高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于光譜測量【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高空間分辨雙軸差動共焦圖譜成像方法與裝置。本發(fā)明的核心思想是融合雙軸差動共焦顯微和光譜探測技術(shù)，采用分割焦斑差動探測實(shí)現(xiàn)幾何位置的精密成像，簡化了傳統(tǒng)差動共焦顯微系統(tǒng)的光路結(jié)構(gòu)，繼承了雙軸顯微技術(shù)的大視場、大工作距的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)高空間分辨圖譜合一的探測。本發(fā)明不僅具有高空間分辨力，還具有三維層析幾何成像、光譜探測和微區(qū)圖譜層析成像三種模式，為微區(qū)光譜探測提供了一種新的解決途徑，在生物醫(yī)學(xué)、物理材料學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于光譜測量【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置，可用于各類樣品的三維形貌重構(gòu)及微區(qū)光譜探測。
技術(shù)背景
[0002]自從1990年G.J.Puppels等在Nature期刊報(bào)道其發(fā)明共焦拉曼光譜顯微技術(shù)并成功用于觀測單細(xì)胞和染色體的形態(tài)與組成，共焦拉曼光譜顯微技術(shù)迅速發(fā)展為一種極其重要的樣品結(jié)構(gòu)與成分分析的基本手段。該技術(shù)既繼承了共焦顯微術(shù)的高分辨層析成像特征，又可以對樣品進(jìn)行光譜分析，因而使激光共焦拉曼光譜顯微技術(shù)在光譜測試領(lǐng)域獨(dú)樹一幟，并且迅速發(fā)展為一種極其重要的樣品結(jié)構(gòu)與成分分析的重要手段，使之廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理學(xué)、地質(zhì)學(xué)、法庭取證、刑偵學(xué)等學(xué)科的前沿基礎(chǔ)研究中。
[0003]但是，由于受到“零視場”掃描成像方式和衍射極限的限制，傳統(tǒng)共焦顯微系統(tǒng)通常難以兼顧分辨能力、工作距離和視場。增大物鏡的數(shù)值孔徑可以改善共焦顯微系統(tǒng)的分辨力，但數(shù)值孔徑的增大反過來又制約了共焦顯微系統(tǒng)工作距離的增大及視場范圍的擴(kuò)展。且大數(shù)值孔徑物鏡的尺寸通常在厘米量級，不利于系統(tǒng)的小型化。因而，1994年Stelzer等人提出了雙軸共焦顯微術(shù)，將照明光軸和測量光軸正交放置，對原有共焦顯微光路進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了大工作距離、大視場和低數(shù)值孔徑物鏡的高軸向分辨力顯微成像，及系統(tǒng)的小型化。
[0004]傳統(tǒng)的激光共焦拉曼光譜儀采用單軸顯微系統(tǒng)，導(dǎo)致瑞利散射光光強(qiáng)過大，降低了生物樣品的可觀測性，根據(jù)瑞利散射定則，當(dāng)入射光與散射光方向垂直時(shí)，瑞利散射光強(qiáng)最弱，有利于系統(tǒng)觀測高散射性的生物樣品。國內(nèi)外學(xué)者利用此特性，提出雙軸共焦顯微結(jié)構(gòu)并廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域，取得了一系列成果。例如，1999年，美國Wellman實(shí)驗(yàn)室和 Schepens 眼科研究中心的 Webb 和 Rogomentich 在《Confocal microscope with largefield and working distance》中提出了一種使用相對較小數(shù)值孔徑物鏡的雙軸共焦顯微系統(tǒng)，兩個(gè)光軸的夾角小于90°，該系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)光路的工作距離可達(dá)20mm，非常適合用于活體細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域；2003年,美國斯坦福大學(xué)的Thomas Wang等人在《Dual-axis confocalmicroscope for high-resolution in vivo imaging》中將光纖和MEMS器件引入到雙軸共焦顯微成像系統(tǒng)中，研制出小型化的三維雙軸共焦顯微鏡，用于高分辨力的醫(yī)學(xué)活體成像；2008年，美國斯坦福大學(xué)研究小組研制成功兩種規(guī)格的雙軸共焦顯微系統(tǒng)，封裝直徑分別為IOmm和5_，均可用于對非活體和活體成像。雙軸結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)為活體樣品的探測提供了解決途徑，但是現(xiàn)有雙軸技術(shù)仍不能滿足現(xiàn)代科技對光譜探測技術(shù)的需求。
[0005]由于拉曼散射光十分微弱，為了降低拉曼光譜的能量損失，現(xiàn)有共焦拉曼技術(shù)中用于焦點(diǎn)定位的針孔尺寸通常較大，直徑為150?200 μ m之間，而擴(kuò)大針孔尺寸則會增加共焦軸向定位曲線的半高寬，降低其定位精度，不能很好的起到定焦作用。但是，現(xiàn)代科技的快速發(fā)展對微區(qū)光譜探測能力及空間分辨探測能力提出了更高的要求，若要提高空間分辨力及光譜探測能力，必須對系統(tǒng)進(jìn)行精確定焦。在光學(xué)探測系統(tǒng)中，焦點(diǎn)處的測量聚焦光斑尺寸最小，激發(fā)光強(qiáng)最強(qiáng)，因此為了獲得高空間分辨力和最優(yōu)的光譜探測能力，必須使測量聚焦光斑位于焦點(diǎn)位置。
[0006]在差動共焦光路中，要求針孔、探測器中心與測量系統(tǒng)光軸重合，從而保證被測樣品反射回的光束可以恰好進(jìn)入探測器，但是，由于針孔尺寸較小，通常在10 μ m左右，使得針孔調(diào)節(jié)會有一定困難。另外，差動共焦光路中，兩針孔的最優(yōu)化軸向離焦量與物鏡數(shù)值孔徑N.A.相關(guān)，對于光路裝調(diào)好的針孔位置只適用于特定的物鏡N.A.，因而，無法根據(jù)樣品更換物鏡，從而導(dǎo)致差動共焦光路在實(shí)際應(yīng)用中存在較大的局限性。
[0007]此外，拉曼散射光極其微弱，只有瑞利光束強(qiáng)度的10_3?10_6倍，而現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測儀器只利用了微弱的拉曼散射光進(jìn)行光譜探測而遺棄強(qiáng)于拉曼散射光IO3?IO6倍的瑞利光束，因而，在共焦拉曼光譜探測中如何改善光路結(jié)構(gòu)從而提高拉曼散射光收集效率及利用現(xiàn)有光譜探測系統(tǒng)中遺棄的瑞利光束進(jìn)行輔助探測是改善共焦拉曼光譜探測技術(shù)空間分辨力的新途徑。
[0008]基于上述情況，本發(fā)明提出雙軸差動共焦圖譜顯微系統(tǒng)，采用雙軸方式降低瑞利散射光強(qiáng)度，提高系統(tǒng)空間分辨力；利用現(xiàn)有共焦拉曼光譜探測系統(tǒng)樣品散射光中遺棄的瑞利光束構(gòu)建雙軸差動共焦顯微成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)樣品三維幾何位置的高空間分辨成像，利用差動共焦曲線過零點(diǎn)與焦點(diǎn)精確對應(yīng)這一特性來控制光譜探測器精確捕獲焦點(diǎn)處拉曼光譜信息，使其與光譜探測系統(tǒng)有機(jī)融合，從而，進(jìn)行空間位置信息和光譜信息的同時(shí)探測，以期實(shí)現(xiàn)高空間分辨“圖譜合一”成像與探測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有共焦拉曼探測儀器中收集效率低、空間分辨力不足，以及不利于對環(huán)境背景光、光源強(qiáng)度波動等因素的抑制等缺陷，提出一種具有高空間分辨雙軸差動共焦圖譜探測方法與裝置。
[0010]本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0011]本發(fā)明提出的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，采用雙軸差動共焦的方式對被測樣品進(jìn)行圖譜成像，其實(shí)現(xiàn)步驟為:
[0012]I)照明物鏡與采集物鏡對稱分布在測量面法線兩側(cè)，并且照明光軸與測量面法線的夾角為Q1，采集光軸與測量面法線的夾角為Θ2，以測量面法線方向?yàn)闇y量軸線，建立系統(tǒng)坐標(biāo)系(X，y, Ζ),其中Q1=Q2;
[0013]2)激發(fā)光經(jīng)由照明物鏡聚焦到被測樣品上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的拉曼散射光，軸向即Z向移動被測樣品使瑞利光及對應(yīng)被測樣品不同區(qū)域的拉曼散射光被反射進(jìn)入采集物鏡，并被采集物鏡會聚到二向色分光系統(tǒng)，光束經(jīng)二向色分光系統(tǒng)分光后，拉曼散射光和瑞利光相互分離，瑞利光被二向色分光系統(tǒng)反射進(jìn)入差動探測系統(tǒng)，拉曼散射光透射過二向色分光系統(tǒng)進(jìn)入光譜探測系統(tǒng)獲得光譜信號I ( λ ) (λ為波長)；
[0014]3)對進(jìn)入差動探測系統(tǒng)的瑞利光進(jìn)行差動處理，其中，差動探測系統(tǒng)中兩個(gè)相同的探測系統(tǒng)對稱放置于測量光軸兩側(cè)，利用針孔橫向偏移可使雙軸共焦顯微系統(tǒng)的軸向響應(yīng)特性曲線產(chǎn)生相移的特性擬合出相應(yīng)的差動共焦曲線，并獲得差動信號I (X，y, Z, Vxm)，其中Vxm是針孔橫向偏移量，利用差動共焦曲線過零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)的特性，通過零點(diǎn)觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)O位置，實(shí)現(xiàn)被測樣品的高空間分辨的焦點(diǎn)定位；[0015]4)將被測樣品移動至焦點(diǎn)O處，重新獲取焦點(diǎn)O處的光譜信號I ( λ );
[0016]5)利用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)將獲得的差動信號I (X，y, ζ, νχΜ)和光譜信號I ( λ )進(jìn)行數(shù)據(jù)融合處理，以獲得樣品的位置信息和光譜信息的四維測量信息I (X，y，z，λ)；
[0017]6)完成上述步驟后，對被測樣品進(jìn)行橫向掃描，即x、y方向，將被測樣品移動到下一個(gè)點(diǎn)重復(fù)步驟2)、3)、4)、5)；
[0018]7)單獨(dú)處理瑞利光的信號時(shí)，獲得高空間分辨的三維尺度層析圖像；單獨(dú)處理拉曼散射光的信號時(shí)，獲得光譜圖像；同時(shí)處理瑞利光和拉曼散射光的信號時(shí)，獲得高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像，即被測樣品幾何位置信息和光譜信息的“圖譜合一”;
[0019]本發(fā)明所示的測量方法中，差動探測系統(tǒng)中的兩個(gè)相同的探測系統(tǒng)還可以是單一的探測系統(tǒng)即第一探測器，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)從第一探測器上獲取焦斑圖案后，計(jì)算出此時(shí)焦斑圖案的中心，以此中心作為坐標(biāo)原點(diǎn)，建立探測器像面上的坐標(biāo)系(x/，yd')，在Xd'軸上對稱設(shè)置兩個(gè)具有相同半徑的圓形針孔對焦斑圖案進(jìn)行分割探測，分別為第一虛擬針孔和第二虛擬針孔，其位置分別對應(yīng)上述兩個(gè)探測系統(tǒng)，當(dāng)被測樣品進(jìn)行掃描時(shí)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分別計(jì)算出第一虛擬針孔和第二虛擬針孔范圍內(nèi)像素灰度總和，得到強(qiáng)度響應(yīng)。
[0020]本發(fā)明所示的測量方法中，所述激發(fā)光束是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光；或是由光瞳濾波技術(shù)生成的結(jié)構(gòu)光束，其與光瞳濾波技術(shù)聯(lián)用可以壓縮測量聚焦光斑尺寸，提高系統(tǒng)橫向分辨力。
[0021]本發(fā)明所示的測量方法中，該系統(tǒng)還可以探測熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜。
[0022]本發(fā)明還提供了高空間分辨雙軸差動差動共焦圖譜顯微成像裝置，包括光源，照明物鏡，采集物鏡和三維掃描工作臺，還包括準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡，二向色分光裝置，差動探測裝置和光譜探測裝置；其中，照明物鏡和采集物鏡對稱地布局在測量面法線兩側(cè)，照明光軸與測量面法線的夾角為Q1，采集光軸與測量面法線的夾角為θ2，其中θ1=θ2，準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡和照明物鏡依次放在光源的出射光線方向，采集物鏡和二向色分光裝置依次放在被測樣品的反射光線方向，差動探測裝置放置在二向色分光裝置的反射方向，光譜探測裝置放在二向色分光裝置透射方向。
[0023]本發(fā)明所示的測量裝置中，還包括在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡和照明物鏡之間加入照明端光瞳濾波器，或者在采集物鏡和差動探測裝置之間加入采集端光瞳濾波器，或者在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡和照明物鏡之間以及采集物鏡和差動探測裝置之間同時(shí)加入照明端光瞳濾波器和采集端光瞳濾波器30。
[0024]本發(fā)明所示的測量裝置中，還包括在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡25和照明物鏡2之間加入偏振調(diào)制裝置，或者在照明物鏡和照明端光瞳濾波器之間加入偏振調(diào)制裝置。
[0025]本發(fā)明所示的測量裝置中，差動探測裝置的探測裝置可以是CCD探測器，或者是兩個(gè)參數(shù)相同的點(diǎn)探測器。
[0026]本發(fā)明所示的測量裝置中，還包括最后進(jìn)行數(shù)據(jù)融合處理的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。
[0027]本發(fā)明所示的測量裝置中，光譜探測裝置可以是共焦光譜探測裝置，包括第一聚光鏡、位于第一聚光鏡焦點(diǎn)處的針孔、第二聚光鏡、位于第二聚光鏡焦點(diǎn)處的光譜儀及光譜儀后的第二探測器；還可以是普通光譜探測裝置，包括第第二聚光鏡、位于第二聚光鏡焦點(diǎn)處的光譜儀及光譜儀后的第二探測器。[0028]有益效果
[0029]本發(fā)明對比已有技術(shù)有以下顯著創(chuàng)新點(diǎn):
[0030]1、將雙軸差動共焦顯微技術(shù)與光譜探測技術(shù)有機(jī)結(jié)合，利用雙軸差動共焦顯微系統(tǒng)軸向響應(yīng)曲線的過零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)的特性，通過零點(diǎn)觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)位置的光譜信息，并且進(jìn)行對焦點(diǎn)位置的實(shí)時(shí)跟蹤測量，實(shí)現(xiàn)高空間分辨的光譜探測；
[0031]2利用雙軸結(jié)構(gòu)，降低瑞利散射光強(qiáng)度；利用二向色分光裝置對瑞利光和拉曼散射光進(jìn)行分光，瑞利光進(jìn)入差動探測系統(tǒng)進(jìn)行幾何位置探測，拉曼散射光進(jìn)入拉曼光譜探測系統(tǒng)進(jìn)行光譜探測，提高系統(tǒng)光譜探測靈敏度，二向色分光裝置可以根據(jù)需要調(diào)整角度，有利于低波數(shù)拉曼光譜的探測；
[0032]3、將雙軸差動共焦顯微系統(tǒng)與拉曼光譜成像系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上相融合，既可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)幾何參數(shù)的層析成像，又可實(shí)現(xiàn)樣品微區(qū)的光譜探測，即同時(shí)實(shí)現(xiàn)微尺度層析成像、圖譜層析成像和光譜測試三種成像模式，并顯著改善成像測試系統(tǒng)的抗干擾能力、線性和離焦特性；
[0033]4、該系統(tǒng)可選用單一 CCD探測器結(jié)合計(jì)算機(jī)軟件實(shí)現(xiàn)虛擬針孔差動或共焦探測，探測方式靈活，有利于實(shí)際應(yīng)用中不同行N.A.物鏡的轉(zhuǎn)換，更有利于實(shí)現(xiàn)儀器的通用性。
[0034]本發(fā)明對比已有技術(shù)具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
[0035]1、與單軸拉曼光譜系統(tǒng)相比，降低了瑞利散射光強(qiáng)度；
[0036]2、采用分割焦斑的橫向差動共焦方式，便于系統(tǒng)根據(jù)需求更換物鏡，調(diào)節(jié)方便；
[0037]3、二向色分光裝置可以根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整，以提高系統(tǒng)低波數(shù)探測能力；
[0038]4、雙軸差動共焦光路的采用提高了系統(tǒng)的信噪比，并使測量系統(tǒng)具有絕對零點(diǎn)和雙極性跟蹤的特性，提高了層析精度的同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)絕對測量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法示意圖；
[0040]圖2為高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法示意圖；
[0041]圖3信號探測過程示意圖；
[0042]圖4為高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；
[0043]圖5為帶偏振調(diào)制的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置示意圖；
[0044]圖6為高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置實(shí)施例1示意圖；
[0045]圖7為高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法與裝置實(shí)施例2示意圖；
[0046]其中，1-光源，2-照明物鏡，3-被測樣品，4-照明光軸，5-測量面法線，6-G1J-采集物鏡，8- 二向色分光系統(tǒng)，9-測量透鏡，10-顯微物鏡，11-第一探測系統(tǒng)，12-第二探測系統(tǒng)，13-測量光軸，14-針孔橫向偏移量，15-差動探測系統(tǒng)，16-焦斑圖案，17-第二探測系統(tǒng)光斑，18-第一探測系統(tǒng)光斑，19-光譜探測系統(tǒng)，20-采集光軸，21-數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，22-第一探測器，23-第二虛擬針孔，24-第一虛擬針孔，25-準(zhǔn)直擴(kuò)束系統(tǒng)，26-三維掃描工作臺，27-差動共焦曲線，28-照明端光瞳濾波器，29-偏振調(diào)制裝置，30-采集端光瞳濾波器,31-第一聚光鏡,32-針孔,33-第二聚光鏡，34-光譜儀,35-第二探測器，36-共焦拉曼曲線，37-θ2?！揪唧w實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0048]實(shí)施例1
[0049]本實(shí)施例中，光源I為激光器，偏振調(diào)制裝置29為徑向偏振光產(chǎn)生器,二向色分光系統(tǒng)8為Notch filter，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)21為計(jì)算機(jī)，第一探測器22為第一 CXD探測器，第二探測器35為第二 CXD探測器。
[0050]如圖2、圖3和圖6所示，照明物鏡2與采集物鏡7對稱分布在測量面法線5兩偵牝并且照明光軸4與測量面法線5的夾角為Θ #，采集光軸20與測量面法線5的夾角為θ 237，其中θ1=θ2，以測量面法線5方向?yàn)闇y量軸線，建立系統(tǒng)坐標(biāo)系(x，y，z)，高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，其測量步驟是:
[0051]首先，激光器I發(fā)出的光束經(jīng)準(zhǔn)直擴(kuò)束系統(tǒng)25后，進(jìn)行擴(kuò)束出射后成為與照明物鏡2入瞳直徑相等的平行光，經(jīng)過徑向偏振光產(chǎn)生器29后成為徑向偏振光，徑向偏振光經(jīng)照明端光瞳濾波器28后光束被調(diào)制，經(jīng)由照明物鏡2形成壓縮光斑聚焦到放置在三維掃描工作臺26上的被測樣品3表面，并激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品3光譜特性的拉曼散射光，被測樣品3可通過增強(qiáng)拉曼光譜納米粒子等拉曼增強(qiáng)技術(shù)進(jìn)行處理，以提高拉曼散射光的強(qiáng)度。
[0052]軸向(即圖中的Z方向)移動三維掃描工作臺26來軸向掃描被測樣品3，移動時(shí)使瑞利光及對應(yīng)被測樣品3不同區(qū)域的拉曼散射光被反射進(jìn)入采集物鏡7，經(jīng)過采集物鏡7收集的光束被Notch filter8進(jìn)行分光。
[0053]被Notch filter8反射的瑞利光,經(jīng)過采集端光瞳濾波器30調(diào)制后,通過測量透鏡9進(jìn)行匯聚到差動探測系統(tǒng)15，匯聚光斑經(jīng)過顯微物鏡10放大并成像在第一 CXD探測器22上；透射過Notch filters的拉曼散射光進(jìn)入光譜探測系統(tǒng)19，光譜探測系統(tǒng)19為共焦拉曼光譜探測系統(tǒng)，拉曼散射光被第一聚光鏡31會聚到針孔32，經(jīng)過第二聚光鏡33會聚進(jìn)入光譜儀34，最后入射到第二 CXD探測器35，獲得被測樣品3的拉曼光譜I (λ) (λ為波長)，如共焦拉曼曲線36所示。
[0054]測量過程中，計(jì)算機(jī)21從第一 CXD探測器22上獲取焦斑圖像16，計(jì)算出此時(shí)焦斑圖像16的中心，以此中心作為坐標(biāo)原點(diǎn)，建立C⑶像面上的坐標(biāo)系(x/ , y/ )，在x/軸上對稱設(shè)置兩個(gè)具有相同半徑的圓形虛擬針孔對焦斑圖像16進(jìn)行分割探測，分別為第一虛擬針孔24和第二虛擬針孔23，其對應(yīng)的針孔橫向偏移量14為M ;當(dāng)被測樣品3進(jìn)行掃描時(shí)，計(jì)算機(jī)21分別計(jì)算出第一虛擬針孔24和第二虛擬針孔23范圍內(nèi)像素灰度總和，分別對應(yīng)為焦斑圖像16中的第一探測系統(tǒng)光斑18和第二探測系統(tǒng)光斑17，得到強(qiáng)度響應(yīng)Ii (x, y, Z, -VXM)和I2 (X，y, z, +vxM)，其中Vxm是針孔橫向偏移量。
[0055]計(jì)算機(jī)21對I1 (X，y, z, _vxM)和I2 (x, y, z, +vxM)進(jìn)行差動相減處理,得到帶有被測樣品3凸凹變化的強(qiáng)度響應(yīng)I (X，y, z, vxM),
[0056]I (x, y, z, vxM) =I1 (x, y, z, -vxM)-12(x, y, z, +vxM) (I)
[0057]根據(jù)公式(I)的結(jié)果擬合出相應(yīng)差動共焦曲線27，利用差動共焦曲線27過零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)的特性，獲系統(tǒng)焦點(diǎn)O的位置，并通過三維掃描工作臺26將被測樣品3移動至焦點(diǎn)O位置。那么此時(shí)可重新捕獲被測樣品3在焦點(diǎn)O處的拉曼光譜I ( λ )。[0058]將I ( λ )、Ι (χ，y，z，VxM)傳送到計(jì)算機(jī)21進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而獲得包含被測樣品3位置信息I (X，Y, Ζ, vxM)和光譜信息I ( λ )的四維測量信息I (X，y，ζ，λ )。
[0059]完成上述步驟后，利用三維掃描工作臺26對被測樣品3進(jìn)行橫向掃描(即圖中的X、y方向)，移動到下一個(gè)點(diǎn)后，利用三維掃描工作臺26對被測樣品3進(jìn)行軸向掃描(即圖中的ζ方向)，獲取系統(tǒng)焦點(diǎn)O的位置后，將被測樣品3移動到焦點(diǎn)O處，并獲取光譜信息。
[0060]通過上述過程，即可獲得精確的光譜信息，實(shí)現(xiàn)焦點(diǎn)位置的光譜探測和三維幾何位置探測，其中，通過對測量信息{lU)，I(X，y，z)}的融合處理，可實(shí)現(xiàn)式(2)所示的三種
測量模式，即:微區(qū)圖譜層析成像測試、三維尺度層析成像和光譜測試。
【權(quán)利要求】
1.高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，采用雙軸差動共焦的方式對被測樣品進(jìn)行圖譜成像，其特征在于: 1)照明物鏡(2)與采集物鏡(7 )對稱分布在測量面法線(5 )兩側(cè)，并且照明光軸(4 )與測量面法線(5)的夾角為Q1 (6)，采集光軸(20)與測量面法線(5)的夾角為θ2 (37)，以測量面法線(5)方向?yàn)闇y量軸線，建立系統(tǒng)坐標(biāo)系(x，y，z)，其中θ1=θ2; 2)激發(fā)光經(jīng)由照明物鏡(2)聚焦到被測樣品(3)上，激發(fā)出瑞利光和載有被測樣品光譜特性的拉曼散射光，軸向即ζ向移動被測樣品(3)使瑞利光及對應(yīng)被測樣品(3)不同區(qū)域的拉曼散射光被反射進(jìn)入采集物鏡(7)，并被采集物鏡(7)會聚到二向色分光系統(tǒng)(8)，光束經(jīng)二向色分光系統(tǒng)(8)分光后,拉曼散射光和瑞利光相互分離,瑞利光被二向色分光系統(tǒng)(8)反射進(jìn)入差動探測系統(tǒng)(15)，拉曼散射光透射過二向色分光系統(tǒng)(8)進(jìn)入光譜探測系統(tǒng)(19)獲得光譜信號I (λ) (λ為波長)； 3)對進(jìn)入差動探測系統(tǒng)(15)的瑞利光進(jìn)行差動處理，其中，差動探測系統(tǒng)(15)中兩個(gè)相同的探測系統(tǒng)(11、12)對稱放置于測量光軸(13)兩側(cè)，利用針孔橫向偏移可使雙軸共焦顯微系統(tǒng)的軸向響應(yīng)特性曲線產(chǎn)生相移的特性擬合出相應(yīng)的差動共焦曲線(27)，并獲得差動信號I(x，y，z，vxM)，其中vxM是針孔橫向偏移量，利用差動共焦曲線過零點(diǎn)與焦點(diǎn)位置精確對應(yīng)的特性，通過零點(diǎn)觸發(fā)來精確捕獲激發(fā)光斑焦點(diǎn)O位置，實(shí)現(xiàn)被測樣品的高空間分辨的焦點(diǎn)定位； 4)將被測樣品(3)移動至焦點(diǎn)O處，重新獲取焦點(diǎn)O處的光譜信號I( λ ); 5)利用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(21)將獲得的差動信號I(x，y，z，νχΜ)和光譜信號I (λ)進(jìn)行數(shù)據(jù)融合處理，以獲得樣品的位置信息和光譜信息的四維測量信息I (x，y，z，λ)； 6)完成上述步驟后，對被測樣品(3)進(jìn)行橫向掃描，即X、y方向，將被測樣品(3)移動到下一個(gè)點(diǎn)重復(fù)步驟2)、3)、4)、5)； 7)單獨(dú)處理瑞利光的信號時(shí)，獲得高空間分辨的三維尺度層析圖像；單獨(dú)處理拉曼散射光的信號時(shí)，獲得光譜圖像；同時(shí)處理瑞利光和拉曼散射光的信號時(shí)，獲得高空間分辨的微區(qū)圖譜層析成像，即被測樣品幾何位置信息和光譜信息的“圖譜合一”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于:差動探測系統(tǒng)(15)中的兩個(gè)相同的探測系統(tǒng)(11、12)還可以是單一的探測系統(tǒng)即第一探測器(22)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(21)從第一探測器(22)上獲取焦斑圖案(16)后，計(jì)算出此時(shí)焦斑圖案(16)的中心，以此中心作為坐標(biāo)原點(diǎn)，建立探測器像面上的坐標(biāo)系(x/ , y/ )，在X/軸上對稱設(shè)置兩個(gè)具有相同半徑的圓形針孔對(23、24)焦斑圖案(16)進(jìn)行分割探測，分別為第一虛擬針孔(24)和第二虛擬針孔(23)，其位置分別對應(yīng)上述兩個(gè)探測系統(tǒng)(11、12)，當(dāng)被測樣品(3)進(jìn)行掃描時(shí)，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(21)分別計(jì)算出第一虛擬針孔(24)和第二虛擬針孔(23)范圍內(nèi)像素灰度總和，得到強(qiáng)度響應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于:所述激發(fā)光束是偏振光束:線偏光、圓偏光、徑向偏振光；或是由光瞳濾波技術(shù)生成的結(jié)構(gòu)光束，其與光瞳濾波技術(shù)聯(lián)用可以壓縮測量聚焦光斑尺寸，提高系統(tǒng)橫向分辨力。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像方法，其特征在于:該系統(tǒng)還可以探測熒光、布里淵散射光、康普頓散射光等散射光譜。
5.高空間分辨雙軸差動差動共焦圖譜顯微成像裝置，包括光源(1)，照明物鏡(2)，采集物鏡(7)和三維掃描工作臺(26)，其特征在于:還包括準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(25) 二向色分光裝置(8)，差動探測裝置(15)和光譜探測裝置(19);其中，照明物鏡(2)和采集物鏡(7)對稱地布局在測量面法線(5)兩側(cè)，照明光軸(4)與測量面法線(5)的夾角為Q1 (6)，采集光軸(20)與測量面法線(5)的夾角為θ2 (37)，其中θ 1=θ2，準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(25)和照明物鏡(2)依次放在光源(I)的出射光線方向，采集物鏡(7 )和二向色分光裝置(8 )依次放在被測樣品(3 )的反射光線方向，差動探測裝置(15 )放置在二向色分光裝置(8 )的反射方向，光譜探測裝置(19)放在二向色分光裝置(8)透射方向。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:還包括在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(25)和照明物鏡(2)之間加入照明端光瞳濾波器(28)，或者在采集物鏡(7)和差動探測裝置(15)之間加入采集端光瞳濾波器(30)，或者在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(25)和照明物鏡(2)之間以及采集物鏡(7)和差動探測裝置(15)之間同時(shí)加入照明端光瞳濾波器(28)和采集端光瞳濾波器(30)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:還包括在準(zhǔn)直擴(kuò)束鏡(25)和照明物鏡(2)之間加入偏振調(diào)制裝置(29)，或者在照明物鏡(2)和照明端光瞳濾波器(28)之間加入偏振調(diào)制裝置(29)。
8.根據(jù)權(quán)利要求 5或6或7所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:差動探測裝置(15)的探測裝置可以是CCD探測器，或者是兩個(gè)參數(shù)相同的點(diǎn)探測器。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:還包括最后進(jìn)行數(shù)據(jù)融合處理的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(21)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的高空間分辨雙軸差動共焦圖譜顯微成像裝置，其特征在于:光譜探測裝置(19)可以是共焦光譜探測裝置，包括第一聚光鏡(31)、位于第一聚光鏡焦點(diǎn)處的針孔(32)、第二聚光鏡(33)、位于第二聚光鏡(33)焦點(diǎn)處的光譜儀(34)及光譜儀(34)后的第二探測器(35);還可以是普通光譜探測裝置，包括第第二聚光鏡(33)、位于第二聚光鏡(33)焦點(diǎn)處的光譜儀(34)及光譜儀(34)后的第二探測器(35)。
【文檔編號】G01N21/65GK103926197SQ201410100592
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】趙維謙, 崔晗, 邱麗榮, 王允 申請人:北京理工大學(xué)