慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物，其為β型可溶性NSF附著蛋白β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq?ID?No.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)β-SNAPs的表達(dá)和含量變化可以指示慢性神經(jīng)退行性疾病的早期發(fā)生，并開發(fā)出檢測這種蛋白變化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，為慢性神經(jīng)退行性疾病的早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)開辟了新思路，通過更深入的機(jī)理研究和損耗-時間曲線的建立，有助于將慢性神經(jīng)退行性疾病的損失降到最低。
【專利說明】慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]朊蛋白病是發(fā)生在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一類神經(jīng)退行性疾病，具有較長的潛伏期，由于早期治療對于該病的治愈有著重要意義，因此對于朊蛋白病的早期診斷的研究勢在必行。目前對于神經(jīng)退行性疾病早期診斷的研究主要圍繞蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)以及影響觀察幾個方面進(jìn)行展開。其中以二維聚丙烯酰胺凝膠電泳為基礎(chǔ)的蛋白組學(xué)一直是近年來的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過二維電泳進(jìn)行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量差異進(jìn)行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000?3000種蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。電泳后對膠進(jìn)行高靈敏度染色，例如銀染或熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質(zhì)樣品，然后在同樣條件下進(jìn)行二維電泳，染色后比較兩塊膠；或者，可以將二者的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的熒光染料標(biāo)記，然后兩種蛋白質(zhì)樣品在一塊膠上進(jìn)行二維電泳的分離，最后通過熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。
[0003]膠染色后可以利用凝膠圖像分析系統(tǒng)成像，然后通過分析軟件對蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，并且對感興趣的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點(diǎn)切割系統(tǒng)，可以將蛋白質(zhì)點(diǎn)所在的膠區(qū)域進(jìn)行精確切割。接著對膠中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切消化，酶切后的消化產(chǎn)物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點(diǎn)樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點(diǎn)樣到特定材料的表面(MALD1-T0F)。最后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進(jìn)行分析，從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫或與已有的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較分析。
[0004]LCM- 二維電泳-質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典技術(shù)路線，除此以外，LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)路線。即，通過LCM技術(shù)獲得感興趣的細(xì)胞類型，制備細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)經(jīng)熒光染料標(biāo)記后與抗體芯片雜交，從而可以比較兩種樣品蛋白質(zhì)表達(dá)的異同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供所述標(biāo)志物在慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷中的應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物，所述標(biāo)志物為 β 型可溶性 NSF 附著蛋白(Soluble NSF attachment proteins, SNAPs)β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供所述標(biāo)志物β -SNAPs在制備慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑中的應(yīng)用。其是以β-SNAPs作為免疫原，通過免疫動物，獲得相應(yīng)抗體，將制備的抗體作為診斷試劑或診斷試劑中的有效成分。
[0009]本發(fā)明還提供一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑，其是以β -SNAPs作為免疫原，通過免疫動物，獲得的相應(yīng)抗體即為診斷試劑。
[0010]本發(fā)明還提供一種慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑盒，所述試劑盒中含有上述診斷試劑。
[0011]本發(fā)明中涉及的慢性神經(jīng)退行性疾病包括但不限于傳染性海綿狀腦病(TSE)和阿茨海默癥(AD)等。
[0012]目前對于慢性神經(jīng)退行性疾病(尤其是海綿狀腦病和阿茨海默癥)，在無癥狀期和早期發(fā)病階段，還沒有找到行之有效的檢測手段。目前的檢測手段仍停留在發(fā)病后組織樣本的提取分析和死亡后的組織病理學(xué)檢測。由于目前沒有治愈這類疾病的方法，因此慢性神經(jīng)退行性疾病的早期診斷對于人和動物的健康具有十分重大的意義。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一種僅存在于腦組織中的蛋白N可溶性乙馬來酰亞氨融合蛋白附著蛋白β型(β-SNAPs)，其表達(dá)和含量變化可以指示慢性神經(jīng)退行性疾病的早期發(fā)生，并開發(fā)出檢測這種蛋白變化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，為慢性神經(jīng)退行性疾病的早期診斷和早期發(fā)現(xiàn)開辟了新思路，通過更深入的機(jī)理研究和損耗-時間曲線的建立，有助于將慢性神經(jīng)退行性疾病的損失降到最低。
[0013]本發(fā)明所采用的技術(shù)路線為:提取不同時間感染或未感染羊瘙癢因子263K的同日齡同性別倉鼠，轉(zhuǎn)基因阿茨海默癥模型小鼠或正常野生型小鼠的腦組織樣品，進(jìn)行二維電泳分析，通過專用軟件(例如，Mascot, version2.3.02, Matrix Sciences公司)分析找出相對含量有明顯變化的蛋白，進(jìn)行MALD1-T0F/T0F MS質(zhì)譜分析，獲得的串聯(lián)光譜通過專用軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，從而分析出蛋白的名稱和氨基酸序列。結(jié)合蛋白的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放和膜泡運(yùn)輸?shù)牡鞍爪?SNAPs具有重要的研究意義。隨后通過蛋白印跡(Western Blot)對樣品中的β-SNAPs進(jìn)行定量分析,從而確定并印證了 β-SNAPs在腦組織中的早期含量降低變化和漸進(jìn)性的損耗。并將Western Blot對β -SNAPs的定量檢測作為早期發(fā)現(xiàn)β -SNAPs含量變化的有效檢測方法之一。
[0014]本發(fā)明通過對朊蛋白感染的小鼠的腦組織進(jìn)行二維電泳，并對差異顯著的蛋白點(diǎn)進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)分析，共發(fā)現(xiàn)7個可作為在朊蛋白病早期診斷的潛在標(biāo)記物，同時Western Blot結(jié)果也證實(shí)了該結(jié)果。這為朊蛋白病的早期診斷和病理機(jī)制研究提供了新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中敘利亞倉鼠腦組織蛋白組二維電泳膠圖；其中，箭頭指向質(zhì)譜成功鑒定的蛋白。
[0016]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中對照組和實(shí)驗(yàn)組中β -SNAPs蛋白在二維凝膠上的變化。
[0017]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中Western Blot檢測β -SNAPs的變化量，結(jié)果符合二維電泳結(jié)果。使用α /β -SNAPs兔多克隆抗體、ant1-actin單克隆抗體,A圖中左側(cè)三列為攻毒后四周、六周、八周β-SNAP表達(dá)量，右側(cè)三列為對應(yīng)時期PBS對照組的β-SNAP表達(dá)量，再與β-actin進(jìn)行相對含量比較。B圖數(shù)據(jù)分析得出β-SNAPs相對變化量和相對變化趨勢。
[0018]圖4為2-D標(biāo)準(zhǔn)蛋白參考圖；圖中選用pH值4-7的IPG膠條，a.Mw (kDa) 77pI6/6.3/6.6, b.Mw (kDa) 66.2pI5.4/5.6，c.Mw (kDa) 43p15/5.1，d.Mw (kDa)36pI8.3/8.5, e.Mw (kDa)29pI5.9/6, f.Mw (kDa)21.5pI4.6,g.Mw(kDa) 17.6pI6.8/7.3。A圖為標(biāo)準(zhǔn)蛋白單獨(dú)進(jìn)行二維電泳的蛋白分布圖，B圖為標(biāo)準(zhǔn)蛋白說明書參考對照圖。
[0019]圖5為β -SNAPs的“損耗-時間曲線”圖。
[0020]圖6為MALDL-T0F質(zhì)譜鑒定胰蛋白酶消化的β -SNAPs，標(biāo)注肽段符合β -SNAPs肽段質(zhì)量理論值。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0022]實(shí)施例1慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物β -SNAPs的發(fā)現(xiàn)
[0023]1.腦組織樣品的制備
[0024]對敘利亞倉鼠腦組織注入性狀穩(wěn)定、性能確定的羊瘙癢因子263Κ。將由此感染癢病的倉鼠的腦勻漿50 μ I注入剛斷奶的若干只敘利亞倉鼠腦內(nèi)。用同樣劑量的PBS注入同日齡同性別的倉鼠腦內(nèi)作為對照。分別在注入后第4、6、8周，選擇無組織形態(tài)學(xué)變化的倉鼠和對照組倉鼠，對其進(jìn)行安樂死，提取其腦組織并保存在-80°C冰箱中。12月齡的雌性阿茨海默癥轉(zhuǎn)基因小鼠(The Jackson Laboratory) [B6C3_Tg(APPSWE, PSENldE9)85Dbo/Mmjax mice]及合適的野生型正常對照小鼠的腦組織，同樣在提取后保存在_80°C冰箱中。
[0025]2.樣品處理
[0026]用含有全組分蛋白酶抑制劑混合物(Roche公司)的裂解緩沖液[7M尿素，2M硫尿，2% (w/v) CHAPS,0.2% (v/v)兩性載體，65mM 二硫蘇糖醇(DTT)]使倉鼠的腦組織樣品懸浮并勻漿均勻。在4°C下對腦勻漿進(jìn)行12個循環(huán)的超聲(25%振幅)破碎處理(每個循環(huán):超聲Is停5s)。在冰上放置30s后，25000 Xg離心Ih (4°C)。用2_D定量試劑盒(GEHealthcare公司)對離心后上清中的蛋白含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。以每份樣品中含450 μ g蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，分裝保存在_80°C中，以備二維凝膠電泳和Western Blot使用。
[0027]3.二維凝膠電泳
[0028]對上述步驟中的腦組織蛋白樣品進(jìn)行再水化。水化緩沖液[7M尿素，2M硫脲，2%(w/v) CHAPS, 0.5%(v/v)兩性載體，3%(w/v)DTT，0.002%(v/v)溴酚藍(lán)]加入蛋白樣品中使得總體積為450μ1。加入到24cm長的固定ρΗ4-7(非線性)梯度條上(GE Healthcare公司)，于室溫放置18h。通過以下步驟進(jìn)行等點(diǎn)聚焦(IEF):250V2h, 1000V2h，5000V2h，3h漸進(jìn)增至 10000V (Hoefer IEF100 系統(tǒng))。樣品條在 0.5mM PH6.8Tris_HCl 緩沖液(6M 尿素，30%甘油，2%SDS，2%DTT)中平衡18min，然后，將緩沖液成分DTT換成2.5%碘乙酰胺后再平衡15min。將樣品條轉(zhuǎn)移至12.5%SDS_PAGE凝膠中(Hoefer SE900系統(tǒng))進(jìn)行第二向電泳分離，I瓦/膠電泳5h,2瓦/膠電泳30h。完成后取出凝膠,在固定液(50%甲醇,5%乙酸)中固定Ih后，在考馬斯亮藍(lán)染色液(20%甲醇，10%磷酸，10%硫酸銨，0.125%考馬斯G-250)中染色過夜。
[0029]4.圖像分析
[0030]染色后凝膠用掃描儀(UMAX Power Look2100XL_USB)在500dpi下進(jìn)行掃描。圖像通過Dymension software專用分析軟件(Syngene公司)進(jìn)行分析。對至少3次相互獨(dú)立的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。選擇光強(qiáng)度差異在1.5倍或以上的蛋白點(diǎn)(p〈0.05)，用以進(jìn)行下一步質(zhì)譜分析，其中包括β-SNAPs蛋白。
[0031]5.質(zhì)譜儀分析及β-SNAPs的發(fā)現(xiàn)
[0032]從凝膠上切下被選擇的蛋白點(diǎn)，置于1.5mL的Eppendorf管中，三蒸水沖洗兩遍，用IOOmM碳酸氫銨沖洗數(shù)次，再用100%純乙腈脫水，置于冷凍真空干燥泵中冷凍干燥。每個樣品管中加入50μ L含IOMmDTT的IOOmM碳酸氫銨，57°C還原作用lh，待室溫冷卻后去掉過量液體，隨后迅速加入用IOOmM碳酸氫銨新鮮配制的55mM IAA，室溫暗處放置烷基化30min。反應(yīng)完成后用IOOmM碳酸氫銨沖洗2次，再用純乙腈脫水后加入等體積的IOOmM碳酸氫銨凍干。每管用25yL胰蛋白酶進(jìn)行消化，37°C過夜。用5%三氟乙酸(TFA)/50%乙腈(ACN)萃取兩次,每次15min,合并萃取液凍干。向萃取后凍干的樣品中加入0.8 μ L基質(zhì) CHCA( α -cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)溶液(0.5g/L,溶劑 0.1%TFA/50%ACN),上MALDL靶板，在室溫下自然干燥。另外，點(diǎn)0.5yL未加樣品的0.5g/L CHCA溶液作為空白對照。用MALD1-T0F/T0F高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。MS結(jié)束后直接選擇與對照基質(zhì)的PMF圖有差異、質(zhì)量范圍700-3200Da和最小信噪比為20的肽段進(jìn)行MS/MS分析。串聯(lián)光譜用Mascot, version2.3.02 (MatrixSciences公司)軟件對NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索以確定蛋白的名稱和氣基酸序列，MSCOT對蛋白的評分不小于59分視為鑒定成功的蛋白。若一個蛋白點(diǎn)檢測出多個蛋白，結(jié)合2-D標(biāo)準(zhǔn)蛋白(寶生物工程有限公司)(圖4)估計(jì)其的分子質(zhì)量并進(jìn)行Pl檢驗(yàn)，選擇分?jǐn)?shù)較高的蛋白。
[0033]共發(fā)現(xiàn)7個可作為在朊蛋白病早期診斷的潛在標(biāo)記物(包括β -SNAPs蛋白)，表1所示為成功鑒定的蛋白信息。
[0034]表1通過MALD1-T0F/T0F MS分析鑒定出表達(dá)的不同蛋白
【權(quán)利要求】
1.慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物為β型可溶性NSF附著蛋白β-SNAPs，其氨基酸序列如Seq ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)志物，其特征在于，所述慢性神經(jīng)退行性疾病包括但不限于傳染性海綿狀腦病和阿茨海默癥。
3.權(quán)利要求1所述標(biāo)志物在制備慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，以β-SNAPs作為免疫原，通過免疫動物，獲得相應(yīng)抗體，將制備的抗體作為診斷試劑或診斷試劑中的有效成分。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述慢性神經(jīng)退行性疾病包括但不限于傳染性海綿狀腦病和阿茨海默癥。
6.慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑，其特征在于，其是以β-SNAPs作為免疫原，通過免疫動物，獲得的相應(yīng)抗體即為診斷試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的診斷試劑，其特征在于，所述慢性神經(jīng)退行性疾病包括但不限于傳染性海綿狀腦病和阿茨海默癥。
8.慢性神經(jīng)退行性疾病早期診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中含有權(quán)利要求6或7所述的診斷試劑。
【文檔編號】G01N27/64GK103869080SQ201410081695
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】楊利峰, 趙德明, 林竹, 付永瑤, 尹曉敏, 周向梅, 趙化粉 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)