利用lrp4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物，包括人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4LRP4或LRP4模擬表位。本發(fā)明組合物能對神經(jīng)傳遞障礙疾病進(jìn)行診斷，具有良好的效果，市場前景廣闊。
【專利說明】利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及診斷組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)傳遞障礙疾病重癥肌無力是一種自身免疫疾病，將導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭的功能紊亂。70%患有重癥肌無力的病人都攜帶乙酰膽堿受體的自身抗體，另外10%病人攜帶MuSK的自身抗體。但是，20%的病人在血清中檢測不到乙酰膽堿受體或MuSK的自身抗體。因此，需要一種針對神經(jīng)肌肉相關(guān)的疾病如重癥肌無力的診斷組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了 一種針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物。
[0004]具體技術(shù)方案:
利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物，包括人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4LRP4或LRP4模擬表位。
[0005]為了達(dá)到更好的效果，所述的診斷組合物，還進(jìn)一步包括聚集蛋白、聚集蛋白模擬表位、乙酰膽堿受體、乙酰膽堿受體模擬表位、肌肉特異性酪氨酸激酶的任一種或幾種。
[0006]所述神經(jīng)傳遞障礙疾病包括重癥肌無力，肌肉萎縮癥，或者先天性肌無力綜合征(CMS)。
[0007]本發(fā)明還涉及利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷試劑盒，前述診斷組合物。
[0008]為了更好的達(dá)到檢測的效果，診斷組合物中LRP4或LRP4模擬表位上有可檢測的標(biāo)簽。這樣檢測結(jié)果會更加直觀，便于觀察。
[0009]所述標(biāo)簽可以為125I。
[0010]所述的診斷試劑盒，還可以通過有色顆粒免疫測定法檢測抗原-抗體復(fù)合物。同樣具有直觀的結(jié)果呈現(xiàn)效果。
[0011]本發(fā)明還一種檢測LRP4抗體的方法，所述方法包括檢測由前述的診斷組合物與樣品接觸后所形成的抗原-抗體復(fù)合物。
[0012]這種檢測LRP4抗體的方法，選自:BIAC0RE分析、FACS、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印記、放射性免疫分析、ELISA、免疫沉淀反應(yīng)、沉淀素反應(yīng)、膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:提供了一種效果良好的利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物，填補(bǔ)了目前研究及市場的空缺，具有廣闊的市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1:采用ELISA方法檢測針對LRP4的自身抗體。
[0015]圖2:重癥肌無力的病人血清中檢測不到抗乙酰膽堿受體/MuSK的抗體，但是能檢測到LRP4的自身抗體。
[0016]圖3:免疫LRP4胞外端重組蛋白誘發(fā)小鼠產(chǎn)生LRP4自身抗體，并引起小鼠重癥肌無力癥狀，肌電圖動物電位不能持續(xù)維持。
[0017]圖4:注射LRP4胞外端重組蛋白的小鼠神經(jīng)肌肉接頭形態(tài)出現(xiàn)異常，包括乙酰膽堿受體染色呈碎片，突觸前運(yùn)動神經(jīng)元退化，突觸小泡密度下降。
[0018]圖5:注射LRP4胞外端重組蛋白的小鼠血清能夠抑制MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化，減少LRP4細(xì)胞表面定位以及聚集蛋白誘導(dǎo)的乙酰膽堿受體聚集，并部分激活補(bǔ)體反應(yīng)。
[0019]圖6:注射抗LRP4兔免疫球蛋白IgG的小鼠具有重癥肌無力癥狀。
[0020]圖7:采用ELISA方法檢測針對聚集蛋白的自身抗體。
[0021]圖8:聚集蛋白自身抗體陽性的重癥肌無力病人血清能夠識別外源表達(dá)的聚集蛋白。
[0022]圖9:聚集蛋白自身抗體陽性的重癥肌無力病人血清能夠抑制聚集蛋白引起的乙酰膽堿受體在肌肉細(xì)胞中的聚集。
【具體實施方式】
[0023]實施例1 LRP4自身抗體存在于重癥肌無力病人血液，能夠誘發(fā)重癥肌無力
自發(fā)性免疫疾病重癥肌無力是一種常見的神經(jīng)突觸疾病，10萬人中約有10-20個患病者。其中約有80%的病人其體內(nèi)的抗體能夠結(jié)合肌肉的乙酰膽堿受體，這些抗體使乙酰膽堿受體數(shù)目減少或是失去功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞中的肌無力。盡管大部分的重癥肌無力都是由于自身抗體結(jié)合乙酰膽堿受體引發(fā)的，但是約有20%的病人體內(nèi)檢測不到乙酰膽堿受體的抗體。2001年，在乙酰膽堿受體抗體陰性的病人中，有約4-50%的病人可以檢測出MuSK抗體。用MuSK胞外區(qū)免疫兔后可導(dǎo)致重癥肌無力，乙酰膽堿受體的數(shù)目減少。盡管一系列的實驗證明了乙酰膽堿受體和MuSK的抗體導(dǎo)致了重癥肌無力，但是還有10%的病人血清中鑒定不到這些抗體。
[0024]本實例證明在乙酰膽堿受體以及MuSK抗體雙陰性的病人中，約有9.2%的病人檢測出LRP4的抗體。LRP4胞外區(qū)域的抗體能明顯的抑制LRP4的功能，是乙酰膽堿受體以及MuSK抗體陰性的重癥肌無力病人致病原因。本實例證明免疫LRP4胞外端重組蛋白的小鼠，能夠檢測到血清中產(chǎn)生LRP4自身抗體。小鼠誘發(fā)重癥肌無力癥狀，包括體重減輕，爪握力下降，神經(jīng)遞質(zhì)傳遞出現(xiàn)障礙，肌肉復(fù)合動作電位(CMAP)不能持續(xù)。形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肌肉接頭聚集的乙酰膽堿受體下降并出現(xiàn)碎片，不能完全和神經(jīng)末端重合。將免疫有LRP4胞外端重組蛋白的重癥肌無力兔子血清注射到小鼠上，也能引發(fā)重癥肌無力，證明了 LRP4自身抗體的致病性。因此，檢測LRP4抗體是臨床上檢測和診斷重癥肌無力的一種新方法，制備LRP4自身抗體引起的自身免疫病動物模型是作為探索治療重癥肌無力的新模型。
[0025]實驗步驟:
實驗材料:Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶以及各種限制性內(nèi)切酶購自Promega公司。各種辣根過氧化物酶鏈接的羊抗鼠和羊抗兔抗體與用于WB的ECL試劑購自Amersham公司。R-BTX 購自 Molecular Probes 公司。寡聚核苷酸由 Operon Biotechnologies 公司合成。除非個別提到的特例，其他所有試劑都購自Sigma-Aldrich公司。
[0026]各種抗體購置于Sigma 公司(Flag M2, F3165) ；Upstate Biotechnology (4G10,05-1050) ；Novus ( β-actin，NB600-501 )。各種兔抗MuSK抗體在之前文獻(xiàn)中有描述(Luoet al., 2002, Neuron; 35:489-505)。鼠抗乙酸膽喊 α 亞基抗體為 mAb35。[0027]構(gòu)建材料:構(gòu)建Flag-ecto-LRP4_His時，在含有LRP4胞外結(jié)構(gòu)域的pFlag-ecto-LRP4-CMV載體中的SalI和EcoRV酶切位點(diǎn)之間，通過PCR技術(shù)弓IAHis肽段標(biāo)簽(Wu et al., 2012, Neuron ；Shen et al.2013, J.Clin.1nvest )。
[0028]細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:HEK293細(xì)胞系和小鼠C2C12肌肉細(xì)胞系的維持和轉(zhuǎn)染在之前的文獻(xiàn)中有描述(Zhang et al., 2007，J Neurosci; 27:3968-3973)。在一些實驗中，肌管是由Iipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019)轉(zhuǎn)染的。轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞培養(yǎng)在DNA、脂質(zhì)體和無血清培養(yǎng)基的混合物中，持續(xù)8小時后，換為融合培養(yǎng)基。在混合物中DNA與脂質(zhì)體的比例為I μ g:2 μ I。在10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的優(yōu)化條件為Iml轉(zhuǎn)染混合物，其中含有IOyg DNA質(zhì)粒。
[0029]重組蛋白的表達(dá)及其純化:表達(dá)重組蛋白時，ΗΕΚ293細(xì)胞由相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后，細(xì)胞培養(yǎng)基換為含有0.05%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。24小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，利用Talon柱純化LRP4胞外端重組蛋白，具體方法參見(Shen et al.2013，J.Clin.1nvest; Zhang et al.2011.JAMA NeuroX
[0030]小鼠免疫實驗:將100 Ul含有25ug的混有完全弗氏佐劑的LRP4抗原蛋白乳液注射到小鼠背部皮下，一個月后注射相同含量的的非完全弗氏佐劑/LRP4抗原蛋白乳液，兩周后重復(fù)注射以提高抗體滴度。期間抽取小鼠血液用Elisa檢測LRP4抗體是否陽性，具體方法參見(Shen et al.2013, J Clin.1nvest)。
[0031]酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA):具體方法參見文獻(xiàn)(Shen et al.2013, J Clin.1nvest; Zhang et al.2011.Arch Neuro)。純化的 Flag_LRP4 過夜包被 Max1-SorpImmunology Plates (Nunc)，然后用含有1%BSA的PBS孵育以去除非特異結(jié)合。包被完畢的培養(yǎng)板中加入經(jīng)LRP4免疫的小鼠血清以檢測LRP4抗體，按照1:100稀釋并重復(fù)三組。一抗采用辣根過氧化物酶連接的羊抗小鼠耳朵IgG檢測，實驗中的非特異性吸附被扣除。
[0032]免疫染色-小鼠膈肌經(jīng)剝離后用4%的多聚甲醛固定I天以上，用0.1M Glycine處理I小時。1.0% Triton-x-100/PBS穿孔過夜，加入含有1.0%胎牛血清，0.5%羊血清的抗體封閉液2小時。加入Neurofilament和synaptophysin抗體過夜。用1.0%Triton-x-100/PBS洗3以上，每次I小時。加入含有對應(yīng)的熒光二抗和R-BTX (tetramethylrhodamine-conjugated a-bungarotoxin,以標(biāo)記乙酸膽喊受體)。用 1.0% Triton-x-100/PBS洗3以上，每次I小時，封片顯微鏡下觀察。
[0033]電鏡實驗:具體染色參見以前報道(Shen et al.2013, J Clin.1nvest)。小鼠膈肌用2%戊二醛和2%多聚甲醛室溫固定I小時，再在1%鋨酸處理I小時。經(jīng)30%，50%,70%, 80%, 90% and 100% 酒精脫水后包埋，切片成 1-2 um。用 3% uranyl acetate 和 2.6%lead citrate 顯色，用 JEOL 100CXII 拍照。
[0034]免疫共沉淀、免疫印跡和乙酰膽堿受體聚合實驗:這些實驗按照之前文獻(xiàn)的描述進(jìn)行操作(Luo et al., 2002, Neuron; 35:489-505; Zhang et al., 2007, J Neurosci ;27:3968-3973; Zhu et al., 2008，J Neurosci; 28:1688-1696)。除特別說明外，用于刺激肌肉細(xì)胞的重組神經(jīng)聚集蛋白的終濃度都為I nM。免疫印跡的條帶亮度通過ImageJsoftware進(jìn)行分析。
[0035]統(tǒng)計學(xué)分析:多組實驗數(shù)據(jù)用ANOVA軟件根據(jù)student-Newman-Keuls test進(jìn)行分析。Two-tailed Student’s t test用于比較分析兩組數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)差異顯著性的判別標(biāo)準(zhǔn)是p〈0.05。在圖表中的數(shù)值和誤差線分別表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0036]結(jié)果:
重癥肌無力病人中約有10-15%為乙酰膽堿受體以及肌肉特異的酪氨酸激酶抗體陰性，由于病人不同的確診方法和實際真實值無法估計。為了建立一種新的診斷方法和進(jìn)行流行病學(xué)分析，病人的血漿和血清采用ELISA方法分析其和LRP4或聚集蛋白的結(jié)合。如圖1所示，LRP4采用Elisa方法檢測，在217個重癥肌無力病人血清中，共有12個病人檢測到LRP4抗體陽性。在120個血清為乙酰膽堿受體以及肌肉特異的酪氨酸激酶抗體雙陰性的重癥肌無力病人中，發(fā)現(xiàn)11個LRP4抗體陽性。通過比對發(fā)現(xiàn)鼠源和人源LRP4同源性為98%，在1905個氨基酸中只有68個不同。盡管目前檢測LRP4的靈敏度較高，如果在將來的檢測中采用人源的LRP4其靈敏度能得到進(jìn)一步的提升。
[0037]乙酰膽堿受體以及MuSK抗體陰性的重癥肌無力病人的血漿采用鼠源的LRP4檢測。五個血清為乙酰膽堿受體以及MuSK抗體陰性的重癥肌無力病人的血漿在稀釋50倍后能結(jié)合到細(xì)胞膜上的LRP4,但是健康人血楽:不能結(jié)合LRP4。如圖10所示，乙酰膽堿受體以及MuSK抗體陰性病人的血漿結(jié)合LRP4。乙酰膽堿受體以及MuSK抗體陰性病人的血漿能夠結(jié)合HEK293上表達(dá)的全長LRP4，健康人血漿抗體不能結(jié)合。圖2:重癥肌無力的病人血清中檢測不到抗乙酰膽堿受體/MuSK的抗體，但是能檢測到LRP4的自身抗體。
[0038]如圖3所示，本實例證明免疫LRP4胞外端重組蛋白的小鼠，能夠檢測到血清中產(chǎn)生LRP4自身抗體。小鼠誘發(fā)重癥肌無力癥狀，包括體重減輕，爪握力下降。而且神經(jīng)接頭遞質(zhì)傳遞出現(xiàn)障礙，肌肉復(fù)合動作電位(CMAP)不能持續(xù)。圖4所示，形態(tài)學(xué)上發(fā)現(xiàn)注射LRP4胞外端重組蛋白的小鼠神經(jīng)肌肉接頭形態(tài)出現(xiàn)異常，神經(jīng)肌肉接頭聚集的乙酰膽堿受體下降并出現(xiàn)碎片，不能完全和神經(jīng)末端重合，突觸前運(yùn)動神經(jīng)元退化，突觸小泡密度下降。注射LRP4胞外端重組蛋白的小鼠血清能夠抑制MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化，減少LRP4細(xì)胞表面定位以及聚集蛋白誘導(dǎo)的乙酰膽堿受體聚集，并部分激活補(bǔ)體反應(yīng)(如圖5所示)。將免疫有LRP4胞外端重組蛋白的重癥肌無力兔子血清注射到小鼠上，也能引發(fā)重癥肌無力，證明了 LRP4自身抗體的致病性(圖6)。因此，檢測LRP4抗體是臨床上檢測和診斷重癥肌無力的一種新方法，制備LRP4自身抗體引起的自身免疫病動物模型是作為探索治療重癥肌無力的新模型。
[0039]實施例2重癥肌無力患者自身抗體結(jié)合聚集蛋白agrin
一部分重癥肌無力患者病人的血清，呈現(xiàn)乙酰膽堿受體抗體/MuSK抗體/LRP4抗體陰性，這可能提示還有新的未知自身抗體存在。本發(fā)明證明了在這些病人血清中含有聚集蛋白agrin的抗體。本實例證明在93個重癥肌無力病人中，7個血清為聚集蛋白抗體陽性(約為7?8%)，而在健康人或其他病人對照中，并沒有發(fā)現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性。此發(fā)明說明聚集蛋白抗體是重癥肌無力患者的新致病原。
[0040]實驗證明聚集蛋白抗體血清能夠識別聚集蛋白，而且能夠抑制聚集蛋白誘導(dǎo)的MuSK蛋白憐酸化，并能夠抑制聚集蛋白對乙酸膽喊受體的聚集。此發(fā)明證明聚集蛋白抗體和乙酰膽堿受體抗體，MuSK抗體和LRP4抗體一樣，同樣是引起重癥肌無力的致病原因。因此，檢測聚集蛋白抗體是臨床上檢測和診斷重癥肌無力的一種新方法。
[0041]方法:
病人-樣品來源于男性或是女性重癥肌無力病人。病人都通過肌電圖經(jīng)一部證實了神經(jīng)肌肉傳遞缺陷或是對抗膽堿酯酶的檢測結(jié)構(gòu)呈陽性。另外一些血清來自正常的志愿者，來源于他免疫相關(guān)的神經(jīng)性疾病或正常人血清。
[0042]神經(jīng)聚集蛋白的表達(dá)-構(gòu)建方法在實例I中有詳細(xì)描述。構(gòu)建后的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。為了獲得可溶性的聚集蛋白，轉(zhuǎn)染后的第二天將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低血清培養(yǎng)基，含有聚集蛋白的培養(yǎng)基在24小時后收集并采用Western boltting方法檢測蛋白表達(dá)。
[0043]免疫染色-C0S7細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的第二天轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。兩天后細(xì)胞用4%的多聚甲醛固定染色。重癥肌無力病人以及正常病的血漿按照稀釋成不同的比例用來分析。一抗后連接FITC作為顯色二抗。
[0044]Elisa方法檢測聚集蛋白抗體-來自轉(zhuǎn)染有聚集蛋白或空載體的HEK293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基用PH9.5的NaHC03 (PH=9.5)溶液按照1:1稀釋后加入ELISA板上過夜。血漿按照1:100稀釋并重復(fù)三組。一抗采用堿性磷酸酶連接羊抗人的IgM+IgG+IgA檢測，實驗中的非特異性吸附被扣除。
[0045]結(jié)果
為了建立一種新的診斷方法和進(jìn)行流行病學(xué)分析，病人的血漿和血清采用ELISA方法分析聚集蛋白抗體的存在。如圖7所示，聚集蛋白采用Elisa方法檢測。本實例證明在93個重癥肌無力病人中，7個血清為聚集蛋白抗體陽性(約為7?8%),而在健康人或其他病人對照中，并沒有發(fā)現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性。在6個乙酰膽堿受體抗體陰性/MuSK抗體陽性/LRP4抗體陰性的病人血清中，沒有檢測到聚集蛋白抗體陽性，說明MuSK抗體陽性的病人很可能是聚集蛋白抗體陰性。在83個乙酰膽堿受體抗體陽性/MuSK抗體陰性/LRP4抗體陰性的病人血清中，5個呈現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性，比例約為6%。而在4個乙酰膽堿受體抗體陰性/MuSK抗體陰性/LRP4抗體陰性的病人血清中，2個為聚集蛋白抗體陽性，比例高達(dá)50%。此發(fā)明說明聚集蛋白抗體很可能是乙酰膽堿受體/MUSK/LRP4抗體三陰性病人的新致病原。
[0046]如圖8所示，聚集蛋白陽性的病人血清能夠結(jié)合HEK293上表達(dá)的全長聚集蛋白，而健康人血漿抗體不能結(jié)合。而且如圖9所示，聚集蛋白陽性的病人血清能夠抑制聚集蛋白引起的MuSK蛋白的磷酸化，和對乙酰膽堿受體的聚集。
[0047]實施例3 LRP4自身抗體檢測試劑盒的制備方法和檢測過程
自發(fā)性免疫疾病重癥肌無力是一種常見的神經(jīng)突觸疾病，10萬人中約有10-20個患病者。其中約有80%的病人其體內(nèi)的抗體能夠結(jié)合肌肉的乙酰膽堿受體，這些抗體使乙酰膽堿受體數(shù)目減少或是失去功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)肌肉傳遞中的肌無力。而在乙酰膽堿受體抗體陰性的病人中，有約4-50%的病人可以檢測出MuSK抗體。盡管一系列的實驗證明了乙酰膽堿受體和MuSK的抗體導(dǎo)致了重癥肌無力，但仍有10%的病人血清中檢測不到這些抗體。本實例描述了 LRP4自身抗體酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒的制備方法，以及用該試劑盒在乙酰膽堿受體以及MuSK抗體雙陰性的病人中檢測LRP4抗體的過程。
[0048]試劑盒的制備:
構(gòu)建材料:構(gòu)建Flag-ecto-LRP4-His時，在含有LRP4胞外結(jié)構(gòu)域的pFlag-ecto-LRP4-CMV載體中的Sal I和EcoRV酶切位點(diǎn)之間，通過PCR技術(shù)弓IAHis肽段標(biāo)簽(Wu et al., 2012, Neuron ；Shen et al.2013, J.Clin.1nvest )。
[0049]細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:HEK293細(xì)胞系的維持和轉(zhuǎn)染在之前的文獻(xiàn)中有描述(Zhang etal., 2007，J Neurosci; 27:3968-3973)。轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞培養(yǎng)在DNA、脂質(zhì)體和無血清培養(yǎng)基的混合物中，持續(xù)8小時后，換為融合培養(yǎng)基。在混合物中DNA與脂質(zhì)體的比例為I μ g:2μ I。在10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的優(yōu)化條件為Iml轉(zhuǎn)染混合物，其中含有10 μ g DNA質(zhì)粒。
[0050]重組蛋白的表達(dá)及其純化:表達(dá)重組蛋白時，HEK293細(xì)胞由Flag-ecto-LRP4-His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后，細(xì)胞培養(yǎng)基換為含有0.05%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。24小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，利用Talon柱純化LRP4胞外端重組蛋白，具體方法參見(Shenet al.2013, J.Clin.1nvest; Zhang et al.2011.Arch Neurol)。
[0051]酶聯(lián)免疫板的包被:純化的Flag_LRP4用碳酸緩沖液(PH=9.5)稀釋后加入ELISA板(Max1-Sorp Immunology Plates (Nunc))上 4。C 孵育過夜。然后用含有 1%BSA 的 PBS封閉以阻斷非特異結(jié)合位點(diǎn)。包被好的酶聯(lián)免疫板可以長期保存。
[0052]LRP4抗體的檢測:
病人樣品患者血清來源于男性及女性重癥肌無力病人。病人經(jīng)肌電圖確診，或已檢測出抗乙酰膽堿受體抗體。對照血清來自正常的志愿者以及其他免疫相關(guān)的神經(jīng)性疾病患者。
[0053]ELISA檢測:包被好的酶聯(lián)免疫板中加入經(jīng)1:100稀釋的血清樣品，每個樣品重復(fù)三組。經(jīng)孵育清洗后，向板中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgM+IgG+IgA 二抗檢測，實驗中的非特異性吸附被扣除。
[0054]統(tǒng)計學(xué)分析:多組實驗數(shù)據(jù)用ANOVA軟件根據(jù)student-Newman-Keuls test進(jìn)行分析。Two-tailed Student’s t test用于比較分析兩組數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)差異顯著性的判別標(biāo)準(zhǔn)是P〈0.05。
[0055]結(jié)果:
重癥肌無力病人中約有10-15%為乙酰膽堿受體以及肌肉特異的酪氨酸激酶抗體陰性。由于病人不同的確診方法，實際真實值無法估計。為了建立一種新的診斷方法和進(jìn)行流行病學(xué)分析，病人的血漿和血清采用ELISA方法分析其中LRP4抗體的存在。如圖1所示，在217個重癥肌無力病人中，我們用在此描述的方法共檢測到12位LRP4抗體陽性的病人。如圖2所示，120個乙酰膽堿受體以及肌肉特異的酪氨酸激酶抗體雙陰性的重癥肌無力病人中共發(fā)現(xiàn)11位LRP4抗體陽性。通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)鼠源和人源LRP4同源性為98%，在1905個氨基酸中只有68個不同。盡管目前檢測LRP4的靈敏度較高，如果在將來的檢測中采用人源的LRP4其靈敏度能得到進(jìn)一步的提升。
[0056]綜上可見，檢測LRP4抗體是臨床上檢測和診斷重癥肌無力的一種新方法。
[0057]實施例4聚集蛋白自身抗體檢測試劑盒的制備方法和檢測過程
在一部分重癥肌無力患者病人的血清中，無法檢測到乙酰膽堿受體抗體/MuSK抗體/LRP4抗體，這可能提示還有新的未知自身抗體存在。本實例描述了聚集蛋白自身抗體酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒的制備方法，以及用該試劑盒在乙酰膽堿受體/MuSK抗體/LRP4抗體三陰性的病人血清中檢測LRP4抗體的過程，證明了在這部分病人血清中存在聚集蛋白的抗體。
[0058]試劑盒的制備:
構(gòu)建材料構(gòu)建pFlag-agrin時,在Flag標(biāo)簽和聚集蛋白序列之間通過PCR技術(shù)引入His 妝段標(biāo)簽(Zhang et al., 2007, J Neurosci )。[0059]細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系的維持和轉(zhuǎn)染在之前的文獻(xiàn)中有描述(Zhang etal., 2007，J Neurosci; 27:3968-3973)。轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞培養(yǎng)在DNA、脂質(zhì)體和無血清培養(yǎng)基的混合物中，持續(xù)8小時后，換為融合培養(yǎng)基。在混合物中DNA與脂質(zhì)體的比例為I μ g:2μ I。在10厘米培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的優(yōu)化條件為Iml轉(zhuǎn)染混合物，其中含有10 μ g DNA質(zhì)粒。
[0060]重組蛋白的表達(dá)及其純化表達(dá)重組蛋白時,HEK293細(xì)胞由pFlag-agrin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后，細(xì)胞培養(yǎng)基換為含有0.05%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。24小時后收集細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞，利用Talon柱純化agrin重組蛋白，具體方法參見文獻(xiàn)(Shen et al.2013, J.Clin.1nvest; Zhang et al.2011.Arch Neurol)。
[0061]酶聯(lián)免疫板的包被純化的Flag-agrin用碳酸緩沖液(PH=9.5)稀釋后加入ELISA 板(Max1-Sorp Immunology Plates (Nunc))上 4。C 孵育過夜。然后用含有 1%BSA的PBS封閉以阻斷非特異結(jié)合位點(diǎn)。包被好的酶聯(lián)免疫板可以長期保存。
[0062]聚集蛋白抗體的檢測:
病人樣品患者血清來源于男性及女性重癥肌無力病人。病人經(jīng)肌電圖確診，或已檢測出抗乙酰膽堿受體抗體/MuSK抗體。對照血清來自正常的志愿者以及其他免疫相關(guān)的神經(jīng)性疾病患者。
[0063]ELISA檢測包被好的酶聯(lián)免疫板中加入經(jīng)1:100稀釋的血清樣品，每個樣品重復(fù)三組。經(jīng)孵育清洗后，向板中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgM+IgG+IgA 二抗檢測，實驗中的非特異性吸附被扣除。
[0064]統(tǒng)計學(xué)分析多組實驗數(shù)據(jù)用ANOVA軟件根據(jù)student-Newman-Keuls test進(jìn)行分析。Two-tailed Student’s t test用于比較分析兩組數(shù)據(jù)。各組數(shù)據(jù)差異顯著性的判別標(biāo)準(zhǔn)是P〈0.05。
[0065]結(jié)果:
為了建立一種新的診斷方法和進(jìn)行流行病學(xué)分析，病人的血漿和血清采用ELISA方法分析聚集蛋白抗體的存在。如圖7所示，聚集蛋白采用ELISA方法檢測。本實例證明在93個重癥肌無力病人中，7個血清為聚集蛋白抗體陽性(約為7?8%),而在健康人或其他病人對照中，并沒有發(fā)現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性。在6個乙酰膽堿受體抗體陰性/MuSK抗體陽性/LRP4抗體陰性的病人血清中，沒有檢測到聚集蛋白抗體陽性，說明MuSK抗體陽性的病人很可能是聚集蛋白抗體陰性。在83個乙酰膽堿受體抗體陽性/MuSK抗體陰性/LRP4抗體陰性的病人血清中，5個呈現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性，比例約為6%。而在4個乙酰膽堿受體抗體陰性/MuSK抗體陰性/LRP4抗體陰性的病人血清中，2個為聚集蛋白抗體陽性，比例高達(dá)50%。此發(fā)明說明聚集蛋白抗體很可能是乙酰膽堿受體/MUSK/LRP4抗體三陰性病人的新致病原，檢測聚集蛋白抗體是臨床上檢測和診斷重癥肌無力的一種新方法。
[0066]實施例5含LRP4和/或聚集蛋白的多價抗體檢測試劑盒
多數(shù)重癥肌無力病人體內(nèi)具有抗乙酰膽堿受體的抗體，而在乙酰膽堿受體抗體陰性的病人中，有約4-50%的病人可以檢測出MuSK抗體。本發(fā)明提供了一種檢測和治療神經(jīng)傳遞以及神經(jīng)發(fā)育過程中相關(guān)疾病的新方法，這些疾病包括但不限于重癥肌無力。本發(fā)明提供的檢測方法可檢測針對LRP4，聚集蛋白(agrin)或是相關(guān)的抗原的自身抗體。在上述實施例3和4中我們描述了約3%的乙酰膽堿受體抗體陰性/MuSK抗體陽性的病人血清呈現(xiàn)LRP4抗體陽性，而約6%的乙酰膽堿受體抗體陽性/MuSK抗體陰性/LRP4抗體陰性的病人血清呈現(xiàn)聚集蛋白抗體陽性。這些多價抗體陽性的病人可能具有與單價抗體陽性的病人不同的發(fā)病機(jī)理和病理特征，需要更有針對性的治療方案。
[0067]因此我們要求涵蓋含LRP4或LRP4模擬表位、聚集蛋白或聚集蛋白模擬表位以及乙酰膽堿受體、乙酰膽堿受體模擬表位、肌肉特異性酪氨酸激酶的任一種或幾種的多價抗體檢測試劑盒。該試劑盒可能在重癥肌無力及其他神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷分型和預(yù)后中有重要的應(yīng)用。
[0068]實施例6
本發(fā)明利用:LRP4作為抗原檢測LRP4抗體，利用聚集蛋白檢測聚集蛋白抗體進(jìn)而檢測是否為重癥肌無力患者?？梢岳眠@個原理依照常規(guī)方法如ELISA，做成試劑盒?，F(xiàn)舉例如下:
試紙條的制備:用具有塑料背板的硝酸纖維素膜作為主要結(jié)構(gòu)固定抗原，在硝酸纖維素膜較低的位置沉積有金偶聯(lián)抗體的玻璃纖維素膜(偶聯(lián)體墊)，和位于硝酸纖維素膜兩端，彼此相連，吸附有過量溶液的纖維素膜(樣品墊和吸附墊)。玻璃纖維膜在系統(tǒng)較低的位置，由于其較高的吸附能力它不僅可以很快吸收樣品，而且可以通過延長其向上不遷移的保留時間，誘導(dǎo)待測材料和溶解膠體金有效的反應(yīng)。在免疫試紙條的中部，檢測待測樣品的抗原(檢測線或捕捉線)和能檢測膠體金的特定抗體(對照線)分別被固定，而且纖維素膜位于免疫試紙條的上不(吸附墊)以快速吸附過多的樣品。
【權(quán)利要求】
1.利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷組合物，包括人低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4 LRP4或LRP4模擬表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷組合物，其特征在于還進(jìn)一步包括聚集蛋白、聚集蛋白模擬表位、乙酰膽堿受體、乙酰膽堿受體模擬表位、肌肉特異性酪氨酸激酶的任一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷組合物，其特征在于所述神經(jīng)傳遞障礙疾病包括重癥肌無力，肌肉萎縮癥，或者先天性肌無力綜合征CMS。
4.利用LRP4針對神經(jīng)傳遞障礙疾病的診斷試劑盒，包括權(quán)利要求1所述的診斷組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的診斷試劑盒，其特征在于診斷組合物中LRP4或LRP4模擬表位上有可檢測的標(biāo)簽。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的診斷試劑盒，其特征在于所述標(biāo)簽為1251。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的診斷試劑盒，其特征在于通過有色顆粒免疫測定法檢測抗原-抗體復(fù)合物。
8.—種檢測LRP4抗體的方法，所述方法包括檢測由權(quán)利要求1所述的診斷組合物與樣品接觸后所形成的抗原-抗體復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述的方法選自:BIACORE分析、FACS、免疫熒光、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印記、放射性免疫分析、ELISA、免疫沉淀反應(yīng)、沉淀素反應(yīng)、膠擴(kuò)散沉淀反應(yīng)。
【文檔編號】G01N33/564GK103869064SQ201410075263
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】梅林 , 熊文誠, 張斌, 沈承勇, 羅時文 申請人:南昌大學(xué)