一種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，該方法是取豬毛，將豬毛用有機(jī)溶劑洗滌后晾干，將晾干后的豬毛放入裝有有機(jī)溶劑的離心管中，并在轉(zhuǎn)動(dòng)器上旋轉(zhuǎn)；經(jīng)上述處理后將離心管放入離心機(jī)中離心，收集上層清夜；將所述上清液用氮?dú)饬鳚饪s吹干，吹干后用PBS溶液溶解，采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定溶液中皮質(zhì)醇含量，該方法是一種對(duì)豬非侵害性，無應(yīng)激的檢測(cè)其生理狀態(tài)的手段，簡(jiǎn)單易行，成本低，對(duì)于監(jiān)測(cè)豬健康福利狀況具有十分積極的作用。
【專利說明】一種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是一個(gè)養(yǎng)豬大國，但是養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期以來對(duì)“快速”和“高產(chǎn)”的盲目追求帶來一系列嚴(yán)重的環(huán)境和社會(huì)問題，如養(yǎng)殖環(huán)境惡化、環(huán)境污染嚴(yán)重、畜禽流行病頻發(fā)，這不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且危及人類的健康。在不規(guī)范的養(yǎng)殖或高強(qiáng)度的集約化養(yǎng)殖模式下，豬經(jīng)常受到各種應(yīng)激(斷奶、混群、閹割、運(yùn)輸?shù)?，長(zhǎng)期的應(yīng)激最終使得豬免疫力和抵抗力下降。經(jīng)常依賴添加過量的抗生素和各種疫苗來維持動(dòng)物健康或者生命，不但嚴(yán)重影響豬自身健康，而且使得豬肉食品的質(zhì)量和安全得不到保障，從而威脅人類健康，使我國的畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展受到嚴(yán)重的影響。
[0003]動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的最主要特征是下丘腦-垂體-腎上腺軸
(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis)活性增加。HPA 軸興奮的終端產(chǎn)物是糖皮質(zhì)激素。應(yīng)激時(shí)，迅速升高的糖皮質(zhì)激素有助于機(jī)體動(dòng)員能量，應(yīng)對(duì)應(yīng)激環(huán)境，對(duì)動(dòng)物的生存有重要意義。但一旦應(yīng)激源長(zhǎng)時(shí)間存在，HPA軸持續(xù)興奮，血液中的糖皮質(zhì)激素水平一直保持在高水平，就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生負(fù)面作用，使生長(zhǎng)受阻，免疫力下降。
[0004]目前判斷豬應(yīng)激的方法主要是通過檢測(cè)其血液中的皮質(zhì)醇。該方法在采集血液過程中需要將豬進(jìn)行保定，采集過程較為困難，同時(shí)保定又給豬帶來了新的應(yīng)激，使測(cè)定結(jié)果難以給出準(zhǔn)確的判斷。因此，目前畜牧業(yè)生產(chǎn)上迫切需要一種簡(jiǎn)單、易行，對(duì)豬應(yīng)激較小的，且能夠反映豬皮質(zhì)醇水平的方法。近年來的人類醫(yī)學(xué)研究表明，毛發(fā)中含有皮質(zhì)醇，并且可以反映應(yīng)激狀況。但是在豬上，由于其毛發(fā)特性與人類的差異，毛發(fā)粗硬，附有油脂以及其他雜物，使得其處理過程等比較復(fù)雜，并且由于種間的差異豬毛中皮質(zhì)醇含量與人類也不相同，目前關(guān)于豬毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的測(cè)定尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問題提供一種從豬毛中提取和測(cè)定皮質(zhì)醇的方法，該方法是一種非侵害性，無應(yīng)激的檢測(cè)手段，簡(jiǎn)單易行，成本低，對(duì)于監(jiān)測(cè)豬健康福利狀況具有十分積極的作用。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]—種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，該方法包括以下步驟:
[0008]I)取豬毛，用有機(jī)溶劑洗滌后晾干；
[0009]2)將晾干后的豬毛和有機(jī)溶劑混合，得到混合物；
[0010]3)將所述的混合物360°旋轉(zhuǎn)后，放入離心機(jī)中離心，收集上層清夜；
[0011]4)將所述的上層清液用氮?dú)饬鳚饪s吹干，吹干后用PBS溶液溶解，溶解后采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定皮質(zhì)醇含量。
[0012]步驟I)中所述豬毛的長(zhǎng)度為0.8?1.2mm。步驟I)中所述洗滌的次數(shù)為3次。[0013]步驟I)中所述有機(jī)溶劑為無水甲醇，步驟2)中所述的有機(jī)溶劑為無水甲醇。
[0014]步驟2)中豬毛與有機(jī)溶劑的質(zhì)量比為1:3.5?4.5。
[0015]步驟3)中所述的360°旋轉(zhuǎn)是在轉(zhuǎn)動(dòng)器中進(jìn)行，旋轉(zhuǎn)的速度為28?32rpm，旋轉(zhuǎn)的時(shí)間為22?24h。
[0016]步驟3)中所述離心是以轉(zhuǎn)速為4500rpm的速度轉(zhuǎn)動(dòng)12?18分鐘,所述步驟3)中的離心是在溫度為20°C的條件下進(jìn)行。
[0017]所述步驟4)中PBS溶液的ΡΗ=7.4，濃度為0.lmol/L。
[0018]本發(fā)明的有益效果
[0019]隨著動(dòng)物福利問題受到越來越廣泛的關(guān)注，采集豬的毛發(fā)，并進(jìn)行皮質(zhì)醇的提取和檢測(cè)，是一種對(duì)豬非侵害性，無應(yīng)激的檢測(cè)手段，簡(jiǎn)單易行，成本低，對(duì)于監(jiān)測(cè)豬健康福利狀況具有十分積極的作用。皮質(zhì)醇是反映機(jī)體應(yīng)激狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)，目前反映豬的皮質(zhì)醇水平都是通過檢測(cè)其血液中皮質(zhì)醇含量，以往的研究表明中國地方豬種太湖豬血液皮質(zhì)醇含量顯著高于外來豬品種(78.29±6.89vs47.88±4.73，P〈0.05)，利用本方法我們檢測(cè)了豬毛發(fā)中皮質(zhì)醇，其結(jié)果與血液結(jié)論一致，表明用該方法檢測(cè)可以基本反映動(dòng)物機(jī)體的皮質(zhì)醇水平。另一方面采集豬血液需要將豬進(jìn)行固定，采集過程中豬會(huì)盡力反抗，給豬造成較大的應(yīng)激，也使得檢測(cè)值易出現(xiàn)較大的波動(dòng)，而采集豬毛發(fā)對(duì)其沒有應(yīng)激，樣本采集方便，這無疑給豬健康福利狀況的監(jiān)測(cè)提供了極大的幫助。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此:
[0021]本發(fā)明技術(shù)方案中采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定溶液中皮質(zhì)醇含量參照Vaccinationinhibits TLR2transcription via suppression of GR nuclear translocationand binding to TLR2promoter in porcine lung infected with Mycoplasmahyopneumoniae[J].Veterinary Microbiology, 2013, 167(3-4):425-433。
[0022]儀器:I125放射免疫試劑盒測(cè)定溶液中皮質(zhì)醇含量n0.DlOPZB，Beijing NorthInstitute of Biological Technology (北京北方生物技術(shù)研究所)，China.[0023]旋轉(zhuǎn)器的型號(hào):H5100-230Vser.N0.: 11090975,廠家:Labnetinternational, Inc.[0024]實(shí)施例1
[0025]I)選取體重，年齡相當(dāng)?shù)奶i和長(zhǎng)白豬，各5頭，分別采集頸部相同部位的豬毛，豬毛的長(zhǎng)度為0.8?1.2mm ;各取200mg豬毛,用IOml無水甲醇洗漆3遍,每遍不超過3分鐘，可在振蕩器上振蕩洗滌；
[0026]2)將洗滌后的豬毛晾干，并與Iml無水甲醇混合，得到混合物；
[0027]3)將所述的混合物在轉(zhuǎn)速為30rpm的轉(zhuǎn)動(dòng)器上360°旋轉(zhuǎn)24h，之后在溫度為20°C的條件下放入離心機(jī)，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為4500rpm/min，離心15分鐘后收集上層清夜；
[0028]4)將收集的上層清夜用氮?dú)饬鳚饪s吹干后，用PBS溶液溶解(PH=7.4,0.1M)，體積為150ul，采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定溶液中皮質(zhì)醇含量，
[0029]具體測(cè)定步驟如下:
[0030]1.根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，將O標(biāo)準(zhǔn)用Iml蒸餾水溶解，其余標(biāo)準(zhǔn)分別加入0.5ml蒸餾水溶解。溶解15分鐘后搖勻方可使用。溶解后其濃度分別為O，10，50，100，200，500ng/ml，分別標(biāo)記為S0, SI, S2, S3, S4, S5。另取50 μ I SO標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記為NSB管。
[0031]2.NSB管，各稀釋完成的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品上樣量都為50μ 1，依次加入100 μ II125-Cor.標(biāo)記物。
[0032]3.往NSB管中單獨(dú)加入100 μ I蒸餾水，其他管都加入100 μ I兔抗-Cor.抗體。
[0033]4.搖勻，37°C溫育45分鐘。
[0034]5.各個(gè)管中再依次加入500 μ I驢抗兔免疫分離劑,充分搖勻后，室溫放置15分鐘，3500rpm/min,4°C離心15分鐘,吸棄上清,測(cè)各沉淀管的放射性計(jì)數(shù)(cpm)。
[0035]計(jì)算公式:設(shè)SO管為B0,各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計(jì)數(shù)為B,非特異管計(jì)數(shù)為NSB,
[0036]B/BO=(B-NSB)/(BO-NSB)X100%
[0037]再取1git計(jì)算:
[0038]Logit=In[(B/BO)/(1-B/B0)]
[0039]以標(biāo)準(zhǔn)濃度取log值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的1git值為縱坐標(biāo)作圖。
[0040]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果如表1，其中，毛發(fā)皮質(zhì)醇含量為平均值。
[0041]表1為不同品種豬的毛發(fā)皮質(zhì)醇含量測(cè)定
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，該方法包括以下步驟: 1)取豬毛，用有機(jī)溶劑洗滌后晾干； 2)將晾干后的豬毛和有機(jī)溶劑混合，得到混合物； 3)將所述的混合物360°旋轉(zhuǎn)后，離心并收集上層清夜； 4)將所述的上層清液用氮?dú)饬鳚饪s吹干，吹干后用PBS溶液溶解，溶解后采用放射免疫測(cè)定法測(cè)定皮質(zhì)醇含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:步驟I)中所述豬毛的長(zhǎng)度為0.8?1.2mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:步驟I)中所述有機(jī)溶劑為無水甲醇，步驟2)中所述的有機(jī)溶劑為無水甲醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:所述步驟O中洗滌的次數(shù)為3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:步驟2)中豬毛與有機(jī)溶劑的質(zhì)量比為1:3.5?4.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:步驟3)中所述的360°旋轉(zhuǎn)是在轉(zhuǎn)動(dòng)器中進(jìn)行，旋轉(zhuǎn)的速度為28?32rpm，旋轉(zhuǎn)的時(shí)間為22?24h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:步驟3)中所述的離心是以轉(zhuǎn)速為4500rpm的速度轉(zhuǎn)動(dòng)12?18分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:所述步驟3)中的離心是在溫度為20°C的條件下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從豬毛中提取和檢測(cè)皮質(zhì)醇的方法，其特征在于:所述步驟4)中PBS溶液的PH=7.4，濃度為0.lmol/L。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103776997SQ201410064922
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月26日
【發(fā)明者】楊曉靜, 黃燕平, 馬文強(qiáng), 趙茹茜 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)