一種利用多維指紋圖譜來控制決明子多糖質(zhì)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于食品、藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種利用指紋圖譜來控制決明子多糖質(zhì)量的方法。以決明子為原料，構(gòu)建決明子多糖多維指紋圖譜，包括構(gòu)建決明子多糖GC指紋圖譜、決明子多糖完全水解下的HPLC指紋圖譜以及決明子多糖不完全水解下的HPLC指紋圖譜，通過多維指紋圖譜共同組成了完整的決明子多糖的指紋圖譜特征。該多維指紋圖譜可以用于對(duì)原料的質(zhì)量控制。采用本發(fā)明可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)原料進(jìn)行更為準(zhǔn)確、全面的質(zhì)量控制。
【專利說明】一種利用多維指紋圖譜來控制決明子多糖質(zhì)量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食品、藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種利用指紋圖譜來控制決明子多糖質(zhì)量的方法。
技術(shù)背景
[0002]決明(Semen Cassiae)屬于豆科植物。決明子是豆科植物決明的干燥成熟種子，國家衛(wèi)生部頒布的藥食同源植物。始載于《神農(nóng)草本經(jīng)》，決明子被列為上品，其味甘、苦，微寒，入肝、腎經(jīng)，具有降壓、降脂、保肝、明目、潤腸和抗菌等作用。在民間決明子有著悠久的使用歷史，或泡茶飲，或炒后與其它藥物配伍(于守洋，崔洪斌.中國保健食品的進(jìn)展[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000.1)。決明子多糖是決明子中具有醫(yī)療保健作用的主要成分之一，具有清除自由基和抗氧化功能(劉娟，鄧澤元，于化泓.決明子水溶性多糖的抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2006，05:61-63 ;郭曉強(qiáng)，顏軍，部曉勇，徐光域，范春華，茍小軍.決明子水溶性多糖的純化及抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2007，8:205-208)。富含多糖的決明子水提醇沉物或水提物具有顯著的降壓(劉菊秀，苗戎，狄俊英，郝志強(qiáng).決明子降壓作用的實(shí)驗(yàn)研究.天津中醫(yī)，1990,5:37-40)、降脂作用(陳衛(wèi)星，刁國俊，蔣文娟，梁聯(lián)，決明子對(duì)高膽固醇癥小鼠模型的影響.中草藥，1991，2:72-77)和調(diào)節(jié)免疫(南景一，王忠，沈玉清，楊正娟等.決明子對(duì)小鼠免疫功能的影響的實(shí)驗(yàn)研究.遼寧中醫(yī)雜志，1989，5:43-44)等作用。
[0003]多糖的質(zhì)量是影響其功效活性的關(guān)鍵點(diǎn)(R.Srivastava, D.K.Kulshreshtha,Bioactive polysaccharides from plants, Phytochemistry, 1989, 28:2877-2883)。如何用一種簡便、快捷、準(zhǔn)確的方法來控制決明子多糖的質(zhì)量，是亟待解決的一個(gè)難題。
[0004]已有文獻(xiàn)報(bào)道利用指紋圖譜技術(shù)控制多糖的質(zhì)量，但多采用單一指紋圖譜，根據(jù)保留時(shí)間的范圍進(jìn)行直接判斷(CN102008515A，一種靈芝孢子粉指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜)，或者輔助于聚類分析統(tǒng)計(jì)學(xué)手段(CN102680607A，一種基于指紋圖譜的可可粉摻假檢測方法)進(jìn)行多糖的質(zhì)量判定。由于對(duì)于同一種品種來源的多糖，其高級(jí)結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性而單糖組成成分具有相對(duì)穩(wěn)定性，以及儀器檢測方法的靈敏性，因此現(xiàn)有方法具有難以克服的缺點(diǎn)，即難于判定未知樣品是否符合標(biāo)準(zhǔn)樣品的指紋圖譜，時(shí)而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本發(fā)明采用多維指紋圖譜綜合判斷，輔助于統(tǒng)計(jì)學(xué)手段，綜合結(jié)果數(shù)據(jù)，從而得到可靠結(jié)論。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是為了克服現(xiàn)有決明子多糖質(zhì)量控制技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，通過對(duì)決明子多糖的多維指紋圖譜構(gòu)建方法的研究，提供一種利用多維指紋圖譜來有效控制決明子多糖質(zhì)量的方法。
[0006]為解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不能準(zhǔn)確確定決明子中多糖種類及含量的問題，本發(fā)明提供一種利用指紋圖譜來有效控制決明子多糖質(zhì)量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0007]步驟一、構(gòu)建決明子標(biāo)準(zhǔn)品多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜:選取標(biāo)準(zhǔn)決明子原料，共10批次，分別構(gòu)建決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜、決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜以及決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，構(gòu)建三維標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；
[0008]所述決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的糖腈乙酸酯衍生化，隨后采用氣相色譜法分析供試品溶液，最終獲得決明子多糖GC指紋圖譜；
[0009]所述決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行完全水解，隨后進(jìn)行決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(即PMP)衍生化反應(yīng)，再進(jìn)行高效液相色譜的指紋分析，最終按照獲得的結(jié)果繪制決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；
[0010]所述決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不完全水解，隨后進(jìn)行決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(即PMP)衍生化反應(yīng)，再進(jìn)行高效液相色譜的指紋分析，最終按照獲得的結(jié)果繪制決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；
[0011]步驟二、采用上述步驟一中決明子標(biāo)準(zhǔn)品多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定方法，繪制實(shí)際送樣決明子的決明子多糖GC指紋圖譜、決明子多糖完全水解下的HPLC指紋圖譜以及決明子多糖不完全水解下的HPLC指紋圖譜；
[0012]步驟三、將步驟二獲得的結(jié)果分別與步驟一中的三維標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，當(dāng)相似度均大于90%以上，則表明所述實(shí)際送樣中的決明子多糖合格。
[0013]本發(fā)明所述的決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建具體包括如下步驟:
[0014](I)決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的糖腈乙酸酯衍生化:將三氟乙酸水解減壓蒸干后的樣品，依次加入IOmg的鹽酸羥胺和0.5ml無水吡啶，超聲溶解，于90°C恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)40min，反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入0.6ml的乙酸酐，超聲混勻，90°C恒溫水浴振蕩中反應(yīng)40min，得糖腈乙酰化衍生物，直接進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行檢測；
[0015](2)采用氣相色譜法分析供試品溶液:色譜柱為Agilent DB-5毛細(xì)管色譜柱(30m X 0.32mm X 0.25 μ m);燃?xì)?、輔助氣及載氣的比例為N2: H2: Air=40: 45: 400ml / min ;分流比:10: I ;進(jìn)樣量:2μ L ;進(jìn)樣口溫度:220°C；檢測器溫度:260°C ;采用程序升溫，其升溫程序?yàn)?起始溫度70°C，保持8min ；30°C / min升至 160°C，保持 19min ；10°C / min 升至 170°C ;保持 29min ；10°C / min 升至 220°C，保持4min ;在此條件下獲得樣品多糖的色譜指紋圖譜，以I號(hào)峰為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積，最終獲得決明子多糖GC指紋圖譜。
[0016]通過對(duì)10批次決明子樣品中多糖水解產(chǎn)品經(jīng)糖腈乙酸酯衍生化后的氣相色譜圖進(jìn)行比較，確定7個(gè)共有特征峰，并將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜專用軟件得到由其共有特征峰構(gòu)成的決明子多糖的標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜指紋圖譜。本發(fā)明的決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下:
[0017]I號(hào)峰平均RT為I，RSD為O % ;
[0018]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.042，RSD 為 0.170% ；[0019]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.090，RSD % 0.511% ；
[0020]4 號(hào)峰平均 RT 為 1.199，RSD 為 0.096% ；
[0021]5 號(hào)峰平均 RT 為 1.807，RSD 為 0.559% ；
[0022]6 號(hào)峰平均 RT 為 1.841，RSD 為 0.397% ；
[0023]7 號(hào)峰平均 RT 為 1.964，RSD 為 0.505%。
[0024]針對(duì)經(jīng)完全水解或不完全水解的決明子多糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建具體包括如下步驟:
[0025](I)決明子多糖水解液的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化過程:將上多糖水解物用水溶解，然后轉(zhuǎn)容到IOml容量瓶并定容，準(zhǔn)確量取定容好的多糖水解液
0.2ml置于5ml具塞玻璃離心管中，依次加入0.2ml,0.5mol / L的PMP甲醇溶液和0.2ml，
0.3mol / L的NaOH溶液，超聲混勻，70°C水浴反應(yīng)60min，冷至室溫，加0.2ml，0.3mol / L的HCl溶液中和，向離心管中加氯仿至2ml,高速潤旋lmin,萃取剩下的PMP,4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移除下層有機(jī)相，保留上清液，采用2mL氯仿重復(fù)萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀釋定容至5ml，過0.22 μ m的微孔濾膜，供HPLC檢測用；混標(biāo)樣品的PMP衍生化處理方法與樣品液相同，所述混標(biāo)樣品的濃度為0.1mg / ml ； (2)色譜條件:色譜柱為C18(250X4.60mm,5y );流動(dòng)相:18% 乙腈-82%磷酸鹽緩沖液(0.05mol / mi ；pH=6.74)；流動(dòng)相流速為0.8ml / min ;柱溫為室溫；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為245nm ;進(jìn)樣量:20yL;以I號(hào)峰(甘露糖)為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積。
[0026]決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下:
[0027]I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ;
[0028]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.607，RSD 為 0.640% ；
[0029]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.840，RSD 為 1.243% ；
[0030]4 號(hào)峰平均 RT 為 2.093，RSD 為 1.323% ；
[0031]5 號(hào)峰平均 RT 為 2.393，RSD 為 1.839% ；
[0032]6 號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 1.424% ；
[0033]7 號(hào)峰平均 RT 為 2.611，RSD 為 1.752%。
[0034]決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下:
[0035]I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ;
[0036]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.058，RSD 為 0.353% ；
[0037]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.125，RSD 為 0.506% ；
[0038]4 號(hào)峰平均 RT 為 1.503，RSD 為 0.479% ；
[0039]5 號(hào)峰平均 RT 為 1.668，RSD 為 0.841 % ；
[0040]6 號(hào)峰平均 RT 為 2.015，RSD 為 0.405% ；
[0041]7 號(hào)峰平均 RT 為 2.293，RSD 為 0.528% ；
[0042]8 號(hào)峰平均 RT 為 2.365，RSD 為 0.496% ；
[0043]9 號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 0.545%。
[0044]本發(fā)明所涉及的決明子多糖的提取包括如下步驟:
[0045]稱取1.0g過40目的決明子樣品，以石油醚(30_60°C )回流脫脂8h，將脫脂干燥后的決明子樣品加水100ml，在80°C水浴并磁力攪拌3h，合并濾液；準(zhǔn)確稱取木瓜蛋白酶
0.0lg，加入到濾液中，置于60°C恒溫水浴振蕩器中，緩慢振蕩2h，冷卻至室溫；在上述酶解液中加入50mL的sevaga液,在恒溫振蕩器上快速振蕩20min,將混合液體以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，分相后取其上清液，再重復(fù)上述“ sevaga法除蛋白”的過程，直至上下兩相間無乳白色絮狀沉淀，以除盡提取液中的植物蛋白；然后往提取液加入15% (V / V)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2，置于60°C水浴中反應(yīng)6h ;將脫色后的提取液緩慢滴入無水乙醇(按其體積的4倍)，同時(shí)置于磁力攪拌器上快速攪拌,室溫靜置3小時(shí)，4000rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin取沉淀；所得沉淀中加入IOml丙酮，于超聲清洗器中超聲5min，再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min,重復(fù)一次；在離心后的殘洛中加入IOml無水乙醚,超聲洗漆5min,離心，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，重復(fù)洗滌一次，將離心后所得的殘?jiān)玫獨(dú)獯蹈?，稱重，密封，冰箱中保存，備用，制得本發(fā)明的粗多糖樣品。
[0046]本發(fā)明所涉及的完全水解步驟為:精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml，0.5mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解3h，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理4次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。本發(fā)明構(gòu)建決明子多糖GC指紋圖譜和決明子多糖完全水解下的HPLC指紋圖譜均是采用該完全水解后的多糖樣品。
[0047]本發(fā)明所涉及的不完全水解步驟為:精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml，0.05mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解lh，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，70°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理3次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。
[0048]前述方法中，所獲得標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜和未知樣品的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，區(qū)別其異同。對(duì)共有峰進(jìn)行面積歸一化，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積，然后進(jìn)行主成分分析。
[0049]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0050](I)本發(fā)明建立決明子多糖的指紋圖譜技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，有效地全面監(jiān)控原料質(zhì)量，從而保障產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、均勻、可控。
[0051](2)本發(fā)明采用不同的檢測分析方法，構(gòu)建三維指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)庫，可協(xié)同地、互補(bǔ)地、全面地監(jiān)控原料藥材、半成品、成品的質(zhì)量，通過色譜指紋特征相似度的比較，評(píng)價(jià)優(yōu)劣、穩(wěn)定性和一致性，彌補(bǔ)現(xiàn)行質(zhì)量控制方法或單一指紋圖譜的不足。
[0052](3)在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以開展指紋圖譜信息與功效活性的相關(guān)性研究，從而闡明內(nèi)在化學(xué)成分的功效作用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0053]圖1實(shí)施例2中決明子多糖完全水解糖腈乙酸酯衍生化GC圖譜；
[0054]圖2實(shí)施例3中決明子多糖完全水解PMP衍生化HPLC色譜圖；
[0055]圖3實(shí)施例4中決明子多糖不完全水解PMP衍生化HPLC色譜圖；
[0056]圖4決明子多糖GC指紋圖譜的主成分分析得分二維散點(diǎn)圖；[0057]圖5決明子多糖HPLC指紋圖譜一的主成分分析得分二維散點(diǎn)圖；
[0058]圖6決明子多糖HPLC指紋圖譜二的主成分分析得分二維散點(diǎn)圖
【具體實(shí)施方式】
[0059]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0060]實(shí)施例1決明子多糖提取
[0061]稱取1.0g過40目的決明子樣品，以石油醚(30-60°C)回流脫脂8h。將脫脂干燥后的決明子樣品加水100ml，在80°C水浴并磁力攪拌3h，合并濾液。準(zhǔn)確稱取木瓜蛋白酶0.01g，加入到濾液中，置于60°C恒溫水浴振蕩器中，緩慢振蕩2h，冷卻至室溫。在上述酶解的糖提取液中加入50mL的sevaga液,在恒溫振蕩器上快速振蕩20min,將混合液體以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min,分相后取其上清液,再重復(fù)上述“sevaga法除蛋白”的過程,直至上下兩相間無乳白色絮狀沉淀，以除盡提取液中的植物蛋白。然后將提取液加入15% (V /V)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2，置于60°C水浴中反應(yīng)6h。將脫色后的提取液緩慢滴入無水乙醇(按其體積的4倍)，同時(shí)置于磁力攪拌器上快速攪拌，室溫靜置3小時(shí)，4000rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin取沉淀。所得沉淀中加入IOml丙酮,于超聲清洗器中超聲5min,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，重復(fù)一次。在離心后的殘?jiān)屑尤隝Oml無水乙醚，超聲洗滌5min，離心，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，重復(fù)洗滌一次，將離心后所得的殘?jiān)玫獨(dú)獯蹈?，稱重，密封，冰箱中保存，備用。
[0062]實(shí)施例2決明子多糖的GC分析方法
[0063]將10批次決明子原料進(jìn)行多糖提取(采用實(shí)施例1的方法)。
[0064]決明子多糖水解過程:精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml,
0.5mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解3h，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理4次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。
[0065]決明子多糖樣品水解產(chǎn)物的糖腈乙酸酯衍生化，即三氟乙酸水解減壓蒸干后的樣品，依次加入IOmg的鹽酸羥胺和0.5ml無水吡啶，超聲溶解，于90°C恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)40min，反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入0.6ml的乙酸野，超聲混勾，90 C恒溫水浴振湯中反應(yīng)40min，得糖腈乙?；苌?，直接進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行檢測。采用氣相色譜法分析供試品溶液:色譜柱為Agilent DB-5毛細(xì)管色譜柱(30mX0.32mmX0.25 μ m);燃?xì)?、輔助氣及載氣的比例為N2: H2: Air=40: 45: 400ml / min ;分流比:10: 1;進(jìn)樣量:2“1^;進(jìn)樣口溫度:220°C ;檢測器溫度:260°C ;采用程序升溫，其升溫程序?yàn)?起始溫度70°C，保持8min ；30°C / min 升至 16CTC,保持 19min ； 10°C / min 升至 170°C ;保持 29min ； 10°C / min升至220°C，保持4min。在第10分鐘采集圖譜信息，獲得決明子多糖完全水解糖腈乙酸酯衍生化GC色譜圖(圖1)。
[0066]計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積。獲得決明子多糖GC指紋圖譜中，共有峰有7個(gè)，相對(duì)保留時(shí)間RT(以甘露糖峰為參照)，偏差小于I %，具體特征如下:
[0067]I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ;[0068]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.042，RSD 為 0.170% ；
[0069]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.090，RSD 為 0.511% ；
[0070]4 號(hào)峰平均 RT 為 1.199，RSD 為 0.096% ；
[0071]5 號(hào)峰平均 RT 為 1.807，RSD 為 0.559% ；
[0072]6 號(hào)峰平均 RT 為 1.841，RSD 為 0.397% ；
[0073]7 號(hào)峰平均 RT 為 1.964，RSD 為 0.505% ；
[0074]I號(hào)峰，相對(duì)峰面積0.373?1.185% ；2號(hào)峰，相對(duì)峰面積1.415?5.719% ；3號(hào)峰，相對(duì)峰面積4.249?23.678%；4號(hào)峰,相對(duì)峰面積1.086?2.572%；5號(hào)峰,相對(duì)峰面積45.786?75.051%；6號(hào)峰，相對(duì)峰面積3.889?5.363%；7號(hào)峰，相對(duì)峰面積13.231?17.733%。
[0075]實(shí)施例3決明子多糖的HPLC分析方法一
[0076]決明子多糖提取制備:將10批次決明子原料按照實(shí)施例1進(jìn)行多糖提取制備。
[0077]決明子多糖完全水解過程:將10批次決明子原料多糖按照實(shí)施例2進(jìn)行完全水解制備。
[0078]決明子多糖水解液的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化過程:將上多糖水解物用水溶解，然后轉(zhuǎn)容到IOml容量瓶并定容，準(zhǔn)確量取0.2ml多糖水解液置于5ml具塞玻璃離心管中，依次加入0.2ml, 0.5mol / L的PMP甲醇溶液和0.2ml, 0.3mol / L的NaOH溶液，超聲混勻，70°C水浴反應(yīng)60min，冷至室溫，加0.2ml, 0.3mol / L的HCl溶液中和，向離心管中加氯仿至2ml,高速潤旋lmin,萃取剩下的PMP,4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min,移除下層有機(jī)相，保留上清液，采用2mL氯仿重復(fù)萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀釋定容至5ml，過0.22 μ m的微孔濾膜，供HPLC檢測用。色譜條件:色譜柱為C18 (250 X 4.60mm,5μ);流動(dòng)相:18%乙腈-82%磷酸鹽緩沖液(0.05mol / ml ；pH=6.74);流動(dòng)相流速為
0.8ml / min ;柱溫為室溫；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為245nm ;進(jìn)樣量:20 μ L。在第19分鐘采集圖譜信息，獲得決明子多糖完全水解PMP衍生法HPLC色譜圖(圖2)。
[0079]計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積。獲得決明子多糖完全水解的HPLC指紋圖譜中，共有峰有7個(gè)，相對(duì)保留時(shí)間RT (以甘露糖峰為參照)，偏差小于I %，具體特征如下:
[0080]I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ;
[0081]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.607，RSD 為 0.640% ；
[0082]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.840，RSD 為 1.243% ；
[0083]4 號(hào)峰平均 RT 為 2.093，RSD 為 1.323% ；
[0084]5 號(hào)峰平均 RT 為 2.393，RSD 為 1.839% ；
[0085]6 號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 1.424% ；
[0086]7 號(hào)峰平均 RT 為 2.611，RSD 為 1.752%。
[0087]I號(hào)峰甘露糖，相對(duì)峰面積43.187?67.279% ；2號(hào)葡萄糖醛酸峰，相對(duì)峰面積
1.394?2.469% ；3號(hào)氨基半乳糖峰，相對(duì)峰面積1.882?2.748% ；4號(hào)葡糖糖峰，相對(duì)峰面積2.483?10.125% ；5號(hào)半乳糖峰，相對(duì)峰面積12.121?16.440% ；6號(hào)木糖峰，相對(duì)峰面積4.436?26.411% ；7號(hào)阿拉伯糖峰，相對(duì)峰面積1.742?6.544%。
[0088]實(shí)施例4決明子多糖的HPLC分析方法二[0089]決明子多糖提取制備:將10批次決明子原料按照實(shí)施例1進(jìn)行多糖提取制備。
[0090]決明子多糖不完全水解過程:精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入
2.0ml, 0.05mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解lh，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，70°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理3次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。
[0091]決明子多糖的不完全水解液的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化過程:將上多糖水解物用水溶解，然后轉(zhuǎn)容到IOml容量瓶并定容，準(zhǔn)確量取0.2ml多糖水解液置于5ml具塞玻璃離心管中，依次加入0.2ml，0.5mol / L的PMP甲醇溶液和0.2ml，0.3moI /L的NaOH溶液，超聲混勻，70°C水浴反應(yīng)60min，冷至室溫，加0.2ml, 0.3mol / L的HCl溶液中和，向離心管中加氯仿至2ml，高速渦旋Imin，萃取剩下的PMP，4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移除下層有機(jī)相，保留上清液，采用2mL氯仿重復(fù)萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀釋定容至5ml,過0.22 μ m的微孔濾膜,供HPLC檢測用。色譜條件:色譜柱為PhenomenexGemini C18 (250 X 4.60mm, 5 μ );流動(dòng)相:18 % 乙腈-82 % 磷酸鹽緩沖液(0.05mol / ml;pH=6.74);流動(dòng)相流速為0.8ml / min ;柱溫為室溫；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為245nm ;進(jìn)樣量:20 μ L。在第19分鐘采集圖譜信息，并獲得決明子多糖不完全水解PMP衍生化HPLC色譜圖(圖3)。
[0092]計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積。獲得決明子多糖不完全水解的HPLC指紋圖譜中，共有峰有7個(gè)，相對(duì)保留時(shí)間RT(以I號(hào)峰為參照)，偏差小于I %，具體特征如下:
[0093]I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ;
[0094]2 號(hào)峰平均 RT 為 1.058，RSD 為 0.353% ；
[0095]3 號(hào)峰平均 RT 為 1.125，RSD 為 0.506% ；
[0096]4 號(hào)峰平均 RT 為 1.503，RSD 為 0.479% ；
[0097]5 號(hào)峰平均 RT 為 1.668，RSD 為 0.841 % ；
[0098]6 號(hào)峰平均 RT 為 2.015，RSD 為 0.405% ；
[0099]7 號(hào)峰平均 RT 為 2.293，RSD 為 0.528% ；
[0100]8 號(hào)峰平均 RT 為 2.365，RSD 為 0.496% ；
[0101]9 號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 0.545%。
[0102]I號(hào)峰，相對(duì)峰面積24.225?58.653% ；2號(hào)峰，相對(duì)峰面積1.438?6.213% ；3號(hào)峰，相對(duì)峰面積0.251?1.621%；4號(hào)峰,相對(duì)峰面積1.642?5.476%；5號(hào)峰,相對(duì)峰面積1.650?5.818% ；6號(hào)峰，相對(duì)峰面積2.324?3.652% ；7號(hào)峰，相對(duì)峰面積11.580?16.885% ；8號(hào)峰，相對(duì)峰面積9.009?33.197% ；9號(hào)峰，相對(duì)峰面積4.830?11.443%。
[0103]實(shí)施例5四川某產(chǎn)地決明子樣品(簡稱四川決明子)的多糖指紋圖譜分析
[0104]1.多糖的制備:按照實(shí)施例1進(jìn)行。
[0105]2.多糖的GC色譜圖:按照實(shí)施例2，將四川決明子的多糖進(jìn)行完全水解、衍生化及GC儀器分析。
[0106]3.多糖的HPLC色譜圖一:按照實(shí)施例3，將四川決明子的多糖進(jìn)行完全水解、PMP衍生化及HPLC儀器分析。[0107]4.多糖的HPLC色譜圖二:按照實(shí)施例4，將四川決明子的多糖進(jìn)行不完全水解、PMP衍生化及HPLC儀器分析。
[0108]實(shí)施例6安徽某產(chǎn)地決明子樣品(簡稱安徽決明子)的多糖指紋圖譜分析
[0109]1.多糖的制備:按照實(shí)施例1進(jìn)行。
[0110]2.多糖的GC色譜圖:按照實(shí)施例2，將安徽決明子多糖進(jìn)行完全水解、衍生化及GC儀器分析。
[0111]3.多糖的HPLC色譜圖一:按照實(shí)施例3，將安徽決明子多糖進(jìn)行完全水解、PMP衍生化及HPLC儀器分析。
[0112]4.多糖的HPLC色譜圖二:按照實(shí)施例4，將安徽決明子多糖進(jìn)行不完全水解、PMP衍生化及HPLC儀器分析。[0113]實(shí)施例7四川決明子和安徽決明子樣品與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖指紋圖譜數(shù)據(jù)的主成分分析
[0114]從未知樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品獲得的色譜圖提出共有峰的色譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行主成分分析。主成分分析法是一種數(shù)學(xué)變換的方法，它把給定的一組相關(guān)變量通過線性變換轉(zhuǎn)成另一組不相關(guān)的變量，這些新的變量按照方差依次遞減的順序排列。本文選擇降維(datareduction)進(jìn)行因素分析，得到兩個(gè)大于I的特征值，累計(jì)貢獻(xiàn)率大于80%。通過主成分載荷矩陣中的數(shù)據(jù)除以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值開平方根即可得到主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù)，將該系數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，就可以獲得主成分表達(dá)式:
[0115](I)四川決明子、安徽決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖GC指紋圖譜數(shù)據(jù)的主成分分析
[0116]主成分I:Fl=-0.381ΖΧ「0.396ΖΧ2+0.284ΖΧ3+0.43ΖΧ4+0.424ΖΧ5_0.394ΖΧ6+0.31IZX7
[0117]主成分2:F1=0.43ΖΧ1+0.405ΖΧ2+0.399ΖΧ3+0.145ΖΧ4+0.221ΖΧ5+0.31ΖΧ6+0.57IZX7
[0118]以主成分I和2作圖，得到四川決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖主成分分析的二維散點(diǎn)圖4。從圖4可直觀地看出標(biāo)準(zhǔn)決明子樣品之間的距離，部分批次間的距離相差較遠(yuǎn)。在此分析條件下，四川決明子和標(biāo)準(zhǔn)決明子區(qū)分不明顯，安徽決明子可與其他明顯區(qū)分。
[0119](2)四川決明子、安徽決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖HPLC指紋圖譜一數(shù)據(jù)的主成分分析
[0120]主成分I:Fl=-0.52ΖΧ1+0.365ΖΧ2+0.26ΖΧ3_0.399ΖΧ4+0.232ΖΧ5+0.225ΖΧ6+0.514Ζ
X7
[0121]主成分2:F2=0.1lZX1-0.256ΖΧ2+0.579ΖΧ3+0.245ΖΧ4+0.58ΖΧ5_0.422ΖΧ6+0.112ΖΧ7
[0122]以主成分I和2作圖，得到四川決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖主成分分析的二維散點(diǎn)圖5。從圖5可直觀地看出標(biāo)準(zhǔn)決明子樣品之間的距離差別不大，同屬一類別。在此分析條件下，四川決明子和安徽決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子區(qū)分明顯，分別為其他兩類別。
[0123](3)四川決明子、安徽決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖HPLC指紋圖譜二數(shù)據(jù)的主成分分析
[0124]主成分1:Fl=-0.ΙδδΖΧ^Ο.436ΖΧ2+0.398ΖΧ3+0.423ΖΧ4_0.309ΖΧ5_0.077ΖΧ6_0.039ΖΧ7+0.447ΖΧ8+0.369ΖΧ9
[0125]主成分2:F2=0.5362^-0.043ΖΧ2_0.104ΖΧ3+0.227ΖΧ4+0.273ΖΧ5+0.253ΖΧ6+0.618ΖΧ7+0.164ΖΧ8+0.319ΖΧ9[0126]以主成分I和2作圖，得到四川決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖主成分分析的二維散點(diǎn)圖6。從圖6可直觀地看出標(biāo)準(zhǔn)決明子樣品之間的距離差別為同屬一類別。在此分析條件下，四川決明子和安徽決明子與標(biāo)準(zhǔn)決明子區(qū)分明顯，分別為其他兩類別。
[0127]由以上結(jié)果可知，通過與標(biāo)準(zhǔn)決明子多糖的GC指紋圖譜、HPLC指紋圖譜一和二比較，四川決明子、安徽決明子能夠得以明顯區(qū)分，滿足決明子多糖的質(zhì)量控制條件。
[0128]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用指紋圖譜來有效控制決明子多糖質(zhì)量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟一、構(gòu)建決明子標(biāo)準(zhǔn)品多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜:選取標(biāo)準(zhǔn)決明子原料，共10批次，分別構(gòu)建決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜、決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜以及決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，構(gòu)建三維標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜； 所述決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的糖腈乙酸酯衍生化，隨后采用氣相色譜法分析供試品溶液，最終獲得決明子多糖GC指紋圖譜； 所述決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行完全水解，隨后進(jìn)行決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(即PMP)衍生化反應(yīng)，再進(jìn)行高效液相色譜的指紋分析，最終按照獲得的結(jié)果繪制決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜； 所述決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建是先將決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行不完全水解，隨后進(jìn)行決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(即PMP)衍生化反應(yīng)，再進(jìn)行高效液相色譜的指紋分析，最終按照獲得的結(jié)果繪制決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜； 步驟二、采用上述步驟一中決明子標(biāo)準(zhǔn)品多糖標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的確定方法，繪制實(shí)際送樣決明子的決明子多糖GC指紋圖譜、決明子多糖完全水解下的HPLC指紋圖譜以及決明子多糖不完全水解下的HPLC指紋圖譜； 步驟三、將步驟二獲得的結(jié)果分別與步驟一中的三維標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，當(dāng)相似度均大于90%以上，則表明所述實(shí)際送樣中的決明子多糖合格。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建具體包括如下步驟: (1)決明子多糖標(biāo)準(zhǔn)品水解產(chǎn)物的糖腈乙酸酯衍生化:將三氟乙酸水解減壓蒸干后的樣品，依次加入IOmg的鹽酸羥胺和0.5ml無水吡啶，超聲溶解，于90°C恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)40min，反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，加入0.6ml的乙酸野，超聲混勾，90 C恒溫水浴振湯中反應(yīng)40min，得糖腈乙?；苌铮苯舆M(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行檢測； (2)采用氣相色譜法分析供試品溶液:色譜柱為AgilentDB-5毛細(xì)管色譜柱(30m X 0.32mm X 0.25 μ m);燃?xì)?、輔助氣及載氣的比例為N2: H2: Air=40: 45: 400ml / min ;分流比:10: I ;進(jìn)樣量:2μ L ;進(jìn)樣口溫度:220°C；檢測器溫度:260°C ;采用程序升溫，其升溫程序?yàn)?起始溫度70°C，保持8min ；30°C / min升至 160°C，保持 19min ；10°C / min 升至 170°C ;保持 29min ；10°C / min 升至 220°C，保持4min;在此條件下獲得樣品多糖的色譜指紋圖譜，以I號(hào)峰(甘露糖)為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積，最終獲得決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，所述決明子多糖GC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下: I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ；
2號(hào)峰平均 RT 為 1.042，RSD 為 0.170% ；
3號(hào)峰平均 RT 為 1.090，RSD % 0.511% ；
4號(hào)峰平均 RT 為 1.199，RSD 為 0.096% ；5號(hào)峰平均 RT 為 1.807，RSD 為 0.559% ；
6號(hào)峰平均 RT 為 1.841，RSD 為 0.397% ； 7號(hào)峰平均 RT 為 1.964，RSD 為 0.505%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述經(jīng)完全水解或不完全水解的決明子多糖的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的構(gòu)建具體包括如下步驟: (I)決明子多糖水解液的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化過程:將多糖水解物用水溶解，然后轉(zhuǎn)容到IOml容量瓶并定容，準(zhǔn)確量取定容好的多糖水解液0.2ml置于5ml具塞玻璃離心管中，依次加入0.2ml,0.5mol / L的PMP甲醇溶液和0.2ml,0.3mol /L的NaOH溶液，超聲混勻，70°C水浴反應(yīng)60min，冷至室溫，加0.2ml, 0.3mol / L的HCl溶液中和，向離心管中加氯仿至2ml，高速渦旋lmin，萃取剩下的PMP，4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，移除下層有機(jī)相，保留上清液，采用2mL氯仿重復(fù)萃取3次，最后小心吸出全部上清液，加水稀釋定容至5ml，過0.22 μ m的微孔濾膜，供HPLC檢測用；混標(biāo)樣品的PMP衍生化處理方法與樣品液相同，所述混標(biāo)樣品的濃度為0.1mg / ml ； (2)色譜條件:色譜柱為C18(250X4.60mm,5y );流動(dòng)相:18% 乙腈-82%磷酸鹽緩沖液(0.05mol / ml ；pH=6.74)；流動(dòng)相流速為0.8ml / min ;柱溫為室溫；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為245nm ;進(jìn)樣量:20yL;以I號(hào)峰(甘露糖)為參照，計(jì)算樣品中各峰的相對(duì)保留時(shí)間，以峰面積歸一化法計(jì)算樣品圖譜各峰的相對(duì)面積。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，決明子多糖完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下: I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ；
2號(hào)峰平均 RT 為 1.607，RSD 為 0.640% ；
3號(hào)峰平均 RT 為 1.840，RSD 為 1.243% ；
4號(hào)峰平均 RT 為 2.093，RSD 為 1.323% ；
5號(hào)峰平均 RT 為 2.393，RSD 為 1.839% ；
6號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 1.424% ； 7號(hào)峰平均 RT 為 2.611，RSD 為 1.752%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，決明子多糖不完全水解下的HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜如下: I號(hào)峰平均RT為1，RSD為0% ；
2號(hào)峰平均 RT 為 1.058，RSD 為 0.353% ；
3號(hào)峰平均 RT 為 1.125，RSD 為 0.506% ；
4號(hào)峰平均 RT 為 1.503，RSD 為 0.479% ；
5號(hào)峰平均 RT 為 1.668，RSD 為 0.841 % ；
6號(hào)峰平均 RT 為 2.015，RSD 為 0.405% ；
7號(hào)峰平均 RT 為 2.293，RSD 為 0.528% ；
8號(hào)峰平均 RT 為 2.365，RSD 為 0.496% ； 9號(hào)峰平均 RT 為 2.500，RSD 為 0.545%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述決明子多糖的提取包括如下步驟: 稱取1.0g過40目的決明子樣品，以石油醚(30-60°C)回流脫脂8h，將脫脂干燥后的決明子樣品加水100ml，在80°C水浴并磁力攪拌3h，合并濾液；準(zhǔn)確稱取木瓜蛋白酶0.01g,加入到濾液中，置于60°C恒溫水浴振蕩器中，緩慢振蕩2h，冷卻至室溫；在上述酶解液中加入5OmL的sevaga液,在恒溫振蕩器上快速振蕩20min,將混合液體以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，分相后取其上清液，再重復(fù)上述“sevaga法除蛋白”的過程，直至上下兩相間無乳白色絮狀沉淀，以除盡提取液中的植物蛋白；然后往提取液加入15% (V / V)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的H2O2，置于60°C水浴中反應(yīng)6h ;將脫色后的提取液緩慢滴入無水乙醇(按其體積的4倍)，同時(shí)置于磁力攪拌器上快速攪拌，室溫靜置3小時(shí)，4000rpm轉(zhuǎn)速下離心IOmin取沉淀；所得沉淀中加入IOml丙酮，于超聲清洗器中超聲5min，再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心5min，重復(fù)一次；在離心后的殘?jiān)屑尤隝Oml無水乙醚，超聲洗滌5min，離心，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心IOmin,重復(fù)洗滌一次，將離心后所得的殘?jiān)玫獨(dú)獯蹈?，稱重，密封，冰箱中保存，備用，制得本發(fā)明的粗多糖樣品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述完全水解步驟為: 精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml，0.5mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解3h，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理4次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。本發(fā)明構(gòu)建決明子多糖GC指紋圖譜和決明子多糖完全水解下的HPLC指紋圖譜均是采用該完全水解后的多糖樣品。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述不完全水解步驟為: 精密稱取粗多糖樣品10mg，置于5mL安剖瓶中，加入2.0ml, 0.05mol / L的TFA溶液，用酒精噴燈封口，置于110°C水解lh，反應(yīng)完成后，將樣品取出，冷卻至室溫，采用甲醇潤洗轉(zhuǎn)移至5mL的離心管中，4000rpm離心5min ;取上清液，轉(zhuǎn)溶到圓底燒瓶，70°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇超聲溶解，50°C旋干，重復(fù)處理3次以除去殘留的TFA，減壓蒸干后的樣品，備用。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103837618SQ201410100709
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】高新開, 熊斌, 林偉斌, 龍鳳 申請(qǐng)人:無限極（中國）有限公司