源的白藜蘆醇中含有其特有成分ε -葡萄素，并與白藜蘆醇成一定比例存在于植物提取物中，且葡萄來源白藜蘆醇提取物中不應檢測出大黃素。
[0032]劉岱琳等人的研究方法只針對葡萄來源的白藜蘆醇提取物進行了研究，得出葡萄來源白藜蘆醇中含有其特有成分ε -葡萄素，并猜測性的對葡萄來源白藜蘆醇中大黃素的含量進行了測定，結(jié)果顯示葡萄來源白藜蘆醇中不應檢測出大黃素，故此將ε-葡萄素與大黃素兩種化合物作為區(qū)別葡萄來源白藜蘆醇的依據(jù)。若將高純度的虎杖白藜蘆醇與葡萄白藜蘆醇混在一起，采用此法則無法辨別白藜蘆醇的真實來源，此法也未將其他原料來源白藜蘆醇如虎杖來源白藜蘆醇進行對比研究，也不能明確如何鑒別不同原料來源的白藜蘆醇，在白藜蘆醇的識別技術上存在一定的缺陷。
[0033]該方法在一定程度上為識別葡萄藤來源的白藜蘆醇產(chǎn)品提供了借鑒與參考，但并未形成一套識別不同來源白藜蘆醇真實屬性的完整體系，該方法不能明確如何鑒別不同原料來源的白藜蘆醇，在白藜蘆醇的識別技術上存在一定的缺陷。因此，對于進一步完善白藜蘆醇的分析檢測方法以及不同原料來源的白藜蘆醇識別技術，深化對白藜蘆醇真實屬性識別研究，研究出一套完整的白藜蘆醇識別研究方法，對其產(chǎn)品質(zhì)量管理控制具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0034]本發(fā)明要解決的技術問題是:針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，用同一種分析方法即可區(qū)分白藜蘆醇的不同來源，對天然保健食品-白藜蘆醇的真實屬性識別具有重要的意義。[0035]為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0036]一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，具體步驟為:
[0037](I)配制檢測樣品:取白藜蘆醇質(zhì)量含量相同的虎杖提取物樣品和葡萄藤提取物樣品，加入醇溶解，配制成樣品質(zhì)量濃度相同的溶液，在25°C -30°C下超聲25-35min，靜置冷卻，微孔濾膜過濾，濾液作為檢測樣品；
[0038](2)檢測:將檢測樣品進行液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用方法進行分析，得到液相色譜圖和質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)；其中，分析條件控制如下:
[0039]a)液相色譜分析條件
[0040]色譜柱:XUnionC18 ；
[0041]流動相:乙腈-水；
[0042]梯度洗脫:0-30min，流動相中乙腈的體積濃度為10%_50% ；
[0043]30-40min,流動相中乙腈的體積濃度為50%_95% ；
[0044]40-42min,流動相中乙腈的體積濃度為95%_10% ；
[0045]42-50min,流動相中乙腈的體積濃度為10% ；
[0046]流速:0.1-0.3mL/min ；
[0047]柱溫:25°C-35 °C ；
[0048]檢測波長:287nm；
[0049]b)質(zhì)譜分析條件
[0050]離子源:ESI霧化氣:50_60psig ；
[0051]掃描方式:負離子模式干燥氣流速:5_7L/min ；
[0052]鞘氣溫度:400°C ;毛細管電壓:3000V ；
[0053]鞘氣流速:10-14L/min;裂解電壓:125_145V ;
[0054]錐孔電壓:50-70V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜；
[0055](3)對圖譜和數(shù)據(jù)分析:
[0056]對采集到的虎杖及葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進行分析，得到共有峰；
[0057](4)特征化合物確認
[0058]利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進一步對總離子流圖進行離子提取，得到EIC圖，對比EIC圖中的出峰差異，得到兩者間具有明顯差異性的特征化合物；
[0059](5)判斷
[0060]根據(jù)特征化合物來判斷白藜蘆醇的不同來源。
[0061]步驟(3)所述對圖譜和數(shù)據(jù)分析優(yōu)選如下:
[0062]采用Agilent Mass Hunter分析軟件對采集到的虎杖及葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進行分析，得到11個共有峰，具體如下:
[0063]在虎杖來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時間為10.26mi的峰為虎杖苷，出峰時間為16.02min的峰為3-甲基-5-羥基-7-甲氧基-色酮，出峰時間為17.087min的峰為大黃素-8-0- β -D-葡萄糖苷，出峰時間為17.627min的峰為大黃素甲醚_1_0- β -D-葡萄糖苷，出峰時間為20.2min的峰為大黃素甲醚_1_0-β -D-葡萄糖苷，出峰時間為22.093min的峰為山奈酚，出峰時間為34.487min的峰為大黃素；[0064]在葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時間為18.427min的峰為葡萄素A，出峰時間為19.4min的峰為葡萄素H，出峰時間為20.953min的峰為ε-葡萄素，出峰時間為
22.867min的峰為α -葡萄素；
[0065]步驟(4)的特征化合物確認優(yōu)選如下:
[0066]利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進一步對總離子流圖進行離子提取，得到EIC圖，虎杖來源的白藜蘆醇提取物中在保留時間為20.200min處，34.827min處有相應峰，分別為大黃素甲醚-l-0-β -D-葡萄糖苷和大黃素，且大黃素峰較高，而葡萄藤來源白藜蘆醇提取物中在20.200min處沒有色譜峰，在34.827min處也不見峰形；對ε-葡萄素及α-葡萄素進行EIC提取時，葡萄藤來源白藜蘆醇提取物在保留時間為21.368min及23.253min處有相應峰，而虎杖來源白藜蘆醇提取物在相應的保留時間內(nèi)沒有相應峰，因此，得到兩者間具有明顯差異性的4個特征化合物，它們分別是虎杖來源的白藜蘆醇提取物中的大黃素甲醚-l-0-β -D-葡萄糖苷和大黃素以及葡萄藤來源白藜蘆醇提取物中的ε -葡萄素和α-葡萄素；
[0067]步驟(5)判斷方法優(yōu)選如下:
[0068]通過上述分析，在EIC圖中，只在20.200min處和34.827min處有相應峰，則為虎杖來源的白藜蘆醇；只在21.368min和23.253min處有相應峰，則為葡萄藤來源的白藜蘆醇；在以上四個出峰時間均不出峰，則為其它來源的白藜蘆醇；在以上四個出峰時間均出峰，則為兩者的混合物。
[0069]分析條件優(yōu)選控制如下:
[0070]a)液相色譜分析條件
[0071]色譜柱:XUnionC18 ；
[0072]流動相:乙腈-水；
[0073]梯度洗脫:0-30min，流動相中乙腈的體積濃度為10%_50% ；
[0074]30-40min,流動相中乙腈的體積濃度為50%_95% ；
[0075]40-42min,流動相中乙腈的體積濃度為95%_10% ；
[0076]42-50min,流動相中乙腈的體積濃度為10% ；
[0077]流速:0.2mL/min ；
[0078]柱溫:30°C；
[0079]檢測波長:287nm；
[0080]進樣量:5yL
[0081]b)質(zhì)譜分析條件
[0082]離子源:ESI霧化氣:55psig ；
[0083]掃描方式:負離子模式干燥氣流速:6L/min ；
[0084]鞘氣溫度:400°C ;毛細管電壓:3000V ；
[0085]鞘氣流速:12L/min ;裂解電壓:135V ;
[0086]錐孔電壓:65V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
[0087]優(yōu)選所述白藜蘆醇的質(zhì)量含量為5%,所述樣品質(zhì)量濃度lOmg/lOOmL。
[0088]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)勢是:[0089]1、該分析方法可以通過一種分析方法來區(qū)別白藜蘆醇的不同來源，特別是在葡萄藤來源的白藜蘆醇中區(qū)分是否含有虎杖來源的白藜蘆醇，防止將高純度的虎杖來源白藜蘆醇添加到低純度葡萄藤來源的白藜蘆醇中的現(xiàn)象發(fā)生。
[0090]2、該分析方法精確性高、重復性好、穩(wěn)定性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0091]圖1是5%虎杖白藜蘆醇TIC圖；
[0092]圖2是5%葡萄白藜蘆醇TIC圖；
[0093]圖3是98%虎杖白藜蘆醇TIC圖；
[0094]圖4是5%虎杖RES提取TIC圖；
[0095]圖5是5%虎杖RES提取大黃素甲醚-1_0_β -D-葡萄糖苷EIC圖；
[0096]圖6是5%虎杖RES提取大黃素EIC圖；
[0097]圖7是5%虎杖RES提取ε -葡萄素EIC圖；
[0098]圖8是5%虎杖RES提取α-葡萄素EIC圖；
[0099]圖9是5%葡萄RES提取TIC圖；
[0100]圖10是5%葡萄RES提取大黃素甲醚-1-0-β -D-葡萄糖苷EIC圖；
[0101]圖11是5%葡萄RES提取大黃素EIC圖；
[0102]圖12是5%葡萄RES提取ε -葡萄素EIC圖；
[0103]圖13是5%葡萄RES提取α-葡萄素EIC圖。
【具體實施方式】
[0104]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明。
[0105]I材料與方法
[0106]1.1實驗材料
[0107]1.1.1樣品材料
[0108]同一產(chǎn)地(湖北宜昌)不同時期虎杖提取物(白藜蘆醇含量均為5%)八批，同一產(chǎn)地(湖南永安)不同時期葡萄藤提取物(白藜蘆醇含量均為5%)八批，同一產(chǎn)地(湖北宜昌)不同時期虎杖提取物(白藜蘆醇含量均為98%)均由湖南美可達生物資源有限公司提供。
[0109]1.1.2儀器與設備
[0110]Agilentl290液相色譜-G6530系列四美國安捷倫公司
[0111]級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀
[0112]超純水裝置美國Milipore公司
[0113]電子分析天平上海Mettler-Tolede儀器有限公司
[0114]KQ5200DE型數(shù)控超聲裝置昆山市超聲儀器有限公司
[0115]1.1.3主要試劑
[0116]甲醇(安徽時聯(lián)特種溶劑股份有限公司)為色譜純、乙腈(美國默克公司)為色譜純；所用水為實驗室自制超純水(總有機碳TOC ( 5ppb)；
[0117]白藜蘆醇(RES，≤99%)和虎杖苷(Polydatin，≤96%)、山奈酚(KaempferoI,≤96%)、大黃素(Emodin,≤98%)標準樣品均購自中國藥品生物制品檢定所。[0118]1.2實驗方法
[0119]1.2.1混合對照品溶液制備
[0120]分別精密稱取標準品白藜蘆醇、虎杖苷、山奈酚、大黃素適量，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶解，保持25°C超聲，直至樣品完全溶解，靜置冷卻定容，儲備液用色譜甲醇稀釋，配置成濃度為10-50 μ g/mL的混合對照品溶液，過0.22 μ m有機微孔濾膜，備用。
[0121]1.2.2供試液溶液制備
[0122]精密稱取5%、98%的虎杖提取物、5%的葡萄藤提取物樣品各10mg，置于IOOmL棕色容量瓶中，加入適量色譜甲醇溶解，保持25°C，超聲30min，靜置冷卻定容，過0.22 μ m有機微孔濾膜，濾液作為供試品溶液備用。
[0123]1.2.3色譜分析條件
[0124]色譜柱:XUnion C18(2.8ym，4.6X150mm)(華譜新創(chuàng)科技有限公司);
[0125]流動相:乙腈(B)-水(A);梯度洗脫(0-30min，10%_50%B；30-40min, 50%-95%B ；40-42min,95%-10%B,42_50min，10%B)
[0126]流速:0.2mL/min ;
[0127]柱溫:30°C;
[0128]檢測波長:287nm;
[0129]進樣量:5μ L
[0130]1.2.4質(zhì)譜分析條件
[0131]離子源:ESI霧化氣:55psig ；
[0132]掃描方式:負離子模式干燥氣流速:6L/min ；
[0133]鞘氣溫度:400°C ;毛細管電壓:3000V ；
[0134]鞘氣流速:12L/min ;裂解電壓:135V ;
[0135]錐孔電壓:65V ;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
[0136]2結(jié)果與分析
[0137]2.1方法學考察
[0138]2.1.1 精密度
[0139]取虎杖提取物(白藜蘆醇含量5%)樣品I號(HZ1)，按照1.2.2項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄樣品色譜圖。結(jié)果表明主要色譜峰白藜蘆醇的相對保留時間RSD值為0.52%，相對峰面積的RSD值為1.59%，如表3.1所示，符合特征圖譜要求，表明儀器的精密度良好。
[0140]表3.1精密度實驗數(shù)據(jù)
【權利要求】
1.一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，具體步驟為: (1)配制檢測樣品:取白藜蘆醇質(zhì)量含量相同的虎杖提取物樣品和葡萄藤提取物樣品，加入醇溶解，配制成樣品質(zhì)量濃度相同的溶液，在25°C -30°C下超聲25-35min，靜置冷卻，微孔濾膜過濾，濾液作為檢測樣品； (2)檢測:將檢測樣品進行液相色譜/四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用方法進行分析，得到液相色譜圖和質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)；其中，分析條件控制如下: a)液相色譜分析條件 色譜柱:XUnion C18 ； 流動相:乙腈-水； 梯度洗脫:0-30min，流動相中乙腈的體積濃度為10%_50% ； 30-40min,流動相中乙腈的體積濃度為50%_95% ； 40_42min,流動相中乙臆的體積濃度為95%_10% ； 42-50min，流動相中乙腈的體積濃度為10% ；
流速:0.1-0.3mL/min ；
柱溫:25°C -35 °C ； 檢測波長:287nm ； b)質(zhì)譜分析條件 離子源:ESI霧化氣:50_60psig ； 掃描方式:負離子模式干燥氣流速:5-7L/min ； 鞘氣溫度:400°C ； 毛細管電壓:3000V ； 鞘氣流速:10-14L/min ；裂解電壓:125-145V ； 錐孔電壓:50-70V; 質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜； (3)對圖譜和數(shù)據(jù)分析: 對采集到的虎杖及葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進行分析，得到共有峰； (4)特征化合物確認 利用質(zhì)譜分析獲得的虎杖、葡萄藤來源白藜蘆醇指紋圖譜中共有峰的化合物信息，根據(jù)精確分子量進一步對總離子流圖進行離子提取，得到EIC圖，對比EIC圖中的出峰差異，得到兩者間具有明顯差異性的特征化合物； (5)判斷 根據(jù)特征化合物來判斷白藜蘆醇的不同來源。
2.根據(jù)權利要求1所述一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，分析條件控制如下: a)液相色譜分析條件 色譜柱:XUnion C18 ； 流動相:乙腈-水； 梯度洗脫:0-30min，流動相中乙腈的體積濃度為10%_50% ； 30-40min,流動相中乙腈的體積濃度為50%_95% ； 40_42min,流動相中乙臆的體積濃度為95%_10% ； 42-50min，流動相中乙腈的體積濃度為10% ；流速:0.2mL/min ； 柱溫:30°C ; 檢測波長:287nm ； 進樣量:5yL b)質(zhì)譜分析條件 離子源:ESI霧化氣:55psig ； 掃描方式:負離子模式干燥氣流速:6L/min ； 鞘氣溫度:400°C ； 毛細管電壓:3000V ； 鞘氣流速:12L/min ; 裂解電壓:135V ; 錐孔電壓:65V;質(zhì)量掃描范圍:100-1700m/z，每0.2s采集I次圖譜。
3.根據(jù)權利要求1或2所述一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，所述白藜蘆醇的質(zhì)量含量為5%,所述樣品質(zhì)量濃度lOmg/lOOmL。
4.根據(jù)權利要求1或2所述一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步驟(3)所述對圖譜和數(shù)據(jù)分析如下: 采用Agilent Mass Hunter分析軟件對采集到的虎杖及葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖和數(shù)據(jù)進行分析，得到11個共有峰，具體如下: 在虎杖來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時間為10.26mi的峰為虎杖苷，出峰時間為.16.02min的峰為3-甲基-5-羥基-7-甲氧基-色酮，出峰時間為17.087min的峰為大黃素-8-0- β -D-葡萄糖苷，出峰時間為17.627min的峰為大黃素甲醚_1_0- β -D-葡萄糖苷，出峰時間為20.2min的峰為大黃素甲醚_1_0-β -D-葡萄糖苷，出峰時間為22.093min的峰為山奈酚，出峰時間為34.487min的峰為大黃素； 在葡萄藤來源白藜蘆醇質(zhì)譜圖中，出峰時間為18.427min的峰為葡萄素A，出峰時間為.19.4min的峰為葡萄素H,出峰時間為20.953min的峰為ε -葡萄素，出峰時間為22.867min的峰為α -葡萄素。
5.根據(jù)權利要求1或2所述一種區(qū)分不同來源白藜蘆醇的LC-QTOF分析方法，其特征是，步驟(4)所述特征化合物分別是虎杖來源的白藜蘆醇提取物中的大黃素甲醚-l-0-β-D-葡萄糖苷和大黃素以及葡萄藤來源白藜蘆醇提取物中的ε-葡萄素和α -葡萄素。
【文檔編號】G01N30/02GK103808822SQ201410049300
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月13日 優(yōu)先權日:2014年2月13日
【發(fā)明者】張瑩, 曾建國, 黃志強, 李潔 申請人:湖南省檢驗檢疫科學技術研究院