一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，首先對植物組織塊進(jìn)行固定、洗滌、脫水、滲透和包埋聚合處理；隨后，對包埋后的植物組織塊進(jìn)行超薄切片并將超薄切片收集在鎳網(wǎng)上；然后對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌、封閉和第一抗體孵育處理；第一抗體孵育后對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌并進(jìn)行第二抗體孵育；最后對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行染色，用電鏡觀察鎳網(wǎng)的載片面。本發(fā)明通過采用可特異性結(jié)合不同種類半纖維素的第一抗體，有效地識別區(qū)分不同種類的半纖維素，從而可準(zhǔn)確、有效地觀察不同種類半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。
【專利說明】一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物超微結(jié)構(gòu)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]能源緊缺、環(huán)境污染、食品和醫(yī)藥安全是當(dāng)今世界面臨的巨大挑戰(zhàn)，開發(fā)清潔、安全的生物質(zhì)資源是應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的有效途徑。半纖維素作為自然界中含量第二的可再生生物質(zhì)資源，可廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、食品、造紙、制藥及涂料等行業(yè)中，具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的社會、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。目前，半纖維素高值化綜合利用首先需要將其從生物質(zhì)原料中高效選擇性地分離出來。然而，由于半纖維素與生物質(zhì)原料中的其他組分(例如纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì))之間緊密結(jié)合或存在著化學(xué)鍵連接，使其高效選擇性地分離變得十分困難，特別是在盡可能不改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)的前提條件下。此外，半纖維素的組成、種類、含量和分布皆因生物質(zhì)的種類、組織器官和細(xì)胞類型的不同而變化，甚至在同一細(xì)胞的不同細(xì)胞壁各亞層間也存在明顯的差異，因此，與半纖維素相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究對半纖維素從生物質(zhì)原料中高效選擇性地分離具有指導(dǎo)性意義。
[0003]一般情況下，生物質(zhì)原料中半纖維素的組成、種類及其含量可通過化學(xué)分析或與光譜結(jié)合的方法進(jìn)行測定，但關(guān)于半纖維素在細(xì)胞壁中分布的研究，至今仍處于探索階段。多年來，國內(nèi)外相關(guān)研究者嘗試了很多研究半纖維素在植物細(xì)胞壁中分布的方法，這些方法大致可分為以下四種:化學(xué)剝皮法、骨架法、氧化染色法、顯微解剖化學(xué)分析法。
[0004]化學(xué)剝皮法:是指沿單根纖維細(xì)胞壁徑向方向，依次地從纖維外表面向細(xì)胞腔方向逐層“剝皮”，測定各剝皮部分的成分，得出沿細(xì)胞壁徑向分布的半纖維素的含量及糖類組分分布情況。“剝皮”是指在潤脹的條件下，使纖維部分酯化，在纖維外表面產(chǎn)生一層環(huán)圓柱形的酯類物質(zhì)，然后用適當(dāng)?shù)娜軇┌堰@層酯類物質(zhì)溶解下來。實際上，剝皮反應(yīng)并不能確定僅僅均一地發(fā)生在纖維細(xì)胞壁外表面，而在細(xì)胞壁的最內(nèi)層不發(fā)生。這種方法不足之處是:研究對象是單根纖維，尺寸很小，化學(xué)成分含量低，在技術(shù)上存在很多困難。并且不能反映出不同種類的半纖維素在細(xì)胞壁各微區(qū)的原位分布。
[0005]骨架法:是指將綜纖維素試樣用稀酸水解或堿抽提，除掉半纖維素后而殘留下“骨架”，將這一“骨架”和脫半纖維素之前的細(xì)胞壁進(jìn)行比較，從而得到半纖維素分布的情況。這種方法不足之處是:在制備綜纖維素時部分半纖維素已脫除；從綜纖維素中并不能完全地脫除半纖維素。因此，通過比較半纖維素組分去除前后的圖像不能準(zhǔn)確地反映半纖維素在細(xì)胞壁中的分布情況，并且也不能區(qū)別不同種類的半纖維素在細(xì)胞壁各微區(qū)的原位分布。
[0006]氧化染色法:是指利用半纖維素的還原末端基(醛基)較纖維素多20-40倍，而這些醛基易被氧化成羧基，某些金屬離子能與羧基反應(yīng)，置換出羧基上的氫離子而把金屬離子接到半纖維素上。由于重金屬離子對電子的散射能力強(qiáng)，在電子顯微鏡圖像上顯出較深“顏色”而容易觀察。從“染色”深淺程度可以觀察半纖維素的分布情況，色深處表示含有半纖維素較多的區(qū)域。氧化染色法只能根據(jù)重金屬離子密度變化情況對半纖維素的分布進(jìn)行相對地比較，不能區(qū)別半纖維素的種類。與此同時，纖維素的還原末端基對觀察的結(jié)果具有一定的干擾。
[0007]顯微解剖化學(xué)分析法:先假設(shè)細(xì)胞壁在形成的過程中細(xì)胞壁各層的沉積是依次連續(xù)的，而且一旦成層后，其中的碳水化合物成分將保持不變。具體是指根據(jù)細(xì)胞壁各層微纖維排列/取向不同，借助偏光顯微鏡，從植物細(xì)胞壁的徑切面或橫切面的薄片上可區(qū)分不同成熟階段的纖維。通過顯微操作將不同成熟階段的纖維分離，因此可得到不同成熟階段的纖維組分，依次包括:胞間層和初生壁(M+P)，胞間層、初生壁和次生壁外層(M+P+S1)，胞間層、初生壁和次生壁外層和中層(M+P+S1+S2)，以及胞間層、初生壁和次生壁(M+P+S1+S2+S3)。通過紙色譜分析可得到不同成熟階段纖維中含有的聚多糖組分及其含量，從而計算出半纖維素在細(xì)胞壁各層中的相對分布。這種方法不足之處是:取材周期長，取材位置應(yīng)具有代表性且尺寸很小，化學(xué)成分含量低，在分離技術(shù)上存在較大困難。并且不能反映出不同種類的半纖維素在細(xì)胞壁各微區(qū)的原位分布。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提出一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法。
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案:
[0010]一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，包括以下步驟:
[0011](I)對植物組織進(jìn)行切割，形成植物組織塊；
[0012](2)對植物組織塊進(jìn)行固定；將植物組織塊浸入固定液中進(jìn)行固定；固定過程在室溫下進(jìn)行，先在真空條件下保持30?60min，之后在常壓下保持4小時；
[0013](3)對植物組織塊進(jìn)行洗滌；將固定后的植物組織塊浸入50mM的二甲胂酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行洗滌；室溫常壓下保持IOmin ;洗滌重復(fù)3次；
[0014](4)對植物組織塊進(jìn)行脫水；將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ；
[0015](5)對植物組織塊進(jìn)行滲透；將脫水后的植物組織塊依次浸入50%LR White樹脂中I次，100%LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透；室溫下，每次滲透處理先在真空度為-0.098MPa條件下保持30?60min，之后在常壓下保持10?12小時；
[0016](6)對植物組織塊進(jìn)行包埋聚合；將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR White樹脂的膠囊中，然后將膠囊置于55?60°C烘箱中，常壓下保持18?24小時；
[0017](7)對包埋后的植物組織塊進(jìn)行超薄切片，然后將所得植物組織超薄切片收集在鎳網(wǎng)上；
[0018](8)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.0lM磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.0lM磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.0lM磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.0lM磷酸鹽緩沖溶液洗漆4次,每次2min ；[0019](9)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行封閉；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.0lM磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ；
[0020](10)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第一抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第一孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第一孵育液含有0.0lM磷酸鹽緩沖溶液、第一抗體和lw/v%牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，在4°C冰箱中孵育2天；
[0021](11)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取含有l(wèi)w/v%牛血清蛋白的0.0lM磷酸鹽緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于0.0lM磷酸鹽緩沖溶液、PH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:0.0lM磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次，每次2min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次Imin ；pH為
8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次Imin ；
[0022](12)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第二抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第二孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第二孵育液含有PH為8.0的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、第二抗體和0.5w/v%牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，室溫孵育4小時；
[0023](13)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于PH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、PH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗漆4次，每次Imin ；
[0024](14)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行染色；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于3wt%雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ；
[0025](15)對鎳網(wǎng)的載片面洗滌后使用透射電子顯微鏡觀察。
[0026]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，步驟I中將植物組織切割成大小為長0.5mmx寬0.5mm x高5mm的植物組織塊。
[0027]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，步驟(2)中所述固定液為4w/v%多聚甲醛和0.lv/v%戊二醛的溶液。是按照每IOOml水溶液中加入4g多聚甲醛和0.1ml戊二醛配制而成。
[0028]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，所述步驟5中，50%LR White樹脂是用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成。
[0029]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，步驟7中，植物組織超薄切片的厚度為lOOnm，所述鎳網(wǎng)為300目，鎳網(wǎng)上的植物組織超薄切片將互不重疊。
[0030]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，步驟15中所述洗滌過程為:用注射器吸取去離子水沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘。
[0031]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，所述第一抗體為抗聚木糖的LMlO和LMll ;或者所述第一抗體為抗聚葡萄糖甘露糖的LM21和LM22。
[0032]如上所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，優(yōu)選的，所述第二抗體是10-nm-膠體金標(biāo)記的羊抗鼠抗體。[0033]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0034]本發(fā)明通過采用可特異性結(jié)合不同種類半纖維素的第一抗體，有效地識別區(qū)分不同種類的半纖維素，從而可準(zhǔn)確、有效地觀察不同種類半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。這是化學(xué)剝皮法、骨架法、氧化染色法和顯微解剖化學(xué)分析法所不能達(dá)到的。本發(fā)明提供的檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的方法，不僅能準(zhǔn)確地觀察半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布，而且能有效地區(qū)分不同種類的半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。本發(fā)明為研究半纖維素的高效選擇性分離、理解半纖維素在植物細(xì)胞壁中的功能、辨別原料的種類和推測植物物種間的關(guān)系提供了有效的手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為聚木糖在楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果；
[0036]圖2為聚葡萄糖和甘露糖在楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果;
[0037]圖3為聚木糖在細(xì)葉芒細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但不作為對本發(fā)明的限定。
[0039]實施例1
[0040]本發(fā)明實施例提供了一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)分布的方法，所述方法包括:
[0041]步驟1:將楊木組織切割成0.5mm (長)x0.5mm (寬)x5mm(高)的小木條；
[0042]所述楊木小木條的尺寸越小，后續(xù)的固定、脫水和滲透所需的時間相應(yīng)地會縮短；但是當(dāng)楊木小木條尺寸太小，后續(xù)包埋時難以控制楊木小木條在透明膠囊中的位置，所述的楊木小木條尺寸為0.5mm (長)χ0.5mm (寬)x5mm(高)時，既能保證楊木小木條快速地進(jìn)行固定、脫水和滲透，又能保持楊木小木條在透明膠囊中的位置，有利于提高超薄切片的質(zhì)量。
[0043]步驟2:將切割的楊木小木條浸入4%多聚甲醛+0.1%戊二醛混合而成的固定液中進(jìn)行固定，室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持40min，之后在常壓下保持4小時；
[0044]步驟3:將固定后的楊木小木條浸入50mM 二甲胂酸鈉緩沖溶液溶液中進(jìn)行洗滌，室溫常壓下保持lOmin。洗滌次數(shù)為3次；
[0045]步驟4:
[0046]將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ；
[0047]步驟5:將脫水后的楊木小木條依次浸入50%LR White樹脂(用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成)1次，100%的LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透。室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持30min，之后在常壓下保持10小時；本發(fā)明實施例所用LRWhite 樹脂的生產(chǎn)廠家是 London Resin Company Limited。
[0048]步驟6:將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR White樹脂的膠囊中，置于60°C烘箱中，常壓下保持18小時；
[0049]步驟7:對包埋后的楊木小木條進(jìn)行超薄切片，得到厚度為IOOnm的超薄切片；
[0050]步驟8:將互不重疊的超薄切片轉(zhuǎn)移到300目的鎳網(wǎng)上；
[0051]步驟9:室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次，每次2min ；
[0052]步驟10:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ；
[0053]上述的羊血清與0.01M磷酸鹽緩沖溶液體積比為1:20 ;
[0054]步驟11:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第一孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第一孵育液含有
0.01M磷酸鹽緩沖溶液、第一抗體(LM10或LM11，可特異性結(jié)合聚木糖)和1?八％牛血清蛋白。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天；本發(fā)明實施例所用第一抗體LM10、LMll、LM21、LM22 的生產(chǎn)廠家是 University of Leeds Consulting Ltd。
[0055]上述的第一孵育液由第一抗體LM21:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有1?八％牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；或者由第一抗體LM22:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有l(wèi)w/v%牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；
[0056]上述的對于空白樣 品，將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于僅含有Iw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天;
[0057]步驟12:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0058]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0059]步驟13:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第二抗體(可特異性結(jié)合第一抗體)和0.5w/v%牛血清蛋白的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，室溫孵育4小時；
[0060]上述的第二抗體:pH為8.0的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(含有0.5w/v%牛血清蛋白)=1:50 (v/v)；
[0061]步驟14:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0062]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0063]步驟15:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于3被％雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ；
[0064]步驟16:用注射器吸取去離子水，沿鎳網(wǎng)面對其沖洗I分鐘；
[0065]步驟17:將載有超薄切片的鎳網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。得到的透射電子顯微鏡的圖像用于分析楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中聚木糖的分布特征。
[0066]聚木糖在楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明本發(fā)明方法不僅可原位觀察半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的分布，而且能有效地區(qū)分不同種類的半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。
[0067]實施例2
[0068]本發(fā)明實施例提供了一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)分布的方法，所述方法包括:
[0069]步驟1:將楊木組織切割成0.5mm (長)x0.5mm (寬)x5mm(高)的小木條；
[0070]步驟2:將切割的楊木小木條浸入4%多聚甲醛+0.1%戊二醛混合而成的固定液中進(jìn)行固定，室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持40min，之后在常壓下保持4小時；
[0071]步驟3:將固定后的楊木小木條浸入50mM 二甲胂酸鈉緩沖溶液溶液中進(jìn)行洗滌，室溫常壓下保持lOmin。洗滌次數(shù)為3次；
[0072]步驟4:
[0073]將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ；
`[0074]步驟5:將脫水后的楊木小木條依次浸入50%LR White樹脂(用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成)1次，100%的LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透。室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持30min，之后在常壓下保持10小時；
[0075]步驟6:將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR White樹脂的膠囊中，置于60°C烘箱中，常壓下保持18小時；
[0076]步驟7:對包埋后的楊木小木條進(jìn)行超薄切片，得到厚度為IOOnm的超薄切片；
[0077]步驟8:將互不重疊的超薄切片轉(zhuǎn)移到300目的鎳網(wǎng)上；
[0078]步驟9:室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次，每次2min ；
[0079]步驟10:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ；
[0080]上述的羊血清與0.01M磷酸鹽緩沖溶液體積比為1:20 ;
[0081]步驟11:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第一抗體(LM21和LM22，可特異性結(jié)合聚葡萄糖甘露糖)和lw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天；
[0082]上述的第一孵育液由第一抗體LM21:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有1?八％牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；或者由第一抗體LM22:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有l(wèi)w/v%牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；
[0083]上述的對于空白樣品，將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于僅含有1界八％牛血清蛋白的0.0謹(jǐn)磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天;
[0084]步驟12:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0085]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0086]步驟13:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第二抗體(可特異性結(jié)合第一抗體)和0.5w/v%牛血清蛋白的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，室溫孵育4小時；
[0087]上述的第二抗體:pH為8.0的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(含有0.5w/v%牛血清蛋白)=1:50 (v/v)；
[0088]步驟14:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0089]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0090]步驟15:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于3被％雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ；
[0091]步驟16:用注射器吸取去離子水，沿鎳網(wǎng)面對其沖洗I分鐘；
[0092]步驟17:將載有超薄切片的鎳網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。得到的透射電子顯微鏡的圖像用于分析楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中聚葡萄糖甘露糖的分布特征。
[0093]聚葡萄糖甘露糖在楊木細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。
[0094]結(jié)果表明本發(fā)明方法不僅可原位觀察半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的分布，而且能有效地區(qū)分不同種類的半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。
[0095]實施例3
[0096]本發(fā)明實施例提供了一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)分布的方法，所述方法包括:
[0097]步驟1:將細(xì)葉芒組織切割成0.5mm (長)x0.5mm (寬)x5mm(高)的小木條；
[0098]步驟2:將切割的細(xì)葉芒小條浸入4%多聚甲醛+0.1%戊二醛混合而成的固定液中進(jìn)行固定，室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持40min，之后在常壓下保持4小時；
[0099]步驟3:將固定后的細(xì)葉芒小條浸入50mM 二甲胂酸鈉緩沖溶液溶液中進(jìn)行洗滌，室溫常壓下保持lOmin。洗滌次數(shù)為3次；
[0100]步驟4:[0101]將洗滌后的細(xì)葉芒小條依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ；
[0102]步驟5:將脫水后的細(xì)葉芒小條依次浸入50%LR White樹脂(用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成)1次，100%的LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透。室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持30min，之后在常壓下保持10小時；
[0103]步驟6:將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR White樹脂的膠囊中，置于60°C烘箱中，常壓下保持24小時；
[0104]步驟7:對包埋后的細(xì)葉芒小條進(jìn)行超薄切片，得到厚度為IOOnm的超薄切片；
[0105]步驟8:將互不重疊的超薄切片轉(zhuǎn)移到300目的鎳網(wǎng)上；
[0106]步驟9:室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.01M磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次，每次2min ；
[0107]步驟10:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ；
[0108]上述的羊血清與 0.01M磷酸鹽緩沖溶液體積比為1:20 ;
[0109]步驟11:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第一抗體(LM10和LM11，可特異性結(jié)合聚木糖)和lw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天；
[0110]上述的第一孵育液由第一抗體LMlO:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有1?八％牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；或者由第一抗體LMll:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有l(wèi)w/v%牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；
[0111]上述的對于空白樣品，將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于僅含有Iw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天;
[0112]步驟12:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0113]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0114]步驟13:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第二抗體(可特異性結(jié)合第一抗體)和0.5w/v%牛血清蛋白的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，室溫孵育4小時；
[0115]上述的第二抗體:pH為8.0的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(含有0.5w/v%牛血清蛋白)=1:50 (v/v)；
[0116]步驟14:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。[0117]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0118]步驟15:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于3被％雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ；
[0119]步驟16:用注射器吸取去離子水，沿鎳網(wǎng)面對其沖洗I分鐘；
[0120]步驟17:將載有超薄切片的鎳網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。得到的透射電子顯微鏡的圖像用于分析細(xì)葉芒細(xì)胞壁各微區(qū)中聚木糖的分布特征。
[0121]聚木糖在細(xì)葉芒細(xì)胞壁各微區(qū)中分布的透射電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示。
[0122]結(jié)果表明本發(fā)明方法不僅可原位觀察半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的分布，而且能有效地區(qū)分不同種類的半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)中的原位分布。
[0123]實施例4
[0124]本發(fā)明實施例提供了一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁各微區(qū)分布的方法，所述方法包括:
[0125]步驟1:將白皮松組織切割成0.5mm (長)x0.5mm (寬)x5mm(高)的小木條；
[0126]步驟2:將切割的白皮松小木條浸入4%多聚甲醛+0.1%戊二醛混合而成的固定液中進(jìn)行固定，室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持30min，之后在常壓下保持4小時；
[0127]步驟3:將固定后的白皮松小木條浸入50mM 二甲胂酸鈉緩沖溶液溶液中進(jìn)行洗滌，室溫常壓下保持lOmin。洗滌次數(shù)為3次；
[0128]步驟4:
[0129]將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ；
[0130]步驟5:將脫水后的白皮松小木條依次浸入50%LR White樹脂(用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成)1次，100%的LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透。室溫下，先在真空度為-0.098MPa條件下保持60min，之后在常壓下保持12小時；
[0131]步驟6:將滲透后的植物組織塊浸入注滿LR White樹脂的膠囊中，置于60°C烘箱中，常壓下保持18小時；
[0132]步驟7:對包埋后的白皮松小木條進(jìn)行超薄切片，得到厚度為IOOnm的超薄切片；
[0133]步驟8:將互不重疊的超薄切片轉(zhuǎn)移到300目的鎳網(wǎng)上；
[0134]步驟9:室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的0.0lM磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.0lM磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.0lM磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.0lM磷酸鹽緩沖溶液洗滌4次，每次2min ；
[0135]步驟10:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.0lM磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ；
[0136]上述的羊血清與0.01M磷酸鹽緩沖溶液體積比為1:20 ;
[0137]步驟11:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第一抗體(LM21或LM22，可特異性結(jié)合聚葡萄糖甘露糖)和lw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天；
[0138]上述的第一孵育液由第一抗體LM21:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有1?八％牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；或者由第一抗體LM22:0.01M磷酸鹽緩沖溶液(含有l(wèi)w/v%牛血清蛋白)按1:20 (v/v)制得；
[0139]上述的對于空白樣品，將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于僅含有Iw/v%牛血清蛋白的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，在4°C冰箱中孵育2天;
[0140]步驟12:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0141]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0142]步驟13:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有第二抗體(可特異性結(jié)合第一抗體)和0.5w/v%牛血清蛋白的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行孵育。置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中，加蓋，室溫孵育4小時；
[0143]上述的第二抗體:pH為8.0的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(含有0.5w/v%牛血清蛋白)=1:100 (v/v)；
[0144]步驟14:對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌。
[0145]先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于pH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ；
[0146]步驟15:將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于3被％雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ；
[0147]步驟16:用注射器吸取去離子水，沿鎳網(wǎng)面對其沖洗I分鐘；
[0148]步驟17:將載有超薄切片的鎳網(wǎng)置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察。得到的透射電子顯微鏡的圖像用于分析白皮松細(xì)胞壁各微區(qū)中聚葡萄糖甘露糖的分布特征。
[0149]以上實施例僅為本發(fā)明的示例性實施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等 同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，包括以下步驟: (1)對植物組織進(jìn)行切割，形成植物組織塊； (2)對植物組織塊進(jìn)行固定；將植物組織塊浸入固定液中進(jìn)行固定；固定過程在室溫下進(jìn)行，先在真空條件下保持30~60min，之后在常壓下保持4小時； (3)對植物組織塊進(jìn)行洗滌；將固定后的植物組織塊浸入50mM的二甲胂酸鈉緩沖溶液中進(jìn)行洗滌；室溫常壓下保持IOmin ;洗滌重復(fù)3次； (4)對植物組織塊進(jìn)行脫水；將洗滌后的植物組織塊依次浸入30v/v%乙醇水溶液I次，50v/v%乙醇水溶液I次，70v/v%乙醇水溶液I次，80v/v%乙醇水溶液I次，90v/v%乙醇水溶液I次，95v/v%乙醇水溶液3次，100%乙醇3次進(jìn)行脫水；室溫常壓下每次浸入IOmin ； (5)對植物組織塊進(jìn)行滲透；將脫水后的植物組織塊依次浸入50%LRWhite樹脂中I次，100%LR White樹脂中2次進(jìn)行滲透；室溫下，每次滲透處理先在真空度為_0.098MPa條件下保持30~60min，之后在常壓下保持10~12小時； (6)對植物組織塊進(jìn)行包埋聚合；將滲透后的植物組織塊浸入注滿LRWhite樹脂的膠囊中，然后將膠囊置于55~60°C烘箱中，常壓下保持18~24小時； (7)對包埋后的植物組織塊進(jìn)行超薄切片，然后將所得植物組織超薄切片收集在鎳網(wǎng)上； (8)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；室溫條件下，將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于去離子水的液滴上、含0.1M甘氨酸的`0.01M磷酸鹽的緩沖溶液的液滴上、去離子水的液滴上和0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:去離子水洗滌2次，每次2min ;含0.1M甘氨酸的0.`01M磷酸鹽的緩沖溶液洗滌I次，30min ;去離子水洗滌4次，每次2min ；0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗漆4次,每次2min ； (9)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行封閉；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于含有羊血清的0.01M磷酸鹽緩沖溶液的液滴上進(jìn)行封閉，室溫下保持40min ； (10)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第一抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第一孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第一孵育液含有0.01M磷酸鹽緩沖溶液、第一抗體和lw/v%牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，在4°C冰箱中孵育2天； (11)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取含有1?八％牛血清蛋白的0.0現(xiàn)磷酸鹽緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于0.01M磷酸鹽緩沖溶液、pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、pH為8.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:0.01M磷酸鹽緩沖溶液洗滌5次，每次2min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次Imin ；pH為8.4的`0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌4次，每次Imin ； (12)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行第二抗體孵育；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于第二孵育液內(nèi)進(jìn)行孵育，所述第二孵育液含有0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、第二抗體和0.5?八％牛血清蛋白；置于無菌的玻璃培養(yǎng)皿中并加蓋，室溫孵育4小時； (13)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行洗滌；先用注射器吸取0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘；再將鎳網(wǎng)的載片面依次輕浮于PH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、PH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液、去離子水的液滴上進(jìn)行洗滌；對應(yīng)的洗滌次數(shù)和時間分別為:PH為7.6的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ；pH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液洗滌5次，每次4min ;去離子水洗滌4次，每次Imin ； (14)對鎳網(wǎng)的載片面進(jìn)行染色；將鎳網(wǎng)的載片面輕浮于雙氧乙酸鈾的液滴上進(jìn)行染色，室溫下保持IOmin ； (15)對鎳網(wǎng)的載片面洗滌后使用透射電子顯微鏡觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟I中將植物組織切割成大小為長0.5mm X寬0.5mm X高5mm的植物組織塊。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟(2)中所述固定液為含4w/v%多聚甲醛和0.^八％戊二醛的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，所述步驟5中，50%LR White樹脂是用LR White樹脂與乙醇按體積比例1:1配制而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟7中，植物組織超薄切片的厚度為lOOnm，所述鎳網(wǎng)為300目，鎳網(wǎng)上的植物組織超薄切片將互不重疊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，步驟15中所述洗滌過程為:用注射器吸取去離子水沿鎳網(wǎng)面沖洗I分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，所述第一抗體為抗聚木糖的LMlO和LMll ;或者所述第一抗體為抗聚葡萄糖甘露糖的LM21和 LM22。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位檢測半纖維素在植物細(xì)胞壁分布的方法，其特征在于，所述第二抗體是10-nm-膠 體金標(biāo)記的羊抗鼠抗體。
【文檔編號】G01N23/04GK103822931SQ201410099500
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】許鳳, 馬靜, 周霞, 吉喆, 張遜 申請人:北京林業(yè)大學(xué)