利用qcm傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的方法及專(zhuān)用金片的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了利用QCM傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的方法及專(zhuān)用金片。本發(fā)明提供了一種制備用于檢測(cè)病毒的QCM金片的方法，包括如下步驟：1）用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片；2）將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用石英晶體微天平生物傳感器對(duì)MCMV的檢測(cè)進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)兩種修飾金片方法11-MUA單獨(dú)修飾QCM金片和3-MPA和11-MUA共同修飾QCM金片作比較，分析3-MPA和11-MUA共同修飾QCM金片檢測(cè)靈敏度高、特異性好，且能應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】利用QCM傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的方法及專(zhuān)用金片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種利用QCM傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的方法及專(zhuān)用金片。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米裡綠斑駁病毒(Maziechlorotic mottle virus, MMCMV)是正單鏈 RNA,其為直徑30nm 二十面體，它屬于玉米褪綠斑駁病毒屬，番茄叢矮病毒科的一員。它嚴(yán)重危害小麥、大麥、高粱、燕麥等多達(dá)15-19種禾本科植物的生長(zhǎng)。玉米褪綠斑駁病毒廣泛分布于阿根延、美國(guó)等歐美國(guó)家以及非洲的5個(gè)國(guó)家，由于其分布廣泛，傳入我國(guó)的的風(fēng)險(xiǎn)逐步加大。如果田間發(fā)現(xiàn)有病植株后，其可經(jīng)昆蟲(chóng)介體、種子攜帶等方式快速傳播，誘發(fā)大面積玉米發(fā)病，玉米葉片會(huì)出現(xiàn)褪綠斑駁等癥狀，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]現(xiàn)階段玉米褪綠斑駁病毒的主要檢測(cè)方法有ELISA、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR等。這些傳統(tǒng)的方法在檢測(cè)MMCMV時(shí)都有一定的缺陷，ELISA操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果受到實(shí)驗(yàn)用品、操作過(guò)程等影響；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR易產(chǎn)生污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著技術(shù)的發(fā)展，石英晶體微天平(Quartz Crystal Microbalance, QCM)以其無(wú)標(biāo)記、高靈敏度且快速的優(yōu)點(diǎn)作為生物傳感器越來(lái)越多的應(yīng)用于疫病的檢測(cè)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備用于檢測(cè)病毒的QCM金片的方法。
[0005]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:
[0006]1)用巰基^ 酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片,得到修飾后金片；
[0007]2)將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片。
[0008]上述方法中，QCM金片為單側(cè)鍍金片，12_X20mm,單側(cè)鍍金50nm, BioNavis公司，貨號(hào) QSX301-AU-13052。
[0009]步驟I)中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備:將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中；
[0010]步驟I)中，所述浸泡為4°C浸泡12h ；
[0011]步驟2)中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗病毒抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過(guò)酰胺鍵連接。
[0012]上述方法中，
[0013]步驟I)中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:1-1:10，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比具體為1:1、1:5或1:10。
[0014]上述方法中，
[0015]所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:10。
[0016]上述方法中，[0017]所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9mM ；
[0018]所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9mM。
[0019]上述方法中，
[0020]步驟2)中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片按照如下方法制備:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修飾后金片表面的巰基十一酸和3-巰基丙酸的羧基基團(tuán)；再滴加所述抗病毒抗體，以固定抗體；再將BSA封閉，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片;
[0021]步驟2)中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片具體按照如下方法制備:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修飾后金片表面，常溫(25°C)下靜置2小時(shí)；再滴加所述抗病毒抗體，37°C反應(yīng)3小時(shí)；再滴加濃度為lmg/mL BSA，25°C下靜置I小時(shí)，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片；
[0022]含有EDC (N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亞胺)和Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的溶液:用分析天平稱(chēng)取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100 μ L MES溶液，振蕩均勻，使EDC在溶液中的濃度為表2所示，NHS在溶液中的濃度為表2所示?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
[0023]MES (脂肪酸甲酯磺酸鹽)溶液:稱(chēng)取3.90g MES溶于180mLddH20，調(diào)節(jié)pH至5.0，定容至Ij 200mL。
[0024]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比為4_5:1 ;
[0025]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比具體為5:1。
[0026]上述方法中，
[0027]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的終濃度為0.075M,且Sulfo-NHS的終濃度為0.015M。
[0028]上述方法中，
[0029]所述抗病毒抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，所述抗病毒抗體具體為單克隆抗體；
[0030]所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
[0031]由上述的方法制備的用于檢測(cè)病毒的QCM金片；所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
[0032]上述的用于檢測(cè)病毒的QCM金片在檢測(cè)病毒中的應(yīng)用；所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
[0033]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用石英晶體微天平生物傳感器對(duì)MCMV的檢測(cè)進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)兩種修飾金片方法Il-MUA單獨(dú)修飾QCM金片和3-MPA和Il-MUA共同修飾QCM金片作比較，分析3-MPA和Il-MUA共同修飾QCM金片檢測(cè)靈敏度高、特異性好，且能應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)的方法。另外，Il-MUA價(jià)格為7670.52RMB/g,而3-MPA則只需花1.6RMB/g。顯然3-MPA和Il-MUA共修飾的QCM金片成本更低。因此該方法制備的金片為MCMV及感染MCMV的植物樣品的檢測(cè)提供了新的、高效的檢測(cè)技術(shù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1為I1-MUA修飾的QCM金片的靈敏度
[0035]圖2為11-MUA修飾的QCM金片檢測(cè)MCMV特異性[0036]圖3為I1-MUA修飾的QCM金片對(duì)植物樣品的檢測(cè)
[0037]圖4為3-MPA和11-MUA體積比
[0038]圖5為I1-MUA和3-MPA共修飾QCM金片金片檢測(cè)MCMV的靈敏度
[0039]圖6為3-MPA和I1-MUA共修飾的QCM檢測(cè)MCMV的靈敏度
[0040]圖7為3-MPA和11-MUA修飾的QCM檢測(cè)MCMV特異性[0041 ]圖8為3-MPA和I1-MUA共修飾的QCM金片檢測(cè)實(shí)際樣品
[0042]圖9為I1-MUA修飾的QCM金片的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
[0043]圖10為3-MPA和I1-MUA修飾的QCM檢測(cè)MCMV的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
[0044]圖11為兩種修飾方法靈敏度比較
[0045]圖12為3-MPA和I1-MUA共修飾的QCM金片表面厚度變化
[0046]圖13為D-F曲線(xiàn)
【具體實(shí)施方式】
[0047]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0048]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]下述實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑及材料如表1所示:
[0050]表1化學(xué)試劑及材料表
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種制備用于檢測(cè)病毒的QCM金片的方法，包括如下步驟: 1)用巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片，得到修飾后金片； 2)將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述巰基十一酸和3-巰基丙酸共修飾QCM金片按照如下方法制備:將所述QCM金片浸泡在含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中； 步驟2)中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片為將所述抗病毒抗體與所述修飾后金片上的巰基十一酸和3-巰基丙酸通過(guò)酰胺鍵連接。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于: 步驟I)中，所述含有巰基十一酸和3-巰基丙酸的乙醇溶液中，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:1-1:10，所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比具體為1:1、1:5或1:10。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述巰基十一酸和所述3-巰基丙酸的摩爾濃度比為1:10。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述巰基十一酸在所述溶液中的終濃度為0.9mM ； 所述3-巰基丙酸在所述溶液中的終濃度為9mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 步驟2)中，所述將抗病毒抗體固定到所述修飾后金片按照如下方法制備:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修飾后金片表面的巰基十一酸和3-巰基丙酸的羧基基團(tuán)；再滴加所述抗病毒抗體，以固定抗體；再將BSA封閉，得到用于檢測(cè)所述病毒的QCM金片; 所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比為4-5:1; 所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩爾比具體為5:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其特征在于:所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的終濃度為0.075M,且Sulfo-NHS的終濃度為0.015M。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述抗病毒抗體為單克隆抗體或多克隆抗體，所述抗病毒抗體具體為單克隆抗體； 所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
9.由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備的用于檢測(cè)病毒的QCM金片；所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
10.權(quán)利要求9所述的用于檢測(cè)病毒的QCM金片在檢測(cè)病毒中的應(yīng)用；所述病毒具體為玉米褪綠斑駁病毒。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103792352SQ201410049532
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年2月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月13日
【發(fā)明者】黃新, 徐江敏 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院