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豬霍亂沙門(mén)氏菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法

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豬霍亂沙門(mén)氏菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。所述的試劑盒含有兩株能特異性地結(jié)合于豬霍亂沙門(mén)氏菌的單克隆抗體,一株為專(zhuān)門(mén)作為捕捉抗體的單克隆抗體Mab05-F10,另一株是作為檢測(cè)抗體的單克隆抗體Mab05-D10。大量測(cè)試證實(shí),本發(fā)明的試劑盒可特異、高效地檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌,但和其它77種常見(jiàn)病原細(xì)菌無(wú)交叉反應(yīng),是一種性能極好的病原細(xì)菌檢測(cè)產(chǎn)品。
【專(zhuān)利說(shuō)明】豬霍亂沙門(mén)氏菌酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學(xué)領(lǐng)域,具體涉及一種檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]豬霍亂沙門(mén)氏菌(Shigella boydii)屬于志賀氏菌C群,是一種重要的食源性致病菌,可通過(guò)受污染的肉、蛋、魚(yú)及其制品等動(dòng)物性產(chǎn)品,瓜子仁等進(jìn)入人體,引起發(fā)熱、腹痛、里急后重,有時(shí)表現(xiàn)為全身中毒癥狀為中毒性痢疾,治療不徹底轉(zhuǎn)為慢性。
[0003]目前豬霍亂沙門(mén)氏菌的檢測(cè)主要依賴于國(guó)標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定,其缺點(diǎn)是操作繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng),無(wú)法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測(cè)是近年來(lái)出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的快速檢測(cè)手段,但國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)可運(yùn)用于檢測(cè)實(shí)踐的快速檢測(cè)產(chǎn)品,該專(zhuān)利以豬霍亂沙門(mén)氏菌為檢測(cè)靶標(biāo),所要求保護(hù)的技術(shù)涉及豬霍亂沙門(mén)氏菌快速檢測(cè)產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的試劑盒。
[0005]進(jìn)而,本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒,所述的試劑盒含有:
[0006](a)固相載體,所述的固相載體上包被有作為捕捉抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F10,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F10由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10, CGMCC N0.7712 產(chǎn)生;
[0007](b)容器a,所述的容器a中裝有作為檢測(cè)抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10, CGMCC N0.7710 產(chǎn)生。
[0008]在一優(yōu)選例中,所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0009]在另一優(yōu)選例中,所述的檢測(cè)抗體帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
[0010]在另一優(yōu)選例中,所述的可檢測(cè)的標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶。
[0011]在另一優(yōu)選例中,所述的試劑盒還含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0012]在另一優(yōu)選例中,所述的陽(yáng)性對(duì)照為滅活的豬霍亂沙門(mén)氏菌菌液,所述的陰性對(duì)照為滅菌的緩沖蛋白胨水。
[0013]本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過(guò)下文以及權(quán)利要求的描述,本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1本發(fā)明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0015]Lanel:Mab05_D10, Lane2:Mab05_F10【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明人的研究表明,以豬霍亂沙門(mén)氏菌作為免疫原,免疫Balb/c小鼠,分離純化得到兩株抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體,即Mab05-F10,保藏號(hào)CGMCC N0.7712和Mab05-D10,保藏號(hào)CGMCC N0.7710,上述兩株單克隆抗體的抗體效價(jià)可達(dá)到1:100000,其能夠特異性、高效地與豬霍亂沙門(mén)氏菌結(jié)合。以上述單克隆抗體Mab05-F10包被酶標(biāo)反應(yīng)板作為捕捉抗體,用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的上述單克隆抗體Mab05-D10作為檢測(cè)抗體,制作酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。結(jié)果顯示,上述豬霍亂沙門(mén)氏菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度達(dá)到IO5Cfu/ml,具有重復(fù)性、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn),孔間誤差小于5%,板內(nèi)CV小于3%。其與單增李斯特、鼠傷寒沙門(mén)、腸炎沙門(mén)、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、出血性大腸桿菌0157: H7、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計(jì)77種病原細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng)。
[0017]在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明人進(jìn)而根據(jù)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法,經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)試,終于獲得了一種可快速、高效檢測(cè)食源性豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0018]抗體
[0019]本發(fā)明包括兩株抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體。本發(fā)明的兩株抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10 (CGMCC N0.7712)和小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10 (CGMCC N0.7710)分別分泌產(chǎn)生。
[0020]本發(fā)明包括具有抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05_F10和Mab05_D10的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體,以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物。具體地,本發(fā)明包括具有含超變區(qū)(互補(bǔ)決定區(qū),CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物(即免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物),只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性,較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知,免疫偶聯(lián)物及融合表達(dá)產(chǎn)物包括:藥物、毒素、細(xì)胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)記物或抗原。
[0021]對(duì)于本發(fā)明的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列,可以用常規(guī)方法測(cè)定。抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydetermining region,⑶R)特別令人感興趣,因?yàn)樗鼈冎兄辽俨糠稚婕敖Y(jié)合抗原。因此,本發(fā)明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子,只要其CDR與抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體,還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab或(Fab ‘)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈。
[0022]本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規(guī)技術(shù),利用小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10 (CGMCC N0.7712)和Mab05_D10 (CGMCCN0.7710)獲得。此外,還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起,形成單鏈抗體。
[0023]一旦獲得了有關(guān)的序列,就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0024]此外,還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列,尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常,通過(guò)先合成多個(gè)小片段,然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0025]目前,已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外,還可通過(guò)化學(xué)合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。
[0026]本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞,以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0027]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞,如細(xì)菌細(xì)胞;或是低等真核細(xì)胞,如酵母細(xì)胞;或是高等真核細(xì)胞,如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0028]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如出血性大腸桿菌時(shí),能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲,用CaClJi處理,所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要,轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物,可運(yùn)用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法,常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔,脂質(zhì)體包裝等。
[0029]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng),表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞,培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后,用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子,將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0030]在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要,可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0031]本發(fā)明的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05_D10和Mab05_F10,其效價(jià)高(可以達(dá)到1:100000),能夠特異性地、高效地檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌,與單增李斯特、鼠傷寒沙門(mén)、腸炎沙門(mén)、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、出血性大腸桿菌0157: H7、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計(jì)77種病原細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng),此為本發(fā)明的最大創(chuàng)新點(diǎn)。上述單克隆抗體Mab05-D10可以用辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶、納米金顆粒標(biāo)記,專(zhuān)一性地作為檢測(cè)抗體使用。上述單克隆抗體Mab05-F10在各種檢測(cè)運(yùn)用中,可專(zhuān)一性地作為捕捉抗體使用。
[0032]檢測(cè)試劑盒
[0033]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究和試驗(yàn),意外地發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10 (CGMCC N0.7712)所產(chǎn)生的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體作為捕捉抗體捕獲豬霍亂沙門(mén)氏菌后,再用可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記的由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10 (CGMCCN0.7710)所產(chǎn)生的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體作為檢測(cè)抗體,可以極其有效地結(jié)合于豬霍亂沙門(mén)氏菌,從而通過(guò)雙抗夾心法高靈敏度地檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌。
[0034]如本文所用,所述的“樣品”是指食品、人畜糞便、嘔吐物等物質(zhì),包括但不限于:血清、血漿、糞便、食品等的增菌液。優(yōu)選的,所述的樣品是食品。
[0035]如本文所用,所述的“捕捉抗體”、“包被抗體”、“第一抗體”與“一抗”可互換使用,都是指所述的可特異性地結(jié)合于豬霍亂沙門(mén)氏菌的單克隆抗體,其由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10 (CGMCC N0.7712)產(chǎn)生。[0036]所述的捕捉抗體可被包被在固相載體上。本發(fā)明對(duì)所采用的固相載體沒(méi)有特別的限制,只要其能夠與捕捉抗體相偶聯(lián)(連接)即可。例如,所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
[0037]如本文所用,所述的“檢測(cè)抗體”、“第二抗體”、“酶標(biāo)抗體”與“二抗”可互換使用,都是指可特異性結(jié)合于豬霍亂沙門(mén)氏菌的另一株單克隆抗體,其由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10 (CGMCC N0.7710)產(chǎn)生。
[0038]如本文所用,所述的“特異性”是指抗體只能結(jié)合于豬霍亂沙門(mén)氏菌;更特別地,指那些能與豬霍亂沙門(mén)氏菌結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。
[0039]本發(fā)明人進(jìn)而根據(jù)雙抗夾心法的原理,制備了一種可用于檢測(cè)樣品中豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將捕捉抗體固定于載體,然后捕捉抗體與抗原反應(yīng),洗滌后再與檢測(cè)抗體反應(yīng)(所述的檢測(cè)抗體攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物,或可與攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物的物質(zhì)結(jié)合),最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。并且,相對(duì)于單抗體的競(jìng)爭(zhēng)法來(lái)說(shuō),雙抗體夾心法的測(cè)定效果更為優(yōu)良,因而測(cè)定時(shí)只需很少的樣品量。所以采用雙抗體夾心法無(wú)論在靈敏度、精確度、準(zhǔn)確度、特異性及穩(wěn)定性上更具有優(yōu)勢(shì)。
[0040]具體而言,本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒含有:
[0041]Ca)酶標(biāo)反應(yīng)板,所述的酶標(biāo)反應(yīng)板上包被有作為捕捉抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F10,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F10由小鼠雜交瘤細(xì)胞系 Mab05-F10,CGMCC N0.7712 產(chǎn)生;
[0042](b)容器a,所述的容器a中裝有作為檢測(cè)抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10, CGMCC N0.7710 產(chǎn)生。
[0043]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的檢測(cè)抗體帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
[0044]如本文所用,所述的“可檢測(cè)的標(biāo)記物”是指用于確定待檢測(cè)樣品中豬霍亂沙門(mén)氏菌的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。在確定了本發(fā)明的試劑盒所采用的捕捉抗體和/或檢測(cè)抗體后,可以采用本領(lǐng)域常規(guī)用于與檢測(cè)抗體結(jié)合來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的各種標(biāo)記物。本發(fā)明對(duì)所采用的標(biāo)記物沒(méi)有特別的限制,只要是能夠與所述的檢測(cè)抗體結(jié)合,且在適當(dāng)處理后能夠準(zhǔn)確地指示待檢測(cè)樣品中豬霍亂沙門(mén)氏菌的存在與否以及存在量的標(biāo)記物均是可用的。所述的標(biāo)記物可直接被設(shè)置于檢測(cè)抗體上;或者,所述的標(biāo)記物也可被設(shè)置于特異性抗檢測(cè)抗體的抗抗體上,本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的抗體的種類(lèi)和特性,選擇適宜的標(biāo)記物。例如,所述的標(biāo)記物可以選自:辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸醋酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0045]當(dāng)采用如上所示的一些酶標(biāo)記物時(shí),還需要采用一些與相應(yīng)的酶結(jié)合的底物,從而可通過(guò)顯色等方式來(lái)報(bào)導(dǎo)標(biāo)記物的存在情況或者存在量。如本文所用,所述的“與標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物”是指可被標(biāo)記物所催化顯色,用于顯示檢測(cè)抗體與豬霍亂沙門(mén)氏菌發(fā)生結(jié)合的識(shí)別信號(hào)。所述的底物例如:用于辣根過(guò)氧化物酶的鄰苯二肢(0PD)、四甲基聯(lián)苯肢(TMB)>ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝基苯磷酸醋(p-nitro phenyl phosphate, p_NPP)等等。本領(lǐng)域人員可根據(jù)所采用的標(biāo)記物的種類(lèi)和特性,選擇適宜的底物。
[0046]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的檢測(cè)抗體與標(biāo)記物直接相連接。更優(yōu)選地,所述的標(biāo)記物是HRP。與以生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體、反應(yīng)后再與鏈親和素HRP反應(yīng)相比較,直接在檢測(cè)抗體上標(biāo)記HRP、反應(yīng)結(jié)束后直接加底物顯色更為簡(jiǎn)單便捷。[0047]為了獲得定量結(jié)果,還可以在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置含己知濃度的多個(gè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的設(shè)置方法可采用常規(guī)的方法。
[0048]為了消除假陽(yáng)性和假陰性,也可在檢測(cè)過(guò)程中設(shè)置質(zhì)控(對(duì)照)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的陽(yáng)性對(duì)照為滅活的豬霍亂沙門(mén)氏菌菌液,所述的陰性對(duì)照為滅菌的緩沖蛋白胨水。
[0049]此外,為了使本發(fā)明的試劑盒在檢測(cè)時(shí)更方便,所述的試劑盒中優(yōu)選的還包含其它一些輔助試劑,所述的輔助試劑是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑,這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于):顯色劑、洗滌液、終止液、增菌液、稀釋液。
[0050]此外,在所述試劑盒中還可包含使用說(shuō)明書(shū),用于說(shuō)明其中裝載的試劑的使用方法。
[0051]本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)原理及有益效果如下:
[0052]本發(fā)明的試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法。當(dāng)在酶標(biāo)反應(yīng)板上預(yù)包被有抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體(捕捉抗體),加入樣品溶液或標(biāo)準(zhǔn)品后,再加入帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物如辣根過(guò)氧化物酶的另一株抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體(檢測(cè)抗體),樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中存在的豬霍亂沙門(mén)氏菌就會(huì)與酶標(biāo)反應(yīng)板上包被的捕捉抗體相結(jié)合,待加入檢測(cè)抗體后,會(huì)形成“抗體一抗原一酶標(biāo)抗體”復(fù)合物,經(jīng)過(guò)TMB (四甲基聯(lián)苯胺)顯色后會(huì)形成黃色物質(zhì),從而可判斷樣品中豬霍亂沙門(mén)氏菌的存在與否以及存在的量。
[0053]用酶標(biāo)儀于450nm下測(cè)定吸光度值。陰性對(duì)照≤0.1、陽(yáng)性對(duì)照≥0.3,實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,否則結(jié)果判定為無(wú)效;檢測(cè)孔OD值≥0.2時(shí),判定為陽(yáng)性;檢測(cè)孔OD值介于0.1-0.2之間時(shí),判定為弱陽(yáng)性;檢測(cè)孔OD值≤ 0.1判定為陰性。
[0054]試驗(yàn)表明,本發(fā)明的豬霍亂沙門(mén)氏菌酶聯(lián)免疫試劑盒,有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。板間誤差小于5%,板內(nèi)CV小于3%。與單增李斯特、鼠傷寒沙門(mén)、腸炎沙門(mén)、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、出血性大腸桿菌0157:H7、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計(jì)77種病原細(xì)菌均無(wú)交叉反應(yīng),此為本發(fā)明的最大創(chuàng)新點(diǎn)。
[0055]總之,本發(fā)明的試劑盒對(duì)樣品的前處理要求低,操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)極限為105cfu/ml,特異性和穩(wěn)定性好,并與大多數(shù)食源性致病菌都沒(méi)有交叉反應(yīng)。
[0056]下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實(shí)驗(yàn)室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明,否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0057]除非另行定義,文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0058]實(shí)施例1.抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05_F10和Mab05_D10的制備
[0059]一、免疫原和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0060]豬霍亂沙門(mén)氏菌(CICC21493 )接種在山梨醇麥康凱(SMAC)平板上,37°C培養(yǎng)24h,挑取單菌落于緩沖蛋白胨水(BPW),370C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h,計(jì)數(shù),加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整豬霍亂沙門(mén)氏菌(CICC21493)濃度至5X 109cfu/ml作為免疫原;用生理鹽水調(diào)整濃度為108cfu/ml作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品,緩沖蛋白胨水(BPW)為陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0061]二、單克隆抗體的制備
[0062]I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選3只8周齡,體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
[0063]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原,每間隔2周用同樣劑量加強(qiáng)注射一次。
[0064]3)采血:3次加強(qiáng)免疫后從尾部靜脈采血,采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗血清效價(jià)。待效價(jià)不再上升,腹腔注射同樣量免疫原,3天后按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0065]4)細(xì)胞融合:取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下常規(guī)融合,分別接種于96孔培養(yǎng)板,置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0066]5)雜交瘤細(xì)胞篩選:采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法,篩選強(qiáng)陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞,將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0067]6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底1/10時(shí),再用同樣方法檢測(cè),將強(qiáng)陽(yáng)性孔再克隆,如此反復(fù)3 — 4次,直至陽(yáng)性率達(dá)到100%。將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng),注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔,每只2 X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞,7?10天小鼠腹部隆起,活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化抗體。
[0068]三、單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定
[0069]豬霍亂沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基如下:國(guó)標(biāo):GB4789.4-2010
[0070]緩沖蛋白胨水(BPW)
[0071]成分:蛋白胨10.0g,氯化鈉5.0g,磷酸氫二鈉(含12個(gè)結(jié)晶水)9.0g,磷酸二氫鉀
1.5g,蒸懼水 IOOOmL ;
[0072]制法:將各成分加入蒸餾水中,攪混均勻,靜置約lOmin,煮沸溶解,調(diào)節(jié)ρΗ7.2±0.2,高壓滅菌 121°C,15min。
[0073]單克隆抗體效價(jià)測(cè)定的步驟如下:
[0074](I)將飽和培養(yǎng)細(xì)菌抗原連同培養(yǎng)基在對(duì)應(yīng)的孔中加入100μ 1,4°C過(guò)夜(約包板36h)。
[0075](2)倒空液體并拍干殘留液體,用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0076](3)每個(gè)孔中加 100 μ 11%BSA,37°C封閉 lh。
[0077](4)倒空液體并拍干殘留液體,用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0078](5)每個(gè)孔中加100μ I血清,37°C孵育lh。
[0079](6)倒空液體并拍干殘留液體,每個(gè)孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0080](7)每個(gè)孔中50μ I的HRP標(biāo)記的二抗(sigma),室溫孵育lh。
[0081](8)用洗滌液浸泡5min,倒空液體并拍干殘留液體,每個(gè)孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0082](9)每個(gè)孔中加100 μ I底物,顯色30min,加終止液100 μ I并立即在OD45tl讀數(shù)。
[0083]表1.兩株單克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果(OD45tl)
[0084]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬霍亂沙門(mén)氏菌的酶聯(lián)免疫試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒含有: Ca)固相載體,所述的固相載體上包被有作為捕捉抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F IO,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-F IO由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-F10, CGMCC N0.7712 產(chǎn)生; (b)容器a,所述的容器a中裝有作為檢測(cè)抗體的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO,所述的抗豬霍亂沙門(mén)氏菌單克隆抗體Mab05-D IO由小鼠雜交瘤細(xì)胞系Mab05-D10, CGMCC N0.7710 產(chǎn)生。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述的固相載體為酶標(biāo)反應(yīng)板。
3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述的檢測(cè)抗體帶有可檢測(cè)的標(biāo)記物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒,其特征在于,所述的可檢測(cè)的標(biāo)記物為辣根過(guò)氧化物酶。
5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒還含有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒,其特征在于,所述的陽(yáng)性對(duì)照為滅活的豬霍亂沙門(mén)氏菌菌液,所述的陰性對(duì)照為滅菌的緩沖蛋白胨水。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103823062SQ201410065159
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】劉箐, 張超 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)
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