Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用。該Sirt-1蛋白可作為骨肉瘤診斷的標(biāo)記分子，提高骨肉瘤診斷和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性。用免疫檢測診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括：與Sirt-1蛋白特異性結(jié)合的抗體。診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品。Sirt-1蛋白可作為診斷和預(yù)測轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)志蛋白，使骨肉瘤診斷更加準(zhǔn)確、快速。
【專利說明】Si rt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一個蛋白的應(yīng)用，尤其涉及Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤是最常見的惡性成骨性腫瘤之一，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)該病好發(fā)于15-25歲的青少年，且男性發(fā)病率高于女性。骨肉瘤好發(fā)部位是長管狀骨的干骺端，該腫瘤惡性程度高，預(yù)后極差，單純截肢后患者的5年生存率低于20 %，此外該腫瘤的另一個顯著特點是肺部轉(zhuǎn)移早，在臨床做出骨肉瘤診斷時，其中大部分已經(jīng)發(fā)生肺的微小轉(zhuǎn)移。因此，有效診斷骨肉瘤，特別是研發(fā)預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的技術(shù)是目前骨腫瘤研究中的重點和難點。
[0003]目前，越來越多的研究表明Sirtl與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在很多腫瘤中，Sirtl的表達(dá)水平會明顯增高，且Sirtl常集中于一些異常沉默的抑癌基因(這些基因的DNA被過度甲基化)的啟動子上。文獻(xiàn)報道在乳腺癌和結(jié)腸癌中，對Sirtl的抑制增加了內(nèi)源性啟動子中H4-K16和H3-K7的乙?；饔茫梢詽M足基因重復(fù)表達(dá)的條件。Sirtl通過對組蛋白的H1-K26的脫乙?；饔煤痛龠M(jìn)H3K9me2的丟失來調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的構(gòu)成。Sirtl與SUV39H1直接結(jié)合并脫去其乙酰基，促進(jìn)SUV39H1的活性進(jìn)而引起H3K9me3修飾水平的增加。此外，Sirtl也可以將很多非組蛋白去乙?；?，比如可以對p53進(jìn)行去乙酰化，負(fù)向調(diào)節(jié)p53的功能；Sirtl還可以對DNA修復(fù)蛋白Ku70、FOXO家族蛋白、NF_kB等進(jìn)行調(diào)控。盡管Sirtl的生物學(xué)功能已被逐步探明，但目前尚無文獻(xiàn)報道Sirtl與骨肉瘤的相關(guān)性研究，更未見Sirtl表達(dá)與骨肉瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供Sirt-1蛋白的一種新應(yīng)用，該Sirt-1蛋白可作為骨肉瘤診斷的標(biāo)記分子，提高骨肉瘤診斷和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性。
[0005]所述的Sirt-1蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
所述診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品。
[0007]在本發(fā)明中，所述用免疫檢測診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:與Sirt-1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
[0008]所述用RT-PCR診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴(kuò)增Sirt-1 基因的引物:正向引物:5’-AGCTGATGAACCGCTTGCTA-3’ ;
反向引物:5’-CCCAAATCCAGCTCCTCCAG-3’。
[0009]所述用實時定量PCR診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴(kuò)增Sirt-1基因的引物:正向引物:5’ -AACAGGTTGCGGGAATCCAA-3’ ;反向引物:5’ -GTTCATCAGCTGGGCACCTA-3’。[0010]所述用原位雜交診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:與Sirt-1基因的核酸序列雜交的探針:5' -CATTTTCCATGGCGCTGAGG-3'。
[0011]所述用基因芯片診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:與Sirt-1基因的核酸序列雜交的探針:5’-TTGCAACAGCATCTTGCCTG-3’。
[0012]在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對Sirt-1蛋白特異的抗體。例如，將純化的人Sirt-1蛋白或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人Sirt-1蛋白或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑Sirt-1功能的抗體,也可以是不影響人Sirt-1蛋白功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人Sirt-1蛋白的片斷或功能域致免疫而產(chǎn)生,而人Sirt-1蛋白產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的Sirt-1蛋白結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化Sirt-1蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
[0013]在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要能夠完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可以短至25、20、15或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0014]本發(fā)明實驗證明Sirt-1蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；而在原代骨肉瘤細(xì)胞中Sirt-1蛋白與其侵襲運動能力呈正相關(guān)。因此，Sirt-1蛋白可作為診斷和預(yù)測轉(zhuǎn)移的特異性標(biāo)志蛋白，使骨肉瘤診斷更加準(zhǔn)確、快速。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明通過免疫組化法驗證Sirt-1在人骨肉瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)圖；
圖2為本發(fā)明通過免疫組化法檢測骨肉瘤中Sirt-1蛋白水平；
圖3為表達(dá)不同程度Sirt-1蛋白的原代骨肉瘤細(xì)胞在體外的侵襲運動能力。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0017]以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0018]下面實施例所用的Sirt-1蛋白的氨基酸序列，如SEQ ID N0.1所示。
[0019]實施例1:
選取骨肉瘤臨床樣本以及癌旁組織33對，用10%甲醛溶液固定7天，隨后制備石蠟包埋的組織塊。將樣本制備厚度為8微米的石蠟切片，并采用免疫組化法檢測Sirt-1蛋白的表達(dá)情況，在正置顯微鏡下觀察Sirt-1蛋白的表達(dá)情況。如圖1所示，癌組織中Sirt-1蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁組織。對這33對骨肉瘤臨床樣本以及癌旁組織中Sirt-1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)癌組織中強陽性為15例，陽性為14例，弱陽性為3例，陰性為I例；而在癌旁組織中強陽性為I例，陽性為3例，弱陽性為11例，陰性為18例(圖2)。
[0020]實施例2:
對前述實施例1中的33例骨肉瘤進(jìn)行3年回顧性調(diào)研，其中有22例有詳細(xì)的隨訪記錄，故在這22例樣本中分析Sirt-1蛋白表達(dá)與骨肉瘤病人預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sirt-1表達(dá)越強，骨肉瘤病人的轉(zhuǎn)移率越高(表1)。
[0021]表1骨肉瘤中Sirt-1蛋白水平與肺轉(zhuǎn)移及3年生存率的相關(guān)性
【權(quán)利要求】
1.Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于Sirt-1蛋白作為標(biāo)記分子。
2.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于Sirt-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品。
4.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于用免疫檢測診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括:與Sirt-1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于用RT-PCR診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴(kuò)增Sirt-1基因的引物:正向引物:5 ‘-AGCTGATGAACCGCTTGCTA-3，，如SEQ ID N0.2所示；反向引物:5 ‘-CCCAAATCCAGCTCCTCCAG-3，，如 SEQ ID N0.3 所示。
6.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于用實時定量PCR診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴(kuò)增Sirt-1基因的引物:正向引物:5 ‘-AACAGGTTGCGGGAATCCAA-3，，如SEQ ID N0.4所示；反向引物:5 ‘-GTTCATCAGCTGGGCACCTA-3 ’，如 SEQ ID N0.5 所示。
7.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于用原位雜交診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括--與Sirt-1基因的核酸序列雜交的探針:5 ‘-CATTTTCCATGGCGCTGAGG-3 ’，如 SEQ ID N0.6 所示。
8.如權(quán)利要求1所述的Sirt-1蛋白在診斷、預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)品的應(yīng)用，其特征在于用基因芯片診斷骨肉瘤和預(yù)測骨肉瘤轉(zhuǎn)移的產(chǎn)品包括--與Sirt-1基因的核酸序列雜交的探針:5 ‘-TTGCAACAGCATCTTGCC`TG-3 ’，如 SEQ ID N0.7 所示。
【文檔編號】G01N33/574GK103837679SQ201410057837
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月20日
【發(fā)明者】張寧, 葉招明, 應(yīng)美丹, 曹戟, 王強, 劉兵 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院