一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，包括：（1）將污泥樣品離心后真空冷凍干燥，然后搗碎加入EDTA-Mcllvaine緩沖提取液漩渦混合后超聲萃取，得上清液；（2）將上清液緩緩流經(jīng)SPE-HLB小柱，全部萃取后用高純水清洗小柱，真空干燥后用甲醇將目標(biāo)物質(zhì)從SPE-HLB小柱上洗脫下來，收集洗脫液；（3）將洗脫液吹至近干，加入乙腈和水混合液定容，然后針頭式過濾器過濾；（4）將步驟（3）得到的液體進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。本發(fā)明建立了一種超聲-固相聯(lián)合萃取，然后通過高效液相色譜/質(zhì)譜來測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，該方法先進(jìn)、準(zhǔn)確、靈敏。
【專利說明】一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于抗生素的痕量檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，各種各樣的藥品為人類的健康生存和發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)。目前約有3000余種不同的藥品在世界各國普遍使用，包括各種抗生素、避孕藥、油脂調(diào)節(jié)劑、抗抑郁癥藥和生長(zhǎng)抑制劑等。其中，四環(huán)素類藥品是廣泛應(yīng)用于臨床的一類廣譜十二氫化并四苯抗生素，包括金霉素、土霉素、四環(huán)素及近年來發(fā)展起來的半合成四環(huán)素類抗生素(多西環(huán)素、米諾環(huán)素、吡咯烷甲基四環(huán)素、甲烯土霉素、甲氯環(huán)素等)，這類藥品主要用于牙周炎、上呼吸道感染、扁挑體炎、糖尿病以及動(dòng)物飼料添加劑等。通常這些四環(huán)素類抗生素只能部分被人體或動(dòng)物吸收轉(zhuǎn)化，剩余大部分藥品及其代謝物隨尿液和糞便排泄，并通過城市下水道進(jìn)入到城市污水處理系統(tǒng)中，由于這些物質(zhì)的親脂性，它們中的大部分被吸附在污泥上。隨著污泥中微量污染物問題被不斷提出，對(duì)這些抗生素的檢測(cè)就越來越重要，而抗生素的檢測(cè)方法成為相關(guān)研究的重要因素。
[0003]通常的對(duì)污泥中的四環(huán)素、土霉素和金霉素的液相色譜法測(cè)定中，如何從污泥中萃取并分離鑒別這些物質(zhì)，對(duì)HPLC檢測(cè)有很大的影響。選擇使用超聲萃取+固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)進(jìn)行污泥中四環(huán)素類抗生素的定量檢測(cè)，并選擇多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式(MRM)，以求檢測(cè)污泥中四環(huán)素、土霉素和金霉素。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)的特異性和選擇性 強(qiáng)，其多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式可以通過檢測(cè)分子離子和碰撞誘導(dǎo)解離得到的碎片離子，而更有選擇性地定性定量檢測(cè)目標(biāo)化合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，該方法中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素的色譜圖出峰穩(wěn)定，峰形良好，出峰的拖尾現(xiàn)象消除，并能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。
[0005]本發(fā)明的一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，包括:
[0006](I)將污泥樣品于SOOOr.mirT1離心IOmin后，將其中的污泥固體真空冷凍干燥，然后搗碎并過50目篩，接著準(zhǔn)確稱量1.0OOg篩后污泥并置于離心管中，加入IOmlEDTA-Mcllvaine緩沖提取液游潤混合Imin后超聲萃取IOmin,并以4000r *min_1離心20min后,收集上清液；再重復(fù)萃取2次,合并3次萃取的上清液；
[0007](2)依次用6mL甲醇、6mL高純水、6mL Na2EDTA的緩沖液對(duì)SPE-HLB小柱進(jìn)行活化和平衡，而后以3mL ^mirT1的流速將合并后的上清液緩緩流經(jīng)SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高純水清洗小柱,接著真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL ?mirT1的流速將目標(biāo)物質(zhì)從SPE-HLB小柱上洗脫下來，收集洗脫液；
[0008](3)使用氮吹儀在水浴溫度40°C以高純氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两?，加入乙腈和水混合液定容，然后?.22 μ m的針頭式過濾器過濾；
[0009](4)將步驟(3)得到的液體進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，分析條件如下:
[0010]a高效液相色譜條件:
[0011]色譜柱:C8液相色譜柱(美國Phenomenex公司)；
[0012]流動(dòng)相:A相為乙腈:B相為含0.28%甲酸的高純水；
[0013]流速:0.4mL.mirT1 ；
[0014]進(jìn)樣量:20yL;
[0015]柱溫:40°C;
[0016]b串聯(lián)質(zhì)譜條件:
[0017]離子源:電噴霧電離源正離子模式(ESI+);
[0018]檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子模式；
[0019]毛細(xì)管電壓:3.5kV ;干燥氣為:250°C。
[0020]步驟(1)中所述的EDTA-Mcllvaine緩沖提取液具體為:0.05mol.L^1EDTA,
0.06mol.L-1Na2HPO4^0.08mol.L-1 檸檬酸，pH=4。
[0021]步驟(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈與水的體積比7:3。
[0022]步驟(4)中所述的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為70:30。
[0023]本發(fā)明中采用超聲萃取和固相萃取泥樣中四環(huán)素、土霉素和金霉素；用HPLC-MS/MS和外標(biāo)法計(jì)算四環(huán)素、土霉素和金霉素的含量。
[0024]在樣品制備時(shí)，本發(fā)明采用了超聲萃取泥中四環(huán)素、土霉素和金霉素到液體中，超聲萃取具有較高的分離效果，能夠有效萃取污泥中的物質(zhì)。
[0025]有益效果:
[0026](1)本發(fā)明分別獲得了對(duì)測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的高效液相色譜法有重要影響的幾個(gè)條件:柱溫、流動(dòng)相配比和流速等，并考察了回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，獲得較好的精密度與加標(biāo)回收率；
[0027](2)本發(fā)明采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式和C8反相硅膠色譜柱，采用了超聲萃取和非極性萃取柱聯(lián)合的泥相萃取方法，使用乙腈/超純水為流動(dòng)相，恒速洗脫，通過對(duì)超純水pH與流動(dòng)相配比的調(diào)整，使分析方法中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素的色譜圖出峰穩(wěn)定，峰形良好，出峰的拖尾現(xiàn)象消除，并能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1:四環(huán)素色譜圖；
[0029]圖2:四環(huán)素質(zhì)譜圖；
[0030]圖3:土霉素色譜圖；
[0031]圖4:土霉素質(zhì)譜圖；
[0032]圖5:金霉素色譜圖；
[0033]圖6:金霉素質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0035]實(shí)施例1
[0036]1、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0037]本實(shí)驗(yàn)采用5點(diǎn)外標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)目標(biāo)抗生素進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)前需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)樣品工作溶液的配置工作，具體方法如下:
[0038]標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液:按純度折算校正后分別準(zhǔn)確稱取三種抗生素，用乙腈溶解搖勻后定容于IOOmL棕色容量瓶中，配制成濃度為200mg -1的各種四環(huán)素單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(其中土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制時(shí)滴加適量稀鹽酸以使其溶解完全)。于_4°C冰箱避光保存。
[0039]混和標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)工作溶液:臨用時(shí)分別準(zhǔn)確量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，用乙腈配制成混合標(biāo)準(zhǔn)母液，取混合標(biāo)準(zhǔn)母液用乙腈逐步稀釋，配制成濃度范圍為10~2000 μ g.L—1標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。
[0040]標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定:混合標(biāo)準(zhǔn)樣品工作溶液準(zhǔn)備完成后，按3.1.3的相關(guān)HPLC-MS/MS條件并以濃度從小到大的順序連續(xù)依次進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定(每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)6次)，根據(jù)樣品濃度對(duì)應(yīng)相應(yīng)色譜峰面積得到3種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。
[0041 ] 在空白水樣中添加混 標(biāo)準(zhǔn)溶液制成濃度為Ojyg^L-1的加標(biāo)混合溶液，采用目標(biāo)化合物的母離子和特征子離子為選擇檢測(cè)離子對(duì)，結(jié)合不同的保留時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并水平平行測(cè)定5次.[0042]通過連續(xù)注射測(cè)定11次濃度為200 μ g -1的標(biāo)準(zhǔn)溶液來計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來確定精密度，并以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍值濃度作為檢出限(LOD)；
[0043]2、生活污水處理廠污泥的前處理
[0044]將取回的污泥樣品于8000r.mirT1離心IOmin后，取出其中的污泥固體置于冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥24小時(shí),之后搗碎并過50目篩。準(zhǔn)確稱量1.0OOg篩后污泥并置于離心管中，加入 IOmlEDTA-MclIvaine緩沖提取液(0.05mol ?L^EDTA+0.06mol.L-1Na2HPOf0.08mol.L-1朽1樣酸，pH=4),游潤混合Imin后超聲萃取IOmin,并以4000r.mirT1離心20min后，收集上清液。再重復(fù)萃取2次，步驟同上。合并3次萃取操作收集的上清液。
[0045]依次用6mL甲醇、6mL高純水、6mL Na2EDTA的緩沖液對(duì)SPE-HLB小柱進(jìn)行活化和平衡，而后以3mL ^irT1的流速將合并后的3次萃取的上清液緩緩流經(jīng)SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高純水清洗小柱,接著真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL.mirT1的流速將目標(biāo)物質(zhì)從SPE-HLB小柱上洗脫下來，收集洗脫液；使用氮吹儀在水浴溫度40°C以高純氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两桑尤胍译婧退旌弦憾ㄈ?腈與水的體積比7:3)。
[0046]3.色譜條件
[0047]a高效液相色譜條件:
[0048]色譜柱:C8液相色譜柱(美國Phenomenex公司)。
[0049]流動(dòng)相:A相為乙腈:B相為高純水(含0.28%甲酸)=7:3。
[0050]流速:0.4mL.mirT1。
[0051]進(jìn)樣量:20μ L。[0052]柱溫:40°C。
[0053]b串聯(lián)質(zhì)譜條件:
[0054]離子源:電噴霧電離源正離子模式(ESI+);
[0055]檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子模式；
[0056]毛細(xì)管電壓:3.5kV ;干燥氣為:250°C。
[0057]表1目標(biāo)抗生素的質(zhì)子化離子、產(chǎn)物離子和質(zhì)譜條件參數(shù)
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，包括: (1)將污泥樣品于SOOOr.HIirT1離心IOmin后，將其中的污泥固體真空冷凍干燥，然后搗碎并過50目篩，接著準(zhǔn)確稱量1.0OOg篩后污泥并置于離心管中，加入IOmlEDTA-Mcllvaine緩沖提取液游潤混合Imin后超聲萃取IOmin,并以4000r 離心20min后,收集上清液；再重復(fù)萃取2次,合并3次萃取的上清液； (2)依次用6mL甲醇、6mL高純水、6mLNa2EDTA的緩沖液對(duì)SPE-HLB小柱進(jìn)行活化和平衡，然后以3mL ^irT1的流速將步驟(1)得到的上清液緩緩流經(jīng)SPE-HLB小柱，全部萃取后用6mL高純水清洗小柱,接著真空干燥5min ;最后用6mL甲醇以ImL.mirT1的流速將目標(biāo)物質(zhì)從SPE-HLB小柱上洗脫下來，收集洗脫液； (3)在水浴溫度40°C以高純氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两桑尤胍译婧退幕旌弦憾ㄈ?，然后?.22 μ m的針頭式過濾器過濾； (4)將步驟(3)得到的液體進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，分析條件如下: a高效液相色譜條件: 色譜柱:C8液相色譜柱 流動(dòng)相:A相為乙腈:B相為含0.28%甲酸的高純水；
流速:0.4mL.mi rT1 ； 進(jìn)樣量:20yL ; 柱溫:40°C ； b串聯(lián)質(zhì)譜條件: 離子源:電噴霧電離源正離子模式； 檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式； 毛細(xì)管電壓:3.5kV ;干燥氣為:250°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的EDTA-Mcllvaine緩沖提取液具體為:0.05mol.L^1EDTA,0.06mol.L-1Na2HPO4^0.08mol.L-1 檸檬酸，pH=4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步驟(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈與水的體積比7:3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定污泥中痕量四環(huán)素、土霉素和金霉素含量的方法，其特征在于:步驟(4)中所述的流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為70:30。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK103823005SQ201410072616
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】黃滿紅, 劉沖, 張微, 劉松山, 宋盼盼, 陳東輝, 陳亮 申請(qǐng)人:東華大學(xué)