一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明的一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法，是由釀酒酵母菌株細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Atg8的熒光標(biāo)記、土壤水萃液的獲取、釀酒酵母在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基和不同氮素量培養(yǎng)基的培養(yǎng)、模型的建立和土壤內(nèi)可利用氮素的推算等步驟組成，其特征在于：不同可利用氮素的量會(huì)使得GFP-Atg8在液泡內(nèi)的分布比例不同，據(jù)此建立標(biāo)準(zhǔn)模型和推算未知土壤內(nèi)可利用氮素的量。該方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可真實(shí)反映生物對(duì)土壤內(nèi)可利用氮素的響應(yīng)情況。
【專利說(shuō)明】—種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方

法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和土壤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的土壤內(nèi)可利用氮素的測(cè)定方法，更準(zhǔn)確地說(shuō)本發(fā)明涉及一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土壤養(yǎng)分參數(shù)(主要為氮、磷、鉀及有機(jī)質(zhì)含量)是土壤肥力的重要指標(biāo)，反映了土壤供給作物生長(zhǎng)的能力；其中氮素是作物最重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，也是酶的主要成分，所以氮素對(duì)作物生理代謝和生長(zhǎng)有重要作用。作物可利用的土壤內(nèi)中主要氮素形式是銨態(tài)氮和硝態(tài)氮；氮素的不同形態(tài)會(huì)對(duì)作物生理代謝過(guò)程和生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響。目前公認(rèn)的土壤內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)診斷都是以實(shí)驗(yàn)室常規(guī)測(cè)試為主，取樣、測(cè)定、數(shù)據(jù)分析等繁瑣的過(guò)程需要耗費(fèi)大量的人力、物力，且未考慮氮素營(yíng)養(yǎng)的多寡對(duì)其內(nèi)生物的影響。
[0003]細(xì)胞自噬(autophagy)是溶酶體(酵母中為液泡)參與的胞內(nèi)物質(zhì)代謝的過(guò)程，是真核生物維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和保持健康的一類亞細(xì)胞降解途徑，在真核生物中是保守的。目前了解比較多的細(xì)胞自卩遼調(diào)控通路主要有兩條:T0R(Target of rapamycin)通路和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K,Phosphoinositide3-kinase)通路,很多其他自曬途徑都直接或間接通過(guò)這兩條通路發(fā)揮作用；Tor是細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)控因子，能特異性的響應(yīng)胞內(nèi)氮素水平，在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，Tor激酶處于活性狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞自噬受到抑制，而在營(yíng)養(yǎng)缺乏或雷帕霉素處理等外界條件下，Tor激酶 失活而自噬活性上升；在可利用氮素營(yíng)養(yǎng)缺乏的條件下，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)物質(zhì)會(huì)運(yùn)往液泡進(jìn)行降解，因而可以根據(jù)真核生物啟動(dòng)細(xì)胞自噬即自噬相關(guān)蛋白如AtgS運(yùn)往液泡(或溶酶體)的情況來(lái)檢測(cè)土壤內(nèi)氮素水平。
[0004]目如國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究還未有涉及該方面的成果，因而利用突光標(biāo)記的自曬相關(guān)蛋白在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)在液泡內(nèi)的分布比例，可以有效的推測(cè)土壤內(nèi)可利用氮素的水平?；诖耍梢赃M(jìn)行相關(guān)技術(shù)方法的改進(jìn)和測(cè)試設(shè)備的研制，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決土壤內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)多寡未考慮其內(nèi)生物的問(wèn)題，基于細(xì)胞自噬與氮素營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系，本發(fā)明的提供了一種新穎的測(cè)試土壤內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)的方法，即:在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，釀酒酵母中GFP-Atg8在液泡內(nèi)的分布比例來(lái)推算土壤內(nèi)可利用氮素的量。
[0006]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007](1)釀酒酵母菌株AtgS蛋白的熒光標(biāo)記和相應(yīng)數(shù)量關(guān)系模型的建立:自噬相關(guān)蛋白Atg8被GFP標(biāo)記釀酒酵母菌株的特征在于,可以通過(guò)突光顯微鏡或者westem-blot等技術(shù)手段，方便的觀察到AtgS的分布情況，當(dāng)培養(yǎng)液中氮素營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，GFP-AtgS會(huì)送往液泡降解；而在營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下，GFP-AtgS會(huì)彌散在細(xì)胞質(zhì)中。在不同氮素水平下，GFP-AtgS進(jìn)入液泡的比例有所不同，據(jù)此可建立氮素水平和AtgS進(jìn)入液泡比例間的關(guān)系。
[0008](2)所用菌株細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù):酵母細(xì)胞在SD-Ura等培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期0D_ ^ 1.0時(shí)，取約30mL培養(yǎng)液經(jīng)離心、洗滌后轉(zhuǎn)入不同氮素水平的培養(yǎng)基中，在保證培養(yǎng)時(shí)間(> 2小時(shí))相同的前提下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微熒光拍照或者收集細(xì)胞進(jìn)行western-blot，根據(jù)所得結(jié)果建立氮素水平與液泡內(nèi)Atg8分布比例之間的關(guān)系模型；并根據(jù)土壤水萃液作為唯一氮源的培養(yǎng)基中酵母細(xì)胞液泡內(nèi)的AtgS分布比例，推算土壤內(nèi)可利用氮素的量。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、可真實(shí)反映生物對(duì)土壤內(nèi)可利用氮素的響應(yīng)情況。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1是在氮素營(yíng)養(yǎng)豐富條件和完全缺氮條件下GFP-Atg8分布的顯微熒光照片圖。
[0011]圖2是不同氮素水平下GFP_Atg8轉(zhuǎn)換為Atg8的western-blot示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012](I)AtgS蛋白的熒光標(biāo)記:利用釀酒酵母基因庫(kù)關(guān)于AtgS的基因信息，設(shè)計(jì)上下游引物，對(duì)AtgS序列片段進(jìn)行擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物和含GFP的載體進(jìn)行酶切、純化、連接等分子生物學(xué)操作，然后整合至所用的釀酒酵母基因組。
[0013](2) 土壤測(cè)試樣品水萃液的獲取:對(duì)所測(cè)試區(qū)域進(jìn)行采樣，經(jīng)干燥、研磨、過(guò)篩等步驟，取Ig待測(cè)土樣，與IOmL去離子水在搖床上IOOrpm振蕩24h得到土壤水萃液，然后高速離心5min，取上清液，高溫滅菌后備用。
[0014](3)氮素水平與GFP_Atg8在液泡分布比例之間關(guān)系模型的建立:將自噬相關(guān)蛋白Atg8已被GFP熒光蛋 白標(biāo)記的酵母細(xì)胞在50mL液體SD-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600 ^ 1.0時(shí)，取30mL培養(yǎng)液經(jīng)離心、無(wú)菌水洗滌后，轉(zhuǎn)入不同氮素水平的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間(> 2小時(shí))后，取樣，在一定曝光時(shí)間條件下，進(jìn)行熒光觀察，獲得顯微熒光照片，如附圖1所示，在氮素營(yíng)養(yǎng)豐富條件下(圖1上面一行所示)，GFP-AtgS分布在細(xì)胞質(zhì)中(如圖1①所示)，而液泡內(nèi)沒(méi)有GFP-AtgS進(jìn)入(如圖1②所示)；而在氮素營(yíng)養(yǎng)完全缺失的條件下(圖1下面一行所示)，GFP-Atg8則由細(xì)胞質(zhì)運(yùn)往液泡(如圖1③和④所示)；或者培養(yǎng)一段時(shí)間后，收集酵母細(xì)胞，進(jìn)行western-blot,得到GFP_Atg8降解的情況圖，如附圖2所示，在氮素營(yíng)養(yǎng)豐富的條件下(圖2①所對(duì)應(yīng)的一列)，主要是以GFP-Atg8(如圖2④所對(duì)應(yīng))的形式存在，而在氮素營(yíng)養(yǎng)完全缺失的條件下(圖2③所對(duì)應(yīng)的一列)，則主要以分離的GFP和AtgS的形式(如圖2⑤所對(duì)應(yīng))存在，在其他氮素營(yíng)養(yǎng)梯度下(如圖2②所對(duì)應(yīng))，則分離形式的GFP和AtgS (即進(jìn)入液泡部分)呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律；根據(jù)顯微熒光照片的亮度和面積的信息，可以得到Atg8在液泡內(nèi)的分布量；或者根據(jù)western-blot結(jié)果，得到歸一化的GFP-Atg8和Atg8的量的信息(用亮度和面積信息與加樣對(duì)照G6TOH即圖2⑥所對(duì)應(yīng)條帶進(jìn)行比較)，計(jì)算AtgS進(jìn)入液泡的情況；根據(jù)前述所得到的液泡內(nèi)AtgS分布的比例和不同的氮素水平，可以建立二者之間的關(guān)系模型。
[0015](4)測(cè)算樣品的可利用氮素含量:以步驟(2)所獲取的土壤水萃液作為唯一氮源，進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件完全同步驟(3)，得到顯微熒光照片和western-blot結(jié)果，并通過(guò)計(jì)算得到AtgS在液泡內(nèi)的分布比例；然后根據(jù)步驟(3)所建立的關(guān)系模型，計(jì)算所測(cè)試土壤樣品的可利用氮素含量。[0016]以上已以較佳實(shí)施公開了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采取等同替換或等效變換所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法，其特征在于:對(duì)所用釀酒酵母菌株細(xì)胞中的自噬蛋白AtgS進(jìn)行熒光標(biāo)記；根據(jù)顯微熒光照片或蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)的結(jié)果,建立可利用氮素水平與酵母菌株細(xì)胞中突光蛋白在液泡分布比例的關(guān)系；收集Ig待測(cè)土壤，與IOmL去離子水在搖床上1OOrpm振蕩24h得到土壤水萃液，然后高速離心5min，取上清液，高溫滅菌后備用；將自噬相關(guān)蛋白Atg8已被熒光蛋白標(biāo)記的酵母細(xì)胞在50mL液體SD-Ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)至0D600 ^ 1.0時(shí)，取30mL培養(yǎng)液經(jīng)離心、無(wú)菌水洗滌后轉(zhuǎn)入以無(wú)菌的上清液為唯一氮源的培養(yǎng)基中；培養(yǎng)一定時(shí)間后，計(jì)算熒光蛋白在液泡內(nèi)的分布比例；并根據(jù)所建立的關(guān)系推算土壤內(nèi)可利用氮素的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的關(guān)系是指已知氮素水平與AtgS進(jìn)入液泡的比例之間的關(guān)系。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光蛋白分布比例的土壤內(nèi)可利用氮素的檢測(cè)方法，其特征在于:所述的檢測(cè)方法是以土壤水萃液作為唯一氮源，進(jìn)行釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)其內(nèi)AtgS進(jìn)入液泡的比例來(lái)推算可利用氮素含量的方法。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103808943SQ201410071519
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】劉玉濤, 丁為民, 陳玉侖, 高瑾 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)