特異性IgE抗體的檢測方法、該方法所使用的試劑盒以及該試劑盒的制備和使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種特異性IgE抗體的檢測方法、該方法所使用的試劑盒以及該試劑盒的制備和使用方法，該特異性IgE檢測方法采用捕獲法-酶聯(lián)免疫檢測模式，用抗人-IgE抗體包被酶標反應板，生物素標記的抗原，根據(jù)需要任意選擇生物素化抗原，如待檢血清中存在相應的sIgE，此sIgE將同時與微孔板上包被的抗人IgE抗體和液相中的生物素標記抗原結(jié)合，再用酶標記的鏈霉親和素溶液與生物素結(jié)合，通過加入顯示底物，通過測定吸光度后來確認過敏原種類。試劑盒中至少包括包被有抗人IgE抗體的酶標板和多種生物素化已知過敏原。本發(fā)明的有益效果是該IgE檢測方法便于檢測人員根據(jù)需要靈活選擇過敏原項目組合，提高了檢測試劑的通用性和利用率，簡化試劑盒的制備工藝。
【專利說明】特異性IgE抗體的檢測方法、該方法所使用的試劑盒以及該試劑盒的制備和使用方法
【技術(shù)領域】
[0001]本技術(shù)發(fā)明涉及一種特異性IgE抗體的檢測方法、該方法所使用的試劑盒以及該試劑盒的制備和使用方法，特異性IgE抗體的檢測方法的顯著特征是采用捕獲法-酶聯(lián)免疫分析模式，能夠根據(jù)患者病史選擇疑似過敏食物進行組合，實現(xiàn)“個性化組合”模式的血清特異性IgE檢測，尤其適用于因食物導致過敏的患者進行確認過敏原種類。
【背景技術(shù)】
[0002]食物過敏已成為一類常見的食源性疾病，可引起的主要臨床癥狀有頭暈、頭痛、胸悶、惡心、嘔吐、皮膚瘙癢等，嚴重時發(fā)生休克甚至死亡，已經(jīng)引起了人們的普遍關注。具有過敏體質(zhì)的機體接觸相應過敏原的情況下，誘導特異性免疫反應并產(chǎn)生特異性抗體(免疫球蛋白E，IgE), IgE能結(jié)合肥大細胞或嗜堿性粒細胞，并使機體處于致敏狀態(tài)，同時此種抗體也分布在血漿中。因此，血漿(清)特異性IgE (slgE)是過敏性疾病的重要特征，臨床上常通過檢測血清中存在何種slgE抗體來推斷或確認過敏原，也就是說，血清特異性IgE(slgE)是確認過敏原的重要依據(jù)之一。眾所周知，導致過敏的物質(zhì)種類繁雜，特別是吸入性過敏原和食入性過敏原，而測定前并不知道患者對何種過敏原過敏。因此，臨床工作需采用一系列過敏原聯(lián)合測定模式，此種方法能夠提高檢出效率，并能節(jié)省人力和物力。
[0003]因食物所致過敏反應存在某些特殊性，患者往往是食用某種食物或含有某種食物的食品情況下才會導致某些癥狀，這些食物可被患者感知。因此，食物過敏的患者往往能夠根據(jù)病史給臨床醫(yī)生提供一些有價值的信息，幫助臨床醫(yī)生鎖定幾種高度疑似的食物作為檢測對象，而不需要按照常規(guī)將所有可檢測的所有食物納入檢測范圍，這樣可以減輕患者的檢測費用，節(jié)約有限的醫(yī)學資源。
[0004]不同受檢患者病史不同，疑似需檢測過敏食物的組合不同。在此種情況下，臨床需要一種能夠?qū)崿F(xiàn)“個性化組合”過敏原檢測試劑，滿足食物過敏性疾病患者確認過敏原的特殊要求。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)中確認過敏原的血清slgE檢測法采用免疫化學原理，即用已知抗原檢測未知抗體。
[0006]其中，放射性過敏原吸附試驗是血清SlgE檢測最經(jīng)典的方法。該方法是將已知過敏原包被在固相材料(硝酸纖維膜，NC膜)表面，與待檢血清(含slgE)溫育后，再加上放射性核素標記抗人IgE (標記二抗)溫育。如血清中含有與過敏原對應的特異性抗體，固相材料表面即形成已知抗原-待檢抗體-放射性核素標記抗人IgE復合物(如牛奶-牛奶特異性IgE-抗人IgE);用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌NC膜，去除未結(jié)合標記抗體。再用放射性檢測儀檢測NC膜表面是否具有放射活性即可判斷血清中是否存在特異性IgE抗體。該方法的缺陷是:放射性過敏原吸附試驗時，每次試驗只能檢測一種過敏原，不能同時檢測多種過敏原，并且此種方法存在放射性核素污染等問題，臨床已不再使用。
[0007]“膜斑點印記”是目前被臨床廣泛使用的方法之一，可同時檢測多種過敏原。此方法以“條狀”NC膜作為固相載體，以線性方式于NC膜不同物理位置包被一系列食物蛋白提取液作為已知抗原。包被有抗原的NC膜于反應池內(nèi)與稀釋待檢血清溫育，血清中待檢slgE分別與相應抗原結(jié)合；再加入酶標抗體(抗人IgE)，與結(jié)合在膜表面的slgE結(jié)合；洗滌去除游離的標記抗體，加入顯色底物即可根據(jù)NC膜的顯色條帶，結(jié)合參照標尺(過敏原包被信息)確定待檢樣本含有何種slgE。膜斑點印記法可同時檢測10-12種食物過敏原，但組合方式固定，不能根據(jù)患者情況進行“隨機”組合，不能滿足食物過敏原“個性化組合”的要求。同時，此方法操作復雜、耗時，且不能準確測定slgE的含量。
[0008]酶聯(lián)免疫吸附試驗因具有操作簡單、適合基層實驗室等優(yōu)點，深受臨床實驗室歡迎。酶聯(lián)免疫方法也用于食物過敏原slgE檢測，杭州浙大基因工程有限公司申請一項技術(shù)發(fā)明專利(申請?zhí)?00710157167.9)公開一種酶聯(lián)免疫法:過敏原特異性IgE ELISA檢測試劑盒及其制備方法。此項發(fā)明是用一組過敏原分別包被96孔酶標反應板特定位置(孔)，但過敏原的組合方式固定。待檢稀釋血清分別加入各個反應孔內(nèi)，溫育后洗板；再加入酶標抗體(抗人IgE)，與結(jié)合在微孔表面的slgE結(jié)合；洗滌去除游離的標記抗體，加入顯色底物，通過酶標儀讀取吸光度值，根據(jù)吸光度值參照標準曲線可以對待檢slgE水平進行定量。與膜斑點印記法相比，酶聯(lián)免疫法操作簡單，結(jié)果容易判讀，但同樣采用固定組合方式，不能根據(jù)患者情況進行“隨機”組合，不能滿足食物過敏原“個性化組合”的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供一種特異性IgE抗體的檢測方法，能根據(jù)食物過敏患者病史進行疑似食物“隨機”組合的特異性IgE抗體的檢測方法和相關試劑，以滿足食物過敏原“個性化組合”的要求。
[0010]該方法采用捕獲法-酶聯(lián)免疫檢測模式，具體方式為:(I)用抗人-1gE抗體包被酶標反應板取代用過敏原直接包被酶標反應板的間接法-酶聯(lián)免疫檢測模式；(2)將食物過敏原提取溶液(即已知抗原)標記生物素分子，形成生物素標記的抗原；(3)在檢測slgE時，首先根據(jù)患者病史確定疑似食物過敏原種類和測試孔的數(shù)量，每種食物過敏原使用I個檢測孔，每孔加入相應的生物素標記的抗原溶液，同時加入待檢血清；如血清中存在與生物素標記的抗原對應的slgE，此待檢slgE將同時與該對應的生物素化抗原和酶標反應板表面包被的抗人IgE抗體結(jié)合；(4)洗滌去除微孔板中未結(jié)合的生物素標記抗原，再加入酶標記的鏈霉親和素溶液，使之與生物素結(jié)合，如果待檢血清中存在與生物素標記的抗原對應的slgE,微孔板表面將形成抗人IgE-待檢slgE-已知生物素標記抗原-鏈霉親和素-酶復合物；(5)最后加入顯色底物，終止催化反應后用酶標儀讀取吸光度值，即可確定過敏原種類。
[0011]本發(fā)明中特異性IgE抗體的檢測方法的優(yōu)勢為:1.克服了傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法直接包被或間接分析模式不能滿足患者“個性化”檢測需求的不足，便于檢測人員根據(jù)需要靈活選擇過敏原項目組合，提高了檢測試劑的通用性和利用率，特別適合于食物過敏原的確認；2.簡化試劑盒的制備工藝，現(xiàn)有產(chǎn)品需要將96孔酶標反應板各孔分別包被不同的食物蛋白，并做好標記，然后根據(jù)需要進行組裝；本技術(shù)發(fā)明提供的酶標反應板所包被的抗人IgE，可與血清中各種食物過敏原的待檢特異性IgE結(jié)合，且包被程序完全相同，如此改進大幅度簡化酶標板的制備工藝，降低生產(chǎn)成本，也防止出現(xiàn)過敏原組裝錯誤影響檢測結(jié)果的事情。
[0012]本發(fā)明還提供一種應用本發(fā)明特異性IgE抗體的檢測方法所使用的試劑盒，該試劑盒至少包括:(I)包被有抗人IgE抗體的酶標板；(2)多種生物素化食物過敏原，涵蓋牛奶、禽蛋、蟹、蝦、花生、豆類、堅果等常見過敏性食物，如遇見罕見食物過敏原，可根據(jù)用戶需求特殊制備或臨床實驗室自己制備。
[0013]試劑盒中還可包括酶標記鏈霉親和素；血清標本稀釋液；陽性對照血清；陰性對照血清；酶顯色底物；終止液；濃縮洗液。
[0014]其中酶標板優(yōu)選96孔聚苯乙烯酶標板；鏈霉親和素為辣根過氧化物標記的鏈霉親和素；酶顯色底物中顯色底物A含雙氧水，顯色底物B含四甲基聯(lián)苯胺，酶顯色底物、終止液和濃縮洗液均為常規(guī)酶聯(lián)免疫試劑盒中常用的試劑。
[0015]試劑盒的制備方法:(I)將抗人IgE抗體以常規(guī)手段包被至酶標板上，真空包裝；
(2)配制酶標記鏈霉親和素；(3)常規(guī)方法制備各組生物素化抗原；(4)配制標本稀釋液；
(5)制備陽性對照血清:篩選過敏患者血清，稀釋并加防腐劑；(6)制備陰性對照血清:篩選無過敏史，且血清總IgE低于30IU/毫升的血清，稀釋并加防腐劑；(7)將(I)至(6)中制備的試劑和常規(guī)酶聯(lián)免疫試劑盒中常用酶顯色底物、終止液和濃縮洗液裝入試劑盒內(nèi)。
[0016]該試劑盒的使用方法:(I)準備過程:①將盒中試劑和待測樣本平衡至室溫；②將待測樣本用血清樣本稀釋液稀釋10倍；③濃縮洗液用蒸餾水稀釋25倍備用；④根據(jù)待測樣本檢測要求，選擇幾種生物素化抗原，在酶標反應板上做好標記；(2)檢測過程:①將選中的生物素化抗原分別加入微孔反應板所對應的標記位置，同時加入稀釋后的待檢血清；
②陽性對照孔內(nèi)加入一種生物素化抗原和陽性對照血清稀釋液，為了標記和加樣操作的方便，生物素化抗原與陽性對照血清稀釋液的加入量相等；③陰性對照孔內(nèi)加入一種生物素化抗原和陰性對照血清稀釋液，為了確保對應關系，加入陰性對照孔中的生物素化抗原最好與陽性對照組中的生物素化抗原相同，其中所加入的生物素化抗原與陰性對照血清稀釋液的加入量相等；④將酶標反應板于37°C溫育，60min，取出反應板，用稀釋后濃縮洗液對其進行反復洗滌各反應孔分別加入酶標記鏈霉親和素溶液；37°C溫育，30min，取出反應板，用稀釋后濃縮洗液對其進行反復洗滌；⑥加入酶顯色底物，避光室溫反應15min ;再加入終止液終止顯色反應，15min內(nèi)檢測450nm吸光度值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是捕獲法-酶聯(lián)免疫模式食物特異性IgE檢測原理示意圖；
[0018]圖中:1_聚苯乙烯微孔板(96)單個孔；2-抗人IgE ;3_待檢特異性IgE (slgE)；4-食物過敏原提取溶液(已知抗原)；5-生物素；6_鏈霉親和素；7_辣根過氧化物酶。
【具體實施方式】
[0019]現(xiàn)具體說明本發(fā)明中試劑盒的制備方法:1、制備酶標反應板:①購買市售的羊抗人IgE多克隆抗體，將其用磷酸鹽緩沖液(pH7.40.1M)進行1:500稀釋；②每孔加入1:500稀釋的羊抗人IgE，體積150μ 1，將酶標反應板放在密封的容器內(nèi)，37°C，溫浴3h，置于4°C過夜；③甩凈包被液，用磷酸鹽緩沖液洗酶標板3次，300 μ I/孔，最后一次拍干每孔加入1%牛血清白蛋白溶液，體積250 μ I ;將微孔板放在密封的容器內(nèi)，置室溫4小時，置于4°C過夜；⑤重復步驟③；⑥將反應板真空干燥至少6h,取出后放置于干燥室,及時真空包裝;
[0020]2、配制酶標記鏈霉親和素:購買商品化辣根過氧化物標記的鏈霉親和素，按說明書稀釋至工作濃度，按每瓶12ml分裝即可；
[0021]3、制備生物素化抗原溶液:購買各種食物過敏原溶液，用于標記生物素，標記生物素過程按常規(guī)方式進行:①將純化好的用于檢測特異性抗體的過敏原調(diào)整為適當濃度，用
0.1M，pH9.5的NaHCO3緩沖液透析，過夜并于280nm處測吸光度值，計算抗體總量；②將活化的生物素溶于DMF中，按照生物素與抗體的摩爾比為20:1的比例將二者混合反應Ih將反應后的液體用0.lmol/L PBS于4°C透析24小時，即制成生物素化的抗原溶液；④每種候選的過敏原標記生物素后，分別裝于試劑瓶中，與抗人IgE酶標反應板配套使用；
[0022]4、配制標本稀釋液:0.lmol/L PBS (磷酸鹽緩沖液)800ml ;Tween_20 (吐溫20) 5g(5g/1000ml) ；BSA (牛血清白蛋白)20g (2g/100ml);調(diào) pH 至 7.4，用 ddH20 定容至 IL ；
[0023]5、制備陽性對照血清:篩選20份以上牛奶過敏患者血清，用pH7.40.1M磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，并加入防腐劑配制陽性對照血清，按Iml每瓶進行分裝；
[0024]6、制備陰性對照血清:篩選20份以上無過敏史，且血清總IgE低于30IU/毫升血清，用pH7.40.1M磷酸鹽緩沖液稀釋10倍，并加入防腐劑配制陰性對照血清，按Iml每瓶進行分裝；
[0025]7、顯色底物、終止液和濃縮洗液均為市售產(chǎn)品。
[0026]食物過敏原血清特異性IgE試劑盒具體使用方法:
[0027]1、準備步驟:①將試劑盒中的試劑和臨床待檢樣本從冰箱內(nèi)取出并平衡至室溫；
②用血清樣本稀釋液將待檢血清或血漿稀釋10倍(100微升標本+900微升標本稀釋液)；
③濃縮洗液用蒸餾水稀釋25倍備用；④根據(jù)待檢樣本檢測要求，選擇生物素化抗原(即生物素化過敏原)的種類并在酶標反應板上做好標記。
[0028]2、檢測步驟:
[0029]①將選中的選擇生物素化抗原對應反應板上的標記分別加入相應的微孔內(nèi)，50微升/孔/種；如1#待檢樣本需檢測牛奶、禽蛋和花生;2#待檢樣本需檢測禽蛋、豆類，則選擇微孔板5個孔作為試驗孔(96孔板的A1-A5)，如Al加入50微升生物素化牛奶抗原溶液；A2加入50微升生物素化禽蛋抗原溶液；A3加入50微升生物素化花生抗原溶液；A4加入50微升生物素化禽蛋抗原溶液；A5加入50微升生物素化豆類抗原溶液；同時，于A1、A2、A3孔加入稀釋后的1#待檢樣本；于A4、A5孔加入稀釋后的2#待檢樣本；
[0030]陽性對照孔:50微升生物素化牛奶抗原溶液+50微升陽性對照血清(含牛奶特異性IgE)，陽性對照需重復3次；
[0031]陰性對照孔:50微升生物素化牛奶抗原溶液+50微升陰性對照血清(不含牛奶特異性IgE)，陰性對照需重復3次；
[0032]②37°C溫育，60min ;
[0033]③取出反應板，用稀釋后洗液洗滌5次，最后一次拍干；
[0034]④各孔加入100微升酶標記鏈霉親和素溶液；37°C溫育，30min ；
[0035]⑤取出反應板，用稀釋后洗液洗滌5次，最后一次拍干；
[0036]⑥常規(guī)加入顯色液A、B各50 μ L,避光室溫反應15min ;再加入終止液50 μ L,混勻，15min內(nèi)用酶標儀讀取450nm吸光度值。
[0037]3、實驗結(jié)果:
[0038](I)判斷方法:首先，根據(jù)陰性對照孔的光密度值(OD)確定臨界值，臨界值(cutoff) =2.1倍陰性對照OD均值(如陰性對照孔低于0.05者，按0.05計算)；其次，檢查陽性對照孔的光密度值(0D)，是否大于5倍陰性對照均值，并確定本次測定程序是否正常。
[0039](2)判定標準:待測標本OD值>臨界值為陽性，待測標本OD值<臨界值為陰性。過敏食物種類由加入的生物素抗原種類而定。
[0040](3)試驗數(shù)據(jù)分析:
[0041]3 孔陰性對照 OD:0.076 ；0.084 ；0.068，均值為 0.076 ；
[0042]臨界值(cutoff) =2.1 X 0.076=0.160 ；
[0043]3 孔陽性對照 OD:0.981 ；0.909 ；0.965，均值為 0.952 ；
[0044]陽性對照OD均值大于5.0 X 0.076=0.800，確認測定程序正常；
[0045]Al 孔 OD:0.089---------牛奶陰性； [0046]A2 孔 OD:0.265---------禽蛋陽性；
[0047]A3 孔 OD:0.070---------花生陰性；
[0048]A4 孔 OD:0.101---------禽蛋陰性；
[0049]A5 孔 OD:0.362---------豆類陽性。
[0050](4)結(jié)論:1#患者對禽蛋過敏；2#患者對豆類過敏。
[0051]以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.特異性IgE抗體的檢測方法，其特征在于:包括如下步驟:(I)用抗人-1gE抗體包被酶標反應板；(2)將已知抗原標記生物素分子，形成生物素標記的抗原；(3)在檢測slgE時，根據(jù)患者病史確定疑似食物過敏原種類和需要檢測孔的數(shù)量；根據(jù)選定的過敏原選擇對應的生物素化抗原，每種生物素化抗原分別加入酶標反應板上的不同檢測孔中，檢測孔再中分別加入待檢血清樣本；如樣本中存在與生物素標記的抗原對應的slgE，此待檢slgE將同時與該對應的生物素化抗原和酶標反應板表面包被的抗人IgE抗體結(jié)合；(4)洗滌去除檢測孔中未結(jié)合的生物素標記抗原，再加入酶標記的鏈霉親和素溶液，使之與生物素結(jié)合，如果待檢樣本中存在與生物素標記的抗原對應的slgE，檢測板表面將形成抗人IgE-待檢slgE-已知生物素標記抗原-鏈霉親和素-酶復合物；(5)最后加入顯色底物，終止催化反應后用酶標儀讀 取吸光度值，即可確定過敏原種類。
2.應用權(quán)利要求1所述的特異性IgE抗體的檢測方法所使用的試劑盒，其特征在于:至少包括如下試劑:(I)包被有抗人IgE抗體的酶標反應板；(2)多種生物素化抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述生物素化抗原包括生物素化的牛奶、禽蛋、蟹、蝦、花生、豆類、堅果抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其特征在于:還包括酶標記鏈霉親和素；血清標本稀釋液；陽性對照血清；陰性對照血清；酶顯色底物；終止液；濃縮洗液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于:鏈霉親和素為辣根過氧化物標記的鏈霉親和素；酶顯色底物包含顯色底物A和顯色底物B，其中顯色底物A含雙氧水，顯色底物B含四甲基聯(lián)苯胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述酶標反應板為96孔聚苯乙烯酶標反應板。
7.權(quán)利要求2至6中任一項所述的試劑盒的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:(I)將抗人IgE抗體以常規(guī)手段包被至酶標反應板上，真空包裝；(2)配制酶標記鏈霉親和素；(3)常規(guī)方法制備各組生物素化抗原；(4)配制血清標本稀釋液；(5)制備陽性對照血清:篩選過敏患者血清，稀釋并加防腐劑；(6)制備陰性對照血清:篩選無過敏史，且血清總IgE低于30IU/毫升的血清，稀釋并加防腐劑；(7)將(I)至(6)中制備的試劑和常規(guī)酶聯(lián)免疫試劑盒中常用酶顯色底物、終止液和濃縮洗液裝入試劑盒內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至6中任一項所述的試劑盒的使用方法，其特征在于:包括如下步驟:(1)準備過程:①將盒中試劑和待測血清樣本平衡至室溫將待測血清樣本用血清樣本稀釋液稀釋濃縮洗液用蒸餾水稀釋備用根據(jù)待測血清樣本檢測要求，選擇幾種生物素化抗原，在酶標反應板上做好標記；(2)檢測過程:①將選中的生物素化抗原分別加入酶標反應板所對應的標記位置，同時加入稀釋后的待檢血清；②陽性對照孔內(nèi)加入任意一種生物素化抗原和陽性對照血清稀釋液；③陰性對照孔內(nèi)加入任意一種生物素化抗原和陰性對照血清稀釋液；④將酶標反應板于37°C溫育，60min，取出反應板，用稀釋后濃縮洗液對其進行反復洗滌各反應孔分別加入酶標記鏈霉親和素溶液；37°C溫育，30min，取出反應板，用稀釋后濃縮洗液對其進行反復洗滌；⑥加入酶顯色底物，避光室溫反應15min ;再加入終止液終止顯色反應，15min內(nèi)檢測450nm吸光度值。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒使用方法，其特征在于:陽性對照孔中加入的生物素化抗原與陽性對照血清稀釋液的加入量相等。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒使用方法，其特征在于:陰性對照孔中加入的生物素化抗原與陽性對照孔中加入的生物素化抗原的種類相同，陰性對照孔中加入的生物素化抗原與陰性對照血清稀釋液的 加入量相等。
【文檔編號】G01N33/531GK103837674SQ201410082987
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】李會強, 朱黎娜, 侯麗英, 張盈瑩, 楊維利, 呼蓓蓓 申請人:天津醫(yī)科大學