一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法，具體是將含有DNA修飾的金納米錐的溶液與含有待檢測DNA的溶液混合進(jìn)行退火反應(yīng)；檢測圓二色光譜，當(dāng)檢測到退火后相比退火前在550-850nm波段出現(xiàn)圓二色光譜的信號增強(qiáng)時，說明金納米錐發(fā)生聚集，待檢測DNA與金納米錐上修飾的DNA存在互補(bǔ)序列。本發(fā)明的方法相比基于金納米棒聚集的圓二色光譜檢測DNA的方法信號更強(qiáng)、靈敏度更高、檢出限更低且重復(fù)性更好，能夠用于DNA的定量分析。
【專利說明】—種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及應(yīng)用納米技術(shù)檢測DNA的領(lǐng)域，尤其涉及一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA (Deoxyribonucleicacid,脫氧核糖核酸)是一種螺旋的手性生物分子，在納米電子學(xué)、納米材料和光學(xué)器件領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。已有研究報道(Chem.Soc.Rev.，2013, 42，7028-7041)，當(dāng)金屬納米粒子和手性分子相互作用時可以產(chǎn)生等離子誘導(dǎo)的圓二色手性信號。DNA作為一種手性分子，相對于其他手性小分子，具有以下優(yōu)勢:(1)具有相對堅固的雙螺旋結(jié)構(gòu)可以提供更大的手性偶極，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的手性信號；(2) DNA分子可設(shè)計性強(qiáng)，易于合成多種手性結(jié)構(gòu)(Nano Lett.，2013，13，2128-2133)。
[0003]除了 DNA分子強(qiáng)的手性偶極以外，貴金屬納米粒子強(qiáng)的表面等離子體共振強(qiáng)度也是獲得強(qiáng)的圓二色手性信號的重要因素。這一方面的性能已經(jīng)在DNA的檢測中獲得應(yīng)用，如中國發(fā)明專利申請CN103487378A公開了 一種基于金納米棒聚集的圓二色光譜檢測DNA的方法:將DNA修飾的金納米棒與待檢測DNA混合進(jìn)行退火反應(yīng)；檢測圓二色光譜，當(dāng)檢測到退火后相比退火前在600-800nm波段出現(xiàn)正負(fù)對稱圓二色光譜的信號增強(qiáng)時，說明金納米棒發(fā)生聚集，待檢測DNA與金納米棒上修飾的DNA完全互補(bǔ)或者互補(bǔ)并含有粘性末端。所述方法相比于基于納米材料的紫外可見吸收光譜檢測DNA的方法，信號更強(qiáng)，檢出限低；而且檢測方法簡單，重復(fù)性好。但是，本領(lǐng)域還需要信號更強(qiáng)、靈敏度更高、檢出限更低且重復(fù)性更好的DNA檢測方法。
[0004]已有研究表明(NanoLett., 2011, 11, 5013-5019 ；Langmuir, 2012, 28, 9027-9033),與各向同性的金納米球形粒子、各向異性金納米棒相比，金納米錐具有更強(qiáng)的表面等離子體共振強(qiáng)度，這主要來源于金納米錐尖端的增強(qiáng)效應(yīng)。但是，金納米錐與DNA相互作用時產(chǎn)生等離子誘導(dǎo)的圓二色手性信號的情況目前還缺乏研究和報道，更沒有將金納米錐應(yīng)用于DNA檢測中的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)的DNA檢測方法的不足，本發(fā)明提供一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法，所述方法相比基于金納米棒聚集的圓二色光譜檢測DNA的方法信號更強(qiáng)、靈敏度更高、檢出限更低且重復(fù)性更好。
[0006]本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0007]一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法:將含有DNA修飾的金納米錐的溶液與含有待檢測DNA的溶液混合進(jìn)行退火反應(yīng)；檢測圓二色光譜，當(dāng)檢測到退火后相比退火前在550-850nm波段出現(xiàn)圓二色光譜的信號增強(qiáng)時，說明金納米錐發(fā)生聚集，待檢測DNA與金納米錐上修飾的DNA存在互補(bǔ)序列。
[0008]本發(fā)明中，所述圓二色光譜的信號強(qiáng)度與待檢測DNA的濃度呈正相關(guān)，因此通過檢測所述圓二色光譜的信號強(qiáng)度能夠定量待檢測DNA的濃度。具體地，可以通過檢測一系列梯度濃度的DNA對應(yīng)的圓二色光譜的信號強(qiáng)度，并制作出DNA濃度相對于圓二色光譜的信號強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測待檢測DNA對應(yīng)的圓二色光譜的信號強(qiáng)度，就可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待檢測DNA的濃度。
[0009]本發(fā)明中，金納米錐是通過各種制備方法得到的，但是各種制備方法制得的金納米錐并非完全具有一致性，其中還會含有金納米球和/或金納米棒。目前報道的制備金納米錐的方法中，得到的金納米錐約占30%左右。因此，所述含有DNA修飾的金納米錐的溶液中還可能含有金納米球和/或金納米棒，且所述金納米錐的摩爾百分含量以金納米錐、金納米球和/或金納米棒的總量計為30%以上，優(yōu)選50%以上，更優(yōu)選70%以上，最優(yōu)選90%以上。研究發(fā)現(xiàn)金納米錐的摩爾百分含量越高，得到的圓二色光譜的信號強(qiáng)度也越大，這是因為金納米錐相比金納米球和金納米棒具有更強(qiáng)的表面等離子體共振強(qiáng)度，能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的圓二色光譜信號。高含量的金納米錐可以通過對制備的金納米錐的初產(chǎn)物進(jìn)行密度梯度離心得到，本發(fā)明的一個實施例通過密度梯度離心制得的金納米錐的摩爾百分含量能夠達(dá)到90%以上，為圓二色光譜信號檢測DNA提供高度純化的金納米錐，為高靈敏地檢測DNA提供保障。目前還沒有通過密度梯度離心純化或富集金納米錐的報道。
[0010]本發(fā)明中，所述退火溫度范圍可以是從60-90 V任一溫度(例如60 °C、62 V、64°C、66°C、68t:、7(rC、72t:、74t:、76t:、78t:、8(rC、82t:、84t:、86t:、88t:*9(rC)降至20-50 0C 任一溫度(例如 20 °C、22°C、24 V ,26 °C >28 °C >30 °C >32 °C >34 V、36 °C、38 V、40 °C、42 V、44°C、46 V、48°C或 50°C )，優(yōu)選為從 60 V 降至 20 V。
[0011]本發(fā)明中，所述金納米錐上修飾的DNA與金納米錐的摩爾比為50-100:1，例如55:1、60:1、70:1、80:1、90:1、95:1 或 98:1，優(yōu)選為 100:1。
[0012]本發(fā)明是基于互補(bǔ)DNA退火雜交引起金納米錐聚集，從而導(dǎo)致550-850nm波段出現(xiàn)圓二色光譜的信號增強(qiáng)的現(xiàn)象，而完成的發(fā)明。因此，對于金納米錐的修飾方式不作特別限定，目前已有的任何能夠?qū)NA修飾到金納米錐上的技術(shù)，以及未來開發(fā)出來的任何能夠?qū)NA修飾到金納米錐上的技術(shù)均可以用來為本發(fā)明提供DNA修飾的金納米錐。
[0013]雖然如此，本發(fā)明還是提供了一種特別的DNA修飾的金納米錐，即巰基DNA(SH-DNA)修飾的金納米錐，所述巰基與金通過共價鍵連接將DNA修飾在金納米錐上；優(yōu)選地，所述巰基修飾在DNA的3’末端。
[0014]本發(fā)明對DNA修飾的金納米錐與待檢測DNA混合進(jìn)行退火反應(yīng)環(huán)境不作特別限定，只要能夠提供退火反應(yīng)的適宜條件即可。雖然如此，本發(fā)明還是特別提供一種退火反應(yīng)的溶液環(huán)境為含0.25M氯化鈉、0.01重量％十二烷基磺酸鈉和0.0lM的pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液。
[0015]本發(fā)明中，所述待檢測DNA的濃度為納摩爾級，優(yōu)選為5nM至40nM。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)對DNA的檢測限能夠達(dá)到納摩爾級，優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的檢測方法。
[0016]本發(fā)明中，所述金納米錐是通過對制備的金納米錐的初產(chǎn)物通過密度梯度離心得到的。所述金納米錐的初產(chǎn)物可以通過目前報道的各種方法制備，本發(fā)明不作特別限定。在本發(fā)明中，優(yōu)選種子合成法(J.Phys.Chem.B2006, 110, 16377-16383)得到金納米錐的初產(chǎn)物，具體包括以下步驟:
[0017](I)在20-25°C條件下，將檸檬酸鈉和氯金酸(HAuCl4)水溶液混合，加入新制備的硼氫化鈉(NaBH4)溶液，得到金晶種；
[0018](2)將十六烷基三乙基溴化銨(CTEAB)、HAuCl4和硝酸銀溶液混合均勻配成生長溶液，加入抗壞血酸溶液后攪拌均勻，然后加入步驟(I)中所述金晶種，在20-25°C條件下靜置生長20-24小時，得到所述金納米錐的初產(chǎn)物；
[0019]優(yōu)選地，所述步驟(I)中HAuC14、NaBH4、檸檬酸鈉和水的摩爾比為1: (1-1.5):(2-3): (400-500)；
[0020]優(yōu)選地，所述步驟(2)中HAuCl4、十六烷基三乙基溴化銨、硝酸銀、抗壞血酸和水的摩爾比為 1:(240-260):(0.13-0.16):(0.13-0.16):(1200-1250)。
[0021]在本發(fā)明中，通過調(diào)節(jié)金晶種的用量，可以得到不同等離子共振峰位的金納米錐的初產(chǎn)物。
[0022]在本發(fā)明中，所述密度梯度離心的方法，層析液可以采用不同比例的乙二醇和水的混合物配制而成，如按體積百分含量計采用五種不同的混合物:90%乙二醇+10%水，80%乙二醇+20%水，70%乙二醇+30%水，60%乙二醇+40%水，50%乙二醇+50%水；分別取這五種不同的混合物1.5ml，按乙二醇的比重降低的順序依次加入到離心管中，加入的過程要避免相互間的擾動，從而形成從上到下密度逐漸增大的層析液。也可以按體積百分含量計采用以下九種不同比例的乙二醇和水的混合物配制層析液:95%乙二醇+5%水，90%乙二醇+10%水，85%乙二醇+15%水，80%乙二醇+20%水，75%乙二醇+25%水，70%乙二醇+30%水，65%乙二醇+35%水，60%乙二醇+40%水，55%乙二醇+45%水。
[0023]優(yōu)選地，將0.2-0.5ml濃縮的金納米錐的初產(chǎn)物的溶液加入到上述預(yù)先配置好的層析液中，經(jīng)過6000-8000rpm離心15-25分鐘、優(yōu)選7500rpm離心20分鐘后，通過對分離
的產(chǎn)物進(jìn)行分層提取，最終得到高純度的金納米錐。
[0024]本發(fā)明中，對于SH-DNA修飾金納米錐的方法沒有特別的限定，只要能夠得到SH-DNA修飾的金納米錐的方法均可采用，本發(fā)明中優(yōu)選鹽熟化法修飾金納米錐，具體可以是:
[0025](I)向上述制備的高純度的金納米錐溶液中，加入SH-DNA，DNA和金納米錐的比例可以是50-100:1的任何比例，優(yōu)選為100:1 ；24小時后加入十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液和PH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，室溫靜置7天后，分批次加入NaCl溶液。
[0026]優(yōu)選地，加入的SDS與PBS緩沖液混合液的體積為330 U L/ImL金納米錐溶液，其中最終溶液中SDS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01-0.02%,磷酸緩沖液的濃度為0.01M-0.02M ;分8次加A IM的NaCl溶液，每次33 U 1，每次時間間隔為4-6小時。
[0027](2)將步驟(I)所得的修飾過DNA的金納米錐的混合液離心，去除游離的多余SH-DNA，將沉淀重新分散到下步退火所需要的緩沖液體系中，優(yōu)選為含有0.25M氯化鈉、
0.01%SDS和pH為7.4的0.0lM的磷酸鹽緩沖溶液。
[0028]本發(fā)明中，水可以為蒸餾水和/或去離子水等，所有藥品均為分析純及以上純度。
[0029]本發(fā)明中，濃度單位M表不mol/L,mM表不mmol/L, u M表不u mol/L,nM表不nmol/L0
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法信號更強(qiáng)、靈敏度更高、檢出限更低且重復(fù)性更好，不但明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的基于納米材料的紫外可見吸收光譜檢測DNA的方法，而且與報道的基于金納米棒聚集的圓二色光譜檢測DNA的方法相比，由于金納米錐可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的圓二色信號，因此在靈敏度、檢出限和重復(fù)性方面也明顯具有優(yōu)勢。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明實施例1中得到的不同等離子共振峰位的金納米錐的紫外可見光譜圖。
[0032]圖2為本發(fā)明實施例1中得到的不同等離子共振峰位的金納米錐的掃描電子顯微鏡圖。
[0033]圖3為本發(fā)明實施例2中經(jīng)過密度梯度離心后的溶液分層照片(A)和每層對應(yīng)的掃描電鏡照片，其中(B)為金納米棒，(C)為金納米錐，(D)為金納米球。
[0034]圖4為本發(fā)明實施例2中經(jīng)過純化后的金納米錐和對應(yīng)的金納米錐的初產(chǎn)物的紫外可見光譜圖。
[0035]圖5為本發(fā)明實施例4中加入待檢測DNA鏈段B后的金納米錐溶液在60°C和20°C下的紫外可見光譜圖和CD光譜圖。
[0036]圖6為本發(fā)明實施例4中不同濃度下的DNA的圓二色光譜圖。
[0037]圖7為本發(fā)明實施例4中DNA的濃度和對應(yīng)的圓二色信號的線性關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0038]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，以下實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，以便于更好地理解本發(fā)明，因而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。
[0039]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑廠商購買得到的。
[0040]以下實施例中離心采用臺式高速離心機(jī)(XiangYi H-1650)和Hitachi CP80MX ；掃描電鏡圖采用冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Hitachi S-4800)得到；紫外可見吸收光譜采用紫外可見光譜儀(Hitachi U-3010)得到；圓二色光譜采用圓二色光譜儀(JascoJ-810spectropoIarimeter)得到。
[0041]實施例1:金納米錐的合成
[0042]金納米錐的合成是通過種子生長法實現(xiàn)的。將0.15mL10mM的新鮮配制的NaBH4溶液迅速加入到IOmL含有0.25mM檸檬酸鈉和0.125mM HAuCl4的混合液中，攪拌2分鐘后，置于23°C恒溫水浴靜置，2小時后備用。
[0043]向IOmL 含有 0.1M CTEAB、0.4mM HAuC14、0.06mM 抗壞血酸和 0.06mM 硝酸銀的混合液中加入不同量的上述步驟中合成的晶種，加入的晶種的量依次為a:0.24ml,b:0.16ml,c:0.12ml, d:0.09ml，e:0.06ml和f:0.05ml。靜置24小時后，將所得產(chǎn)物離心，重新分散至二次水中備用。將所得的金納米錐用紫外可見光譜(圖1)和掃描電子顯微鏡(圖2)表征。如圖1所示，隨著加入晶種的量的不同，金納米錐的等離子共振峰的峰位從690nm左右紅移至860nm左右。圖2顯示的是對應(yīng)于紫外可見光譜上不同峰位的金納米錐的掃描電鏡圖片。從圖中可以看出合成的金納米錐的初產(chǎn)物是金納米錐、金納米球和金納米棒的混合物。
[0044]實施例2:金納米錐的純化[0045]高純度的金納米錐是通過對實施例1中的金納米錐的初產(chǎn)物進(jìn)行密度梯度離心分離得到的。具體方法如下:
[0046]采用以下5種不同體積比例的乙二醇和水的混合物配制層析液:90%乙二醇+10%水，80%乙二醇+20%水，70%乙二醇+30%水，60%乙二醇+40%水，50%乙二醇+50%水。分別取這5種不同的混合物1.5ml，按乙二醇的比重降低的順序依次加入到離心管中，加入的過程要避免相互間的擾動，從而形成從上到下密度逐漸增大的層析液。最后向其加入0.3mL濃縮的實施例1中合成的金納米錐的初產(chǎn)物溶液(濃縮比例為13:l)，7500rpm離心20分鐘后，得到明顯分層的溶液(如圖3A所示)，從上到下依次對應(yīng)于LI層、L2層和L3層。其對應(yīng)的掃描電鏡圖片如圖3B、C和D所示，分別為金納米棒、金納米錐和金納米球。如圖3C所示，相對于初產(chǎn)物的純度(30%左右，如圖2所示，通過統(tǒng)計掃描電鏡圖片中金納米錐所占比例得到)，分離后金納米錐純度可高達(dá)90%，這為下一步圓二色信號檢測DNA提供了高度純化的納米粒子，為接下來的高靈敏檢測提供了保障。
[0047]采用紫外可見光譜對比密度梯度離心分離前后的樣品。圖4是分離前后的紫外可見光譜圖。從圖中可以看到，經(jīng)過純化后的金納米錐在520-550nm左右的吸收峰強(qiáng)度明顯下降，證明原始初產(chǎn)物中的金納米球和金納米棒得到了很好的去除。這一結(jié)果與圖3對應(yīng)的掃描電子顯微鏡圖片的結(jié)果相一致。
[0048]實施例3:金納米錐的DNA修飾
[0049]Iml純化的金納米錐溶液，濃度為0.7nM，向其加入加入74 ii L濃度為100 ii M的DNA 鏈段 A (5，-AAGAAITTATAAGCAGAAAAAAAAAAAA-3’ -SH, SEQ ID NO:1，在序列的 3’ 末端修飾巰基)。靜置24小時后，加入155 u L0.1%SDS (十二烷基磺酸鈉)溶液和155 u L0.1M的pH=7.4的磷酸緩沖溶液，在室溫下存放7天后，向其中加入IM NaCl溶液，每次加入32.5 ii L，共8次，時間間隔為4h。
[0050]將上述經(jīng)過鹽熟化后的金納米錐和DNA的混合液離心兩次(離心條件為8000rpm，離心10分鐘)，分散在含0.25M氯化鈉(NaCl )、0.01%十二烷基磺酸鈉(SDS)和0.0lM的pH為7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中備用。
[0051]實施例4 =DNA的圓二色信號檢測
[0052]取0.4mL實施例3中經(jīng)過DNA修飾的金納米錐的溶液，加入1.6mL含有0.25MNaCU0.01%SDS的0.0lM pH=7.4的PBS緩沖溶液。將0.8 y L濃度為100 u M的與鏈段A互補(bǔ)的 DNA 鏈段 B (5，-TTTTTTTTTTTTCTGCTTATAAA ITCTTGCGC-3’，SEQ ID NO:2)，混合均勻后將上述溶液將加熱至60°C然后退火至20°C，從而形成穩(wěn)定的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，與此同時，測試溶液的紫外可見吸收光譜和CD光譜。圖5顯示的是加入待檢測DNA鏈段B后的金納米錐溶液在60°C和20°C下的紫外可見光譜圖和⑶光譜圖。如圖5A所示，在加入DNA鏈段B后，經(jīng)過60°C退火，金納米錐在550nm-850nm區(qū)間出現(xiàn)正負(fù)相反的圓二色信號，信號強(qiáng)度可達(dá)6左右。在對應(yīng)的波段，金納米錐的吸收強(qiáng)度發(fā)生降低(圖5B)，說明金納米錐發(fā)生聚集。相對于紫外可見吸收光譜的變化(由0.6到0.4)，圓二色信號的變化要明顯得多(由0.5到
5.8)，說明基于圓二色信號變化的檢測方法比傳統(tǒng)的自外可見光譜檢測方法具有更高的靈敏度。并且經(jīng)過5次以上的循環(huán)退火，圓二色信號保持不變，說明該方法具有很好的重復(fù)性。與中國發(fā)明專利申請CN103487378A的實施例1得到的結(jié)果相比，在所用DNA序列相同而本實施例采用金納米錐、CN103487378A的實施例1采用金納米棒的情況下，本實施例中金納米錐和待檢測DNA的用量更少，但是其圓二色信號強(qiáng)度可達(dá)6左右；而CN103487378A的實施例1中圓二色信號強(qiáng)度只能達(dá)到2.5。說明本發(fā)明采用金納米錐的圓二色信號更強(qiáng)、靈敏度更高。
[0053]針對上述的檢測條件，可以調(diào)節(jié)加入的待檢測DNA鏈段B的濃度。如圖6所示，隨著DNA鏈段B濃度的逐漸降低，由40nM到5nM，退火后對應(yīng)的圓二色信號強(qiáng)度也由5.8下降至1.0左右。如圖7所示，以DNA的濃度作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的圓二色信號的強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)作圖，可以發(fā)現(xiàn)二者存在很好的線性相關(guān)的關(guān)系。
[0054]綜上所述，本發(fā)明提供了一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法。與傳統(tǒng)的DNA的檢測方法相比，基于金納米錐聚集的圓二色信號更強(qiáng)，具有更高的靈敏度和重復(fù)性，可以用來作為DNA的定量分析測試。
[0055] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及詳細(xì)方法才能實施。所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明選用組分的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于金納米錐聚集的圓二色信號檢測DNA的方法，其特征在于，所述方法為:將含有DNA修飾的金納米錐的溶液與含有待檢測DNA的溶液混合進(jìn)行退火反應(yīng)；檢測圓二色光譜，當(dāng)檢測到退火后相比退火前在550-850nm波段出現(xiàn)圓二色光譜的信號增強(qiáng)時，說明金納米錐發(fā)生聚集，待檢測DNA與金納米錐上修飾的DNA存在互補(bǔ)序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述圓二色光譜的信號強(qiáng)度與待檢測DNA的濃度呈正相關(guān)，通過檢測所述圓二色光譜的信號強(qiáng)度定量待檢測DNA的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述含有DNA修飾的金納米錐的溶液中還含有金納米球和/或金納米棒，且所述金納米錐的摩爾百分含量以金納米錐、金納米球和/或金納米棒的總量計為30%以上，優(yōu)選50%以上，更優(yōu)選70%以上，最優(yōu)選90%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述退火溫度范圍為從60-90°C任一溫度降至20-50°C任一溫度，優(yōu)選為從60°C降至20°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述金納米錐上修飾的DNA與金納米錐的摩爾比為50-100:1，優(yōu)選為100:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于，所述DNA修飾的金納米錐是巰基DNA修飾的金納米錐，所述巰基與金通過共價鍵連接將DNA修飾在金納米錐上； 優(yōu)選地，所述巰基修飾在DNA的3’末端。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，退火過程中所用的緩沖液體系為含0.25M氯化鈉、0.01重量％十二烷基磺酸鈉和0.0lM的pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，所述待檢測DNA的濃度為納摩爾級，優(yōu)選為5nM至40nM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其特征在于，所述金納米錐是通過對制備的金納米錐的初產(chǎn)物進(jìn)行密度梯度離心得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述金納米錐的初產(chǎn)物是通過如下方法制備得到的: (1)在20-25°C條件下，將檸檬酸鈉和HAuCl4水溶液混合，加入新制備的NaBH4溶液，得到金晶種； (2)將十六烷基三乙基溴化銨、HAuCl4和硝酸銀溶液混合均勻配成生長溶液，加入抗壞血酸溶液后攪拌均勻，然后加入步驟(I)中所述金晶種，在20-25°C條件下靜置生長20-24小時，得到所述金納米錐的初產(chǎn)物； 優(yōu)選地，所述步驟(I沖HAuCl4、NaBH4、檸檬酸鈉和水的摩爾比為1: (1-1.5): (2-3):(400-500)； 優(yōu)選地，所述步驟(2)中HAuCl4、十六烷基三乙基溴化銨、硝酸銀、抗壞血酸和水的摩爾比為 1:(240-260):(0.13-0.16):(0.13-0.16):(1200-1250)。
【文檔編號】G01N21/19GK103776772SQ201410051038
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】劉文靚, 朱哲凝, 高燕, 唐智勇 申請人:國家納米科學(xué)中心