豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，具有：依次連接的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其中，由保藏號(hào)為CGMCCNo.7710的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05-D10作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金并噴涂于金標(biāo)墊上，由保藏號(hào)為CGMCCNo.7712的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05-F10作為檢測(cè)抗體并噴涂于NC膜上形成檢測(cè)線。另外，本發(fā)明還提供了豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條在檢測(cè)食品豬霍亂沙門氏菌中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的試紙條對(duì)豬霍亂沙門氏菌的檢測(cè)特異性和靈敏性均較高。
【專利說(shuō)明】豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫膠體金檢測(cè)試紙條，屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]豬霍亂沙門氏菌(Shigella boydii)屬于志賀氏菌C群，是一種重要的食源性致病菌，可通過(guò)受污染的肉、蛋、魚及其制品等動(dòng)物性產(chǎn)品，瓜子仁等進(jìn)入人體，引起發(fā)熱、腹痛、里急后重，有時(shí)表現(xiàn)為全身中毒癥狀為中毒性痢疾，治療不徹底轉(zhuǎn)為慢性。
[0003]目前豬霍亂沙門氏菌的檢測(cè)主要依賴于國(guó)標(biāo)所規(guī)定的生化鑒定，其缺點(diǎn)是操作繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)，無(wú)法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學(xué)檢測(cè)是近年來(lái)出現(xiàn)的最快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的快速檢測(cè)手段，但國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)可運(yùn)用于檢測(cè)實(shí)踐的快速檢測(cè)產(chǎn)品，該專利以豬霍亂沙門氏菌為檢測(cè)靶標(biāo)，所要求保護(hù)的技術(shù)涉及豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，具有:依次連接的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊，其中，由保藏號(hào)為CGMCCN0.7710的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05-D10作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金并噴涂于金標(biāo)墊上，由保藏號(hào)為CGMCCN0.7712的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05_F10作為檢測(cè)抗體并噴涂于NC膜上形成檢測(cè)線。
[0005]另外，本發(fā)明還提供了豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條在檢測(cè)食品豬霍亂沙門氏菌中的應(yīng)用。
[0006]發(fā)明作用與效果
[0007]根據(jù)本發(fā)明的豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條，由于采用了新篩選的配對(duì)單克隆抗體分別噴涂金標(biāo)墊和檢測(cè)線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的試紙條對(duì)豬霍亂沙門氏菌的檢測(cè)特異性和靈敏性均較高。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的單抗SDS-PAGE電泳圖；
[0009]圖2是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的各抗體偶聯(lián)膠體金pH結(jié)果；
[0010]圖3是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的各抗體偶聯(lián)
膠體金結(jié)合量結(jié)果；
[0011]圖4是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的各抗體組合配對(duì)結(jié)果；
[0012]圖5是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的膠體金試紙條靈敏度結(jié)果；
[0013]圖6是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的膠體金試紙條交叉反應(yīng)結(jié)果；
[0014]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的膠體金試紙條模擬帶菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0015]圖8是本發(fā)明實(shí)施例中豬霍亂沙門氏菌的免疫膠體金檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]保藏信息:
[0017]1.分泌豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體Mab05_D10的雜交瘤細(xì)胞株抗豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)雜交瘤細(xì)胞株,于2013年06月03日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101。
[0018]保藏號(hào):CGMCCN0.7710。
[0019]2.分泌豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體Mab05_F10的雜交瘤細(xì)胞株抗豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)雜交瘤細(xì)胞株,于2013年06月03日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101
[0020]保藏號(hào):CGMCCN0.7712。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下結(jié)合附圖介紹本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】:
[0022]首先介紹本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試劑與儀器:
[0023]主要試劑
[0024]弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG、TWEEN-20Sigma ；BSA購(gòu)于上海世澤生物科技有限公司；膠體金溶液購(gòu)于上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜(NC膜)135SMillipore ;羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒購(gòu)于ZYMEDCat:90-6550; Lot.60907259。本發(fā)明中用于做交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)的菌株均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。
[0025]主要儀器
[0026]酶標(biāo)儀SpectraMax M2 購(gòu)自 Molecular Devices ;Nanodrop2000C 購(gòu)自 ThermoScientific ;點(diǎn)樣儀AD6010購(gòu)自B10-D0T ;掃描儀Phantom V9購(gòu)自MICROTEK ;恒溫培養(yǎng)搖床SPH-100B購(gòu)自上海世平；蛋白純化儀BioLogic?LP358BR5057購(gòu)自BIO-RAD ;單人凈化工作臺(tái)SW-SJ-2D型購(gòu)自蘇州凈化。
[0027]—、豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體制備
[0028]1.免疫原和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備
[0029]豬霍亂沙門氏菌(CICC21493 )接種于蛋白胨水(BPW)，37 °C、150r/min振蕩培養(yǎng)17h，計(jì)數(shù)，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I(lǐng)天。用生理鹽水調(diào)整豬霍亂沙門氏菌(CICC21493)濃度至5X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調(diào)整濃度為108cfu/ml作為陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白胨水(BPW)為陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。
[0030]2.單克隆抗體的制備過(guò)程
[0031]I)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。[0032]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強(qiáng)注射一次。
[0033]3)米血:3次加強(qiáng)免疫后從尾部靜脈米血，米用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗血清效價(jià)。待效價(jià)不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0034]4)細(xì)胞融合:取免疫小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在50%PEG作用下常規(guī)融合，分別接種于96孔培養(yǎng)板，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0035]5)雜交瘤細(xì)胞篩選:采用間接非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法，篩選強(qiáng)陽(yáng)性孔的雜交瘤細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板。
[0036]6)克隆培養(yǎng)及抗體制備:用有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿孔底1/10時(shí)，再用同樣方法檢測(cè)，將強(qiáng)陽(yáng)性孔再克隆，如此反復(fù)3 — 4次，直至陽(yáng)性率達(dá)到100%。將雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，注射于經(jīng)石蠟油預(yù)處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7~10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化抗體。
[0037]篩選出2株穩(wěn)定分泌抗豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為Mab05-D10 (CGMCCN0.7710，簡(jiǎn)稱 D10)和 Mab05_F10 (CGMCC) N0.7712，簡(jiǎn)稱 F10)，經(jīng)過(guò)初步抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)DlO和FlO進(jìn)行亞類及亞型鑒定、測(cè)定濃度、相對(duì)分子質(zhì)量，并對(duì)制備的單克隆抗體通過(guò)交叉反應(yīng)進(jìn)行特異性驗(yàn)證。
[0038]3.單克隆抗體的亞型鑒定 [0039]通過(guò)單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測(cè)定各抗體亞類、亞型，表1結(jié)果為顯色終止后450nm處OD值，由表2可得，D10、F10亞類均為IgGl，輕鏈亞型為κ。
[0040]表1單克隆抗亞類、亞型結(jié)果
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條，具有: 依次連接的樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸收墊， 其中，由保藏號(hào)為CGMCCN0.7710的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05_D10作為金標(biāo)抗體偶聯(lián)膠體金并噴涂于所述金標(biāo)墊上，由保藏號(hào)為CGMCCN0.7712的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體Mab05-F10作為檢測(cè)抗體并噴涂于所述NC膜上形成檢測(cè)線。
2.如權(quán)利要求1所述的豬霍亂沙門氏菌免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條在檢測(cè)食品豬霍亂沙門氏菌中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103941006SQ201410065283
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年2月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月25日
【發(fā)明者】劉箐, 劉程 申請(qǐng)人:上海理工大學(xué)