一種檢測玉米赤酶烯酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，是采用Mannich法制備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，并獲得相應(yīng)的多抗血清，血清經(jīng)過分離純化后，間接ELISA檢測其效價；然后將檢測抗原包被于酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋后的多抗；反應(yīng)后，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止后，在450nm處檢測OD值，繪制相關(guān)標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，有益效果：更有效的利用參加反應(yīng)的毒素分子，從而節(jié)省成本；整個過程簡便、易于操作、毒素分子的利用率也相對較高；該檢測方法操作簡便，無需專業(yè)人員培訓(xùn)，便于實地生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利說明】一種檢測玉米赤酶烯酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種檢測真菌毒素的方法，特別涉及一種檢測玉米赤酶烯酮的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由粉紅鐮刀菌和其他鐮刀菌產(chǎn)生的一種激素類真菌毒素，常見于玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物中，它可引起各種谷物的病變，有類似雌激素的毒作用，可刺激含雌激素受體的乳腺癌細胞增長，導(dǎo)致動物激素水平過高以及嚴重的生殖問題，還具有潛在的致癌性。目前用于檢測玉米赤酶烯酮的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法。薄層色譜法檢測方便，但檢測限高，不能很好的定量；高效液相色譜法檢測準確、檢測低，但需要復(fù)雜的樣品前處理過程、專門的儀器以及專業(yè)的人員培訓(xùn)；前述的這些方法均存在著一些不足，不能有效快速地測出相應(yīng)谷物中所含有的玉米赤霉烯酮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的檢測玉米赤酶烯酮的方法中存在的一些問題而提供的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法。
[0004]本發(fā)明所述的檢測玉米赤酶烯酮的方法是采用Mannich法制備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，并獲得相應(yīng)的多抗血清，血清經(jīng)過分離純化后，間接ELISA檢測其效價；然后將檢測抗原包被于酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋后的多抗；反應(yīng)后，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止后，在450nm處檢測OD值，繪制相關(guān)標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，具體步驟如下所述:
[0005]第一步、制備陽離子化蛋白，主要制備陽離子化牛血清蛋白cBSA和陽離子化雞卵清蛋白cOVA ；
[0006]第二步、采用Mannich法制備免疫抗原ZEN_cBSA和檢測抗原ZEN_cOVA ；
[0007]第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化后腹腔注射，每只鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之后加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，采用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫后10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0008]第四步、小鼠在最后一次免疫后的第10天,摘眼球取血,處死小鼠；所獲血液先置于室溫下2h，然后在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之后的血清凍存于_20°C的冰箱中；
[0009]第五步、純化離心后的血清，間接ELISA確定血清效價；
[0010]第六步、檢測抗原包被于酶標板上，在4°C條件下過夜；
[0011]第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15;[0012]第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應(yīng)2h ；
[0013]第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋后的血
清上清；
[0014]第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應(yīng)；
[0015]第十一步、洗滌，加入底物液顯色；
[0016]第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應(yīng)孔OD值。
[0017]第二步中制備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數(shù)比的范圍為10:1-20:1。
[0018]第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，不會迅速擴散，免疫的抗原劑量為IOOyg/只。
[0019]第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數(shù)，而陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空自)/ (Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0020]第六步中檢測抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋到 2 μ g/mL。
[0021]第九步中封閉過的酶標板能夠直接用于檢測玉米赤酶烯酮，血清上清按照效價/2的倍數(shù)稀釋后加入，也可以凍存于_20°C下，便于以后隨時進行檢測。
[0022]本發(fā)明的有益效果:
[0023]1、毒素免疫和檢測偶聯(lián)的蛋白選用陽離子化的蛋白，即陽離子化牛血清蛋白(cBSA)和陽離子化雞卵清蛋白(cOVA)，陽離子化蛋白較正常蛋白可以結(jié)合更多的毒素分子，同時更有效的利用參加反應(yīng)的毒素分子，從而節(jié)省成本；
[0024]2、偶聯(lián)方法選擇Mannich法，而非傳統(tǒng)的活性酯法和酸酐法。傳統(tǒng)的方法往往需要先對毒素分子進行肟化，而肟化往往伴隨較為復(fù)雜的有機反應(yīng)。肟化過程不僅需要引入各種有毒有害試劑、過程繁瑣，而且毒素有可能在這個過程中損失，影響后期偶聯(lián)的效率。Mannich法則省去了較為繁瑣的肟化過程，整個過程簡便、易于操作、毒素分子的利用率也相對較高；
[0025]3、此法較傳統(tǒng)的高效液相法，更易于操作，且特異性強；較薄層色譜法，檢測限低，易于定量；檢測抗原包被在酶標板上后，可凍存起來，便于后期樣品的檢測；且該檢測方法操作簡便，無需專業(yè)人員培訓(xùn)，便于實地生產(chǎn)應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為多抗血清間接競爭ELISA曲線圖，其中橫坐標為ZEN濃度的對數(shù)，ZEN濃度單位為ng/mL ;縱坐標為檢測孔OD值B與空白孔OD值BO的比值。
【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明所述的檢測玉米赤酶烯酮的方法是采用Mannich法制備玉米赤酶烯酮的免疫抗原和檢測抗原，免疫Balb/c小鼠，并獲得相應(yīng)的多抗血清，血清經(jīng)過分離純化后，間接ELISA檢測其效價；然后將檢測抗原包被于酶標板上，過夜、封閉，再加入標準毒素溶液、樣品提取液，以及稀釋后的多抗；反應(yīng)后，加入羊抗鼠IgG-HRP，再加入底物溶液顯色，終止后，在450nm處檢測OD值，繪制相關(guān)標準曲線，進而求出待測樣品中ZEN的含量，具體步驟如下所述:[0028]第一步、制備陽離子化蛋白，主要制備陽離子化牛血清蛋白cBSA和陽離子化雞卵清蛋白cOVA ；
[0029]第二步、采用Mannich法制備免疫抗原ZEN_cBSA和檢測抗原ZEN_cOVA ；
[0030]第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化后腹腔注射，每只鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之后加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，采用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫后10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0031]第四步、小鼠在最后一次免疫后的第10天,摘眼球取血,處死小鼠；所獲血液先置于室溫下2h，然后在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之后的血清凍存于_20°C的冰箱中；
[0032]第五步、純化離心后的血清，間接ELISA確定血清效價；
[0033]第六步、檢測抗原包被于酶標板上，在4°C條件下過夜；
[0034]第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15 ;
[0035]第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應(yīng)2h ；
[0036]第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋后的血
清上清；
[0037]第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應(yīng)；
[0038]第H^一步、洗滌，加入底物液顯色；
[0039]第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應(yīng)孔OD值。
[0040]第二步中制備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數(shù)比的范圍為10:1-20:1。
[0041]第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，不會迅速擴散，免疫的抗原劑量為IOOyg/只。
[0042]第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數(shù)，而陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空自)/ (Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0043]第六步中檢測抗原ZEN-cOVA使用100mmol/L pH=9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液稀釋到 2 μ g/mL。
[0044]第九步中封閉過的酶標板能夠直接用于檢測玉米赤酶烯酮，血清上清按照效價/2的倍數(shù)稀釋后加入，也可以凍存于_20°C下，便于以后隨時進行檢測。
[0045]具體實施過程如下所述:
[0046]一、制備多抗血清:
[0047]1、制備陽離子化蛋白:
[0048]取670 μ LIOOmmoI/L的乙磺酸(MES)溶液(ρΗ=4.8)置于冰浴中，加入相同體積的乙二胺(EDA)，然后用0.4mol/L的稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值為4.8，標記為A液；取500 μ L MES緩沖液，向其中加入50mg牛血清蛋白(BSA)和30mgl_ (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，標記為B液；將B液加入到A液，室溫下磁力攪拌反應(yīng)2h ;加入400μ L2mol/L的醋酸溶液終止反應(yīng)。蒸餾水中透析72h，得到的脫鹽的陽離子化牛血清蛋白(cBSA)冷凍干燥后，保存于_20°C，同樣的方法制備陽離子化雞卵清蛋白(cOVA)；
[0049]2、制備免疫抗原和檢測抗原:[0050]免疫抗原的制備:稱量600 μ g的cBSA作為偶聯(lián)物溶解于500 μ L MES溶液中，稱量IOOyg ZEN溶于50 μ L 二甲基甲酰胺(DMF)中；將ZEN溶液緩慢加入到cBSA溶液中，輕輕攪拌混合液，然后向混合液中加入50 μ L的甲醛，立即移入37°C培養(yǎng)箱中，輕輕攪拌反應(yīng)24h。用離心過濾純化裝置純化ZEN-cBSA結(jié)合物，重復(fù)2次，凍干后，保存于_20°C的冰箱中；
[0051]同樣的方法選擇cOVA作為偶聯(lián)物制備檢測抗原；
[0052]3、免疫小鼠:取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化后腹腔注射，每只鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之后加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，采用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫六次；從第三次免疫開始，每次免疫后十天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價；
[0053]4、最后一次免疫后，第10天，摘眼球取血，處死小鼠；血液室溫下靜止2h后，3500rpm離心20min,血清凍存于_20°C的環(huán)境下；
[0054]5、采用正辛酸法純化血清:抗血清用4倍體積的60mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋，用lOOmmol/L NaOH調(diào)至pH4.5 ;邊攪拌邊緩慢滴加辛酸(25mL/L血清稀釋液)，加完后，攪拌30min ；IOOOOrpm離心30min,收集上清；紗布過濾后，按1/10體積加入10XPBS,5mol/L NaOH調(diào)至pH7.4 ;上清液4°C預(yù)冷，計算總體積，按277g/L加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，加完后繼續(xù)攪拌30min ;5000rpm離心15min,棄去上清,收集沉淀；沉淀用少量透析液溶解，透析并更換兩次透析液；收集上清液，-20°C的條件下凍存；
[0055]6、間接ELISA檢測上清液效價:陽性孔的判斷標準為(A待檢樣品-A空白)/ (A陰性-A空θ) >=2.1，陽性孔的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
[0056]二、標準試樣制備:
[0057]1、洗滌液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入0.05%的吐溫-20 ；
[0058]2、封閉液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液加入1%牛血清白蛋白；
[0059]3、樣品稀釋液:在IOOmmoI/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入10%甲醇；
[0060]4、檢測抗原稀釋液:在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中加入0.05%的牛血清白蛋白 BSA ；
[0061]5、終止液:Imo I/L鹽酸溶液；
[0062]6、提取液:乙腈:7jC =85:15 (體積比)；
[0063]7、底物液:選擇 Invitrogen 公司的 TMB Single Solution ；
[0064]8、制備玉米赤酶烯酮抗體包被反應(yīng)板:用100mmol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液將ZEN-cOVA稀釋為2 μ g/mL,加到96孔酶標板中，每孔100 μ L，4°C冰箱放置過夜，棄去包被液，滿孔洗滌3次，每孔加200 μ L封閉液封閉，置于37°C 2h，棄其封閉液將包被板包裝后置-20°C冷凍保存；
[0065]9、制備玉米赤酶烯酮標準溶液:將樣品稀釋液為溶劑配制5_400ng/ml (5、10、20、30、50、100、200、400 )的赤酶烯酮標準系列溶液。
[0066]三、檢測樣品:
[0067]1、待測樣品前處理:稱取IOg粉碎且過20目篩的樣品置于磨口的IOOml錐形瓶中，加入乙腈-水(體積比85:15) 40ml，加塞振蕩30min，過濾即為待測樣液；[0068]2、反應(yīng)孔標記:1-6號孔為玉米赤酶烯酮(ZEA)標準對照孔，7號孔為空白對照孔，另根據(jù)需要設(shè)定待測樣品孔的數(shù)量；所有反應(yīng)孔設(shè)定平行樣；
[0069]3、根據(jù)標記依次加入配置好的標準溶液及待測樣液，在1-6號試管中加入玉米赤酶烯酮標準溶液50 μ L，在7號試管中加入50 μ L樣品稀釋液，在其余孔中分別加入待測樣液 50 μ L ;
[0070]4、在各孔中分別加入50 μ L按照(效價/2)倍比稀釋的多抗上清，輕輕地振蕩，使各孔中的反應(yīng)物混勻；
[0071]5、將酶標板置于37°C恒溫箱中孵育Ih ；
[0072]6、取出酶標板，甩掉反應(yīng)液，拍干，洗滌液滿孔洗滌，振蕩3min后，甩凈，拍干，重復(fù)洗板3次；
[0073]7、酶標板反應(yīng)孔每孔加入1:5000倍比稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，置于37°C恒溫箱中孵育Ih ；
[0074]8、取出酶標板，甩掉反應(yīng)液，拍干，洗滌液滿孔洗滌，振蕩3min后，甩凈，拍干，重復(fù)洗板5次；
[0075]9、酶標板每孔加入TMB溶液100 μ L，置于暗處室溫反應(yīng)20min ；
[0076]10、取出酶標板，每孔加入終止液100 μ L，在450nm處測定各孔的OD值；
[0077]11、利用GraphPad Prism5軟件以標準溶液孔的OD值B與空白孔的OD值BO的比值(Β/Β0)為函數(shù)值，以標準溶液的濃度對數(shù)的為自變量，制作曲線，求回歸方程，見附圖1 ;根據(jù)方程可求出樣品孔對應(yīng)毒素的濃度；
[0078]12、根據(jù)GraphPad Prism5軟件自帶的劑量_效應(yīng)(抑制模型)對數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合，可得公式(I )，其中Y為待測樣品OD值和空白孔OD值的比值，X為所測樣品中ZEN的濃度，單位為ng/mL ;根據(jù)待測樣品前處理過程可得公式(2)，其中X為所測樣品中ZEN的濃度，單位為ng/mL，X為所測樣品中ZEN的含量，單位為ng/g，V為提取液的總體積，單位為mL, m為待測樣品的質(zhì)量,單位為g ；
【權(quán)利要求】
1.一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，具體步驟如下所述: 第一步、制備陽離子化蛋白，主要制備陽離子化牛血清蛋白CBSA和陽離子化雞卵清蛋白 cOVA ； 第二步、采用Mannich法制備免疫抗原ZEN-cBSA和檢測抗原ZEN-cOVA ； 第三步、取健康的6-8周雌性Balb/c小鼠4只，初次免疫用完全弗氏佐劑乳化后腹腔注射，每只鼠免疫劑量為100 μ g ZEN-cBSA,注射體積為0.2mL ;之后加強免疫每兩周腹腔注射一次，乳化用不完全弗氏佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替不完全弗氏佐劑，采用尾靜脈注射，注射劑量和前面幾次相同；一共免疫6次；從第3次免疫開始，每次免疫后10天斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清效價； 第四步、小鼠在最后一次免疫后的第10天，摘眼球取血，處死小鼠；所獲血液先置于室溫下2h，然后在4°C條件下3500rpm離心20min，離心之后的血清凍存于_20°C的冰箱中；第五步、純化離心后的血清，間接ELISA確定血清效價； 第六步、檢測抗原包被于酶標板上，在4°C條件下過夜； 第七步、使用乙腈-水提取待檢樣品中的毒素，乙腈與水的體積比為85:15 ; 第八步、洗滌酶標板，加入封閉液，反應(yīng)2h ； 第九步、洗滌，凍存酶標板；或者加入標準毒素溶液、樣品提取液，添加稀釋后的血清上清； 第十步、洗滌，加入二抗羊抗鼠IgG-HRP反應(yīng)； 第H^一步、洗滌，加入底物液顯色； 第十二步、終止，450nm處酶標儀檢測反應(yīng)孔OD值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于:所述的第二步中制備得到的免疫抗原中ZEN與cBSA的分子個數(shù)比的范圍為10:1-20:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于:所述的第三步中初次免疫和加強免疫乳化成功的標準是乳液在水中呈滴狀，免疫的抗原劑量為100 μ g/只。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于:所述的第五步中血清效價的判斷標準為陽性孔的最大稀釋倍數(shù)，而陽性孔的判斷標準為-Ase) /(Aratt-Ase) >=2.1，其中A為待檢孔在450nm條件下的OD值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于:所述的第六步中檢測抗原 ZEN-cOVA 使用 100mmol/L pH=9.6 的 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液稀釋到 2 μ g/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測玉米赤酶烯酮的方法，其特征在于:所述第九步中的血清上清按照效價/2的倍數(shù)稀釋后加入。
【文檔編號】G01N33/64GK103808938SQ201410098274
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月16日
【發(fā)明者】劉靜波, 陳曉飛, 張燕 申請人:吉林大學(xué)