一種利拉魯肽生物學(xué)活性的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明以細(xì)胞內(nèi)3’,5’-環(huán)腺苷酸（cAMP）水平的變化作為檢測(cè)指標(biāo)，采用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法測(cè)定利拉魯肽生物學(xué)活性。通過(guò)培養(yǎng)大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-m5F，分別加入稀釋后的利拉魯肽對(duì)照品溶液和供試品溶液，用試劑盒檢測(cè)刺激后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化，用多功能酶標(biāo)儀的超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模塊讀取相對(duì)化學(xué)發(fā)光單位（RLU），然后利用統(tǒng)計(jì)軟件擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)公式計(jì)算供試品的生物學(xué)活性。該方法能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)利拉魯肽生物學(xué)活性的變化，其準(zhǔn)確性和重復(fù)性符合生物制品生物學(xué)活性測(cè)定方法的要求。
【專利說(shuō)明】一種利拉魯肽生物學(xué)活性的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利拉魯肽生物學(xué)活性的測(cè)定方法。
發(fā)明背景
[0002]糖尿病在世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重威脅人類健康。胰高血糖素樣肽-l(glucagon-likepeptide-1),簡(jiǎn)稱GLP-1，是腸道L細(xì)胞分泌的一種多肽類激素，具有促進(jìn)胰島素分泌、促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖和分化的功能。它通過(guò)刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空發(fā)揮降血糖的作用。由于它對(duì)胰島素的刺激具有葡萄糖依賴性，因此不引發(fā)低血糖癥狀。
[0003]天然GLP-1因半衰期短(僅I?2分鐘)不適合臨床應(yīng)用。利拉魯肽與GLP-1有97%的同源性，在臨床上用于成人2型糖尿病患者控制血糖。其分子結(jié)構(gòu)與天然人GLP-1分子的不同之處是:第34位的賴氨酸被精氨酸取代，第26位的賴氨酸上增加了一個(gè)由谷氨酸介導(dǎo)的16碳脂肪酸側(cè)鏈。利拉魯肽半衰期長(zhǎng)達(dá)13小時(shí)，每日只需皮下注射I次，即可有效控制血糖24小時(shí)。
[0004]生物制品的生物學(xué)活性是生物制品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，因此利拉魯肽的生物學(xué)活性測(cè)定方法是利拉魯肽質(zhì)量研究的重點(diǎn)之一。目前利拉魯肽生物學(xué)活性欠缺簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法。
[0005]利拉魯肽屬于GLP-1類似物，它與細(xì)胞膜上GLP-1受體(G蛋白偶聯(lián)受體)相互作用后，細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase)被激活,導(dǎo)致胞內(nèi)cAMP水平升高。胞內(nèi)cAMP水平檢測(cè)法被廣泛用于定量測(cè)定GLP-1及其類似物的體外生物學(xué)活性，屬于細(xì)胞基礎(chǔ)的受體結(jié)合法。利拉魯肽原研廠為novo nordisk公司。在該公司專利CN97198413.1中為檢測(cè)GLP-1衍生物的生物活性，測(cè)定了它們?cè)诒磉_(dá)人胰腺GLP-1受體的細(xì)胞系內(nèi)刺激cAMP形成的能力，使用了幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK)和閃爍親近測(cè)定法(說(shuō)明書第61/62頁(yè))。由于表達(dá)人胰腺GLP-1受體的幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞難以獲得；而且閃爍親近測(cè)定法使用了放射性同位素，對(duì)人體有危害，因此需要開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、安全可靠的利拉魯肽生物活性測(cè)定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種利用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法測(cè)定利拉魯肽生物學(xué)活性的新方法，從而解決了利拉魯肽生物學(xué)活性測(cè)定的難題。
[0007]目前實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)使用的是放射性同位素測(cè)定法和cAMP酶聯(lián)免疫反應(yīng)分析法來(lái)測(cè)定胞內(nèi)cAMP水平。但是放射性同位素對(duì)人體有危害，實(shí)驗(yàn)操作不方便。而cAMP酶聯(lián)免疫反應(yīng)分析法通過(guò)ELISA方法測(cè)定，該方法步驟繁瑣，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程周期較長(zhǎng)，而且實(shí)驗(yàn)誤差相對(duì)較大，因而結(jié)果不是非常理想。
[0008]本申請(qǐng)發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)和對(duì)比研究后，第一次創(chuàng)造性地將cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理應(yīng)用于利拉魯肽的生物學(xué)活性測(cè)定。cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理是:裂解細(xì)胞釋放出胞內(nèi)cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)而消耗ATP。ATP的減少反映為化學(xué)發(fā)光信號(hào)的減弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，從而化學(xué)發(fā)光信號(hào)越弱。
[0009]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)相比于cAMP酶聯(lián)免疫反應(yīng)分析法，cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法更為方便，實(shí)驗(yàn)步驟少，試驗(yàn)結(jié)果更為精確，誤差相對(duì)較小，因而是一種比較理想的測(cè)定胞內(nèi)cAMP水平的方法。
[0010]因而，本發(fā)明建立了一種利拉魯肽生物學(xué)活性的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟:
[0011](I)分別制備利拉魯肽對(duì)照品溶液和供試品溶液，設(shè)置稀釋濃度梯度；
[0012](2)培養(yǎng)大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-H15F后，加入步驟(1)中制備的對(duì)照品及供試品溶液刺激細(xì)胞；
[0013](3)用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒檢測(cè)利拉魯肽刺激后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化，用酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模塊讀取相對(duì)化學(xué)發(fā)光單位(RLU)。
[0014](4)以稀釋倍數(shù)或藥物濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)化學(xué)發(fā)光單位為縱坐標(biāo)，利用統(tǒng)計(jì)軟件擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到利拉魯肽的劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算出供試品和對(duì)照品的半效稀釋倍數(shù)，按照以下公式計(jì)算供試品的生物學(xué)活性:
[0015]供試品生物學(xué)活性
【權(quán)利要求】
1.一種利拉魯肽生物學(xué)活性的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟: (1)分別制備利拉魯肽對(duì)照品溶液和供試品溶液，設(shè)置稀釋濃度梯度； (2)培養(yǎng)大鼠胰島瘤細(xì)胞RIN-m5F后，加入步驟(1)中制備的對(duì)照品及供試品溶液刺激細(xì)胞； (3)用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒檢測(cè)利拉魯肽刺激后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平變化，用酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)模塊讀取相對(duì)化學(xué)發(fā)光單位(RLU)； (4)以稀釋倍數(shù)或藥物濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)化學(xué)發(fā)光單位為縱坐標(biāo)，利用統(tǒng)計(jì)軟件擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到利拉魯肽的劑量效應(yīng)曲線，計(jì)算出供試品和對(duì)照品的半效稀釋倍數(shù)，按照以下公式計(jì)算供試品的生物學(xué)活性:



供試品生物學(xué)活性
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(1)中，利拉魯肽對(duì)照品溶液及供試品溶液根據(jù)其初始濃度進(jìn)行預(yù)稀釋，以使預(yù)稀釋后得到利拉魯肽對(duì)照品和供試品的濃度接近或相同；由利拉魯肽對(duì)照品溶液及供試品溶液的初始濃度和最后設(shè)定的預(yù)稀釋濃度確定利拉魯肽對(duì)照品溶液的預(yù)稀釋倍數(shù)(Dr)和供試品溶液的預(yù)稀釋倍數(shù)(Ds)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(1)中，預(yù)稀釋后的利拉魯肽對(duì)照品溶液及供試品溶液的濃度范圍為0.0OOl~lmg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(1)中，在預(yù)稀釋的基礎(chǔ)上，對(duì)利拉魯肽對(duì)照品和供試品進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，制備得到系列濃度梯度的拉魯肽對(duì)照品和供試品，稀釋倍數(shù)范圍為I倍至200萬(wàn)倍，在此范圍內(nèi)根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇稀釋的倍數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(1)中，稀釋溶液為PH范圍7.2-9.5的、濃度為1-1OOmM的緩沖溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細(xì)胞的培養(yǎng)可選擇預(yù)先鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板中，置25°C -45°CU% -10%二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-5天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)器中培養(yǎng)后，吸去培養(yǎng)孔中上清，然后加入利拉魯肽藥物刺激細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)容器在25-45 °C放置1-30分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細(xì)胞的培養(yǎng)可以在步驟(1)所述的利拉魯肽對(duì)照品和供試品溶液的配制之前、與其同時(shí)或者在其之后；在細(xì)胞培養(yǎng)好之后，再選擇加入利拉魯肽樣品進(jìn)行刺激。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(3沖，cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒為Promega公司的cAMP_Glo?Max Assay試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于:所述方法步驟(4)中，利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合時(shí)，利用四參數(shù)方程擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，四參數(shù)方程的公式可表示為:Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+1CT ((LogEC50_X)*HiIISlope))； 擬合出利拉魯肽劑量效應(yīng)曲線的四個(gè)參數(shù)Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，可得到供試品和對(duì)照品的半效稀釋倍數(shù)或半效濃度(EC50)，然后計(jì)算供試品的相對(duì)活性和生物學(xué)活性 。
【文檔編號(hào)】G01N21/76GK103884846SQ201410079787
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】盧旻衎, 周亮, 曹陽(yáng), 戎亞雯, 吉鵬飛, 馬國(guó)昌 申請(qǐng)人:杭州九源基因工程有限公司