一種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物分析【技術領域】，涉及一種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種枳實藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜及其建立方法，以及枳實藥材HPLC指紋圖譜和/或標準指紋圖譜在鑒別枳實藥材中的用途。具體地，枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，包括下述步驟：（1）枳實供試品的制備，和（2）高效液相色譜分析方法。本發(fā)明還涉及一種鑒別枳實藥材的方法。本發(fā)明適于對枳實藥材真?zhèn)魏唾|量進行鑒別。
【專利說明】一種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物分析【技術領域】，涉及一種枳實藥材指紋圖譜、其建立方法及用途。具體地，本發(fā)明涉及一種枳實藥材高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜及其建立方法，以及枳實藥材HPLC指紋圖譜和/或標準指紋圖譜在鑒別枳實藥材中的用途。本發(fā)明還涉及一種鑒別枳實藥材質量(是否合格)的方法。
【背景技術】
[0002]中藥指紋圖譜是指某種(或某產地)中藥材或中成藥經適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示該中藥材或中成藥藥物特性的共有峰的圖譜。指紋圖譜從中醫(yī)整體觀念和中藥藥效來自多種化學物質綜合作用的觀點出發(fā)，能夠建立比較客觀、整體和多指標的綜合評價體系，并通過圖譜的整體特征，能夠比較全面地反映出中藥所含化學成分的種類與數(shù)量，是一種綜合的、可量化的質量控制手段。與測定單一組分相比，它的優(yōu)勢在于能夠提供更豐富、有效的質和量的信息，因此指紋圖譜技術可以更客觀、科學、合理地進行中藥質量控制。中藥指紋圖譜能較為宏觀和綜合地反映中藥的內在質量已被國內外研究者所認可。
[0003]枳實為常用中藥藥材，古有“橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳”的名句，其在經典名方中多有使用，《傷寒雜病論》中用枳實之方有十七，如枳實薤白桂枝湯、大柴胡湯等。枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aruantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破氣消積，化痰散痞的功效。
[0004]枳實中的主要活性成分為揮發(fā)油、黃酮類化合物和少量生物堿類化合物。其中，揮發(fā)油類主要成分為右旋檸檬烯、枸櫞酸等；生物堿類成分主要為辛弗林、N-甲基酪胺；黃酮類成分主要為柚皮苷、新橙皮苷及橙皮苷(張紅，孫明江，王凌.枳實的化學成分及藥理作用研究進展.中藥材，2009，32 (11): 1787-1789)。
[0005]2010版藥典規(guī)定，以辛弗林作為枳實質量控制的指標(國家藥典委員會編，中華人民共和國藥典2010年版，北京:化學工業(yè)出版社，2010，一部:230)。這種采用單一指標進行中藥質量控制的方法不能全面反映中藥內在化學成分的種類和數(shù)量，進而反映中藥質量，此外，測定辛弗林含量的方法相對比較復雜。因此，目前亟需新的有效檢測和鑒定枳實藥材且操作相對簡便的方法。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明人經過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了一種枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立方法并且得到了枳實藥材HPLC標準指紋圖譜。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該建立方法和枳實藥材HPLC標準指紋圖譜能夠用于鑒定或者鑒別枳實藥材質量是否合格，具有較高的可信度和極高的靈敏度。由此提供了下述發(fā)明:
[0007]本發(fā)明的一個方面涉及一種枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，包括下述步驟:
[0008]( I)枳實供試品(例如供試品溶液)的制備，和[0009](2)高效液相色譜分析方法。
[0010]根據本發(fā)明任一項所述的建立方法，其中，所述步驟(I)包括:
[0011]I)稱取枳實藥材，加入5 — 15倍量(ml/g)的蒸餾水回流提取I — 5次，每次I —5h ；
[0012]2)將提取物過濾，合并濾液；將濾液濃縮，得到濃縮液；
[0013]3)向濃縮液中加入無水乙醇，至乙醇含量為50% - 90%，均勻攪拌，靜置I 一 24小時，離心，得到沉淀；
[0014]4)用50% - 90%乙醇洗滌沉淀，離心，合并上清，濃縮除醇，將得到的提取液冷凍干燥，得到供試品；
[0015]優(yōu)選地，還包括:
[0016]5)精密稱取供試品，用50% - 90%的甲醇定容，以微孔濾膜過濾，得到枳實供試品溶液。
[0017]根據本發(fā)明任一項所述的建立方法，其特征在于如下的A — H項中的任意一項或者多項:
[0018]A.步驟I)中，加入8 — 12倍量(例如8、9、10、11、12)的蒸餾水；
[0019]B.步驟I)中，回流提取2 — 4次(例如2、3或4次)；
[0020]C.步驟I)中，回流提取2 — 4小時(例如2、3或4小時)；
[0021]D.步驟 3)中，至乙醇含量為 60% — 80% (例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或80%)；
[0022]E.步驟3)中，靜置時間為5 — 15小時(例如8 — 12小時、8、9、10、11或12小時)；
[0023]F.步驟 4)中，乙醇濃度為 60% - 80%(例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或 80%);
[0024]G.步驟3)和4)中，所述離心獨立地為5 — 50min, 1500 — 5000rpm (例如為15 —30min, 2000 — 3000rpm 或者 25min, 2500rpm);和
[0025]H.步驟 5)中，甲醇濃度為 60% - 80%(例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或 80%)。
[0026]根據本發(fā)明任一項所述的建立方法，其中，所述步驟(I)包括:
[0027](1-1)稱取枳實藥材10g，加入IOOmL蒸餾水回流提取2次，每次2h，過濾，合并兩次濾液；適當濃縮后，加入無水乙醇，至乙醇含量為70%，均勻攪拌，靜置過夜，25min，2500rpm離心,用70%乙醇洗漆沉淀,25min, 2500rpm離心,合并上清,濃縮除醇,將得到的提取液冷凍干燥，得到供試品；
[0028]優(yōu)選地，還包括:
[0029](1 — 2)精密稱取枳實中等極性部位樣品0.0200g,用50%甲醇定容至IOmL容量瓶中，以0.45 μ m微孔濾膜過濾，得到枳實供試品溶液。
[0030]根據本發(fā)明任一項所述的建立方法，其中，所述步驟(2)包括:
[0031]色譜柱填料為Agilent TC-C18 ;流動相為含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脫；梯度洗脫條件為:0min — 20min — 45min — 60min — 75min — 77min,乙腈3% — 20% — 20% — 30% — 80% — 100% ;流速 1.0mL/min ;檢測波長為 240 — 310nm ;柱溫30°C ;進樣量為2 — 20 μ L ;得到枳實藥材指紋圖譜；
[0032]具體地,所述步驟(2)包括:
[0033]色譜柱填料為Agilent TC-C18，規(guī)格為250mmX 4.6mm，5 μ m ;流動相為含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脫；梯度洗脫條件為:Omin — 20min — 45min — 60min — 75min — 77min,乙腈 3% — 20% — 20% — 30% — 80% — 100% ;流速 1.0mL/min ;檢測波長為 240_310nm ;柱溫30°C ;進樣量為20 μ L ;得到枳實藥材指紋圖譜。
[0034]在上述條件下分析供試品或供試品溶液，得到枳實藥材指紋圖譜。
[0035]不拘于理論的限制，本發(fā)明人進行了大量的實驗研究，在生成的譜圖中提取不同波長段的色譜圖，發(fā)現(xiàn)當檢測波長為240 - 310nm時，得到的圖譜5分鐘前的雜質峰最小，樣品特征峰最豐富。
[0036]本發(fā)明的另一方面涉及一種枳實藥材HPLC指紋圖譜，其由本發(fā)明中任一項所述的建立方法得到。
[0037]本發(fā)明的再一方面涉及一種枳實藥材標準HPLC指紋圖譜，其有17個共有特征峰，保留時間分別為:18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.llmin、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min和75.93min ;或者其保留時間與上述各保留時間的RSD〈0.10%、〈0.07%、〈0.06% 或〈0.05%。
[0038]本發(fā)明中，枳實藥材標準HPLC指紋圖譜還可以為使用單批次或者多批次枳實道地藥材并且按照本發(fā)明中任一項所述的建立方法得到的HPLC指紋圖譜；可選地，將使用多批次枳實道地藥材并且按照本發(fā)明中任一項所述的建立方法得到的HPLC指紋圖譜通過平均數(shù)法或者中位數(shù)法制成對照譜圖，作為枳實藥材標準HPLC指紋圖譜。
[0039]按照本發(fā)明提供的方法，測定了 8批枳實藥材，確定了 17個共有特征峰。
[0040]不拘于理論的限制，對于共有峰的選取，可以通過指紋圖譜相似度評價軟件進行。
[0041]不拘于理論的限制，盡管藥材的指紋圖譜受很多因素影響，比如產地、炮制方法等，因此不能說如果不具有全部17個峰，就不是枳實藥材。但可以肯定的是，如果圖譜的全貌和標準圖譜完全不能匹配，則可以認為是偽品。
[0042]本發(fā)明的再一方面涉及一種鑒別枳實藥材質量的方法，包括將待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜與枳實藥材標準HPLC指紋圖譜進行比較的步驟；具體地，所述待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜為使用待檢枳實藥材并且按照本發(fā)明中任一項所述的建立方法得到；具體地，所述枳實藥材標準HPLC指紋圖譜為本發(fā)明所述的枳實藥材標準HPLC指紋圖譜。
[0043]根據本發(fā)明任一項所述的鑒別方法，其中，待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜與枳實藥材標準HPLC指紋圖譜的相似度如果不低于0.85，則為質量合格；如果低于0.85，則為不合格；具體地，所述相似度通過國家藥監(jiān)局頒布的指紋圖譜相似度評價軟件得到。
[0044]不拘于理論的限制，2010版藥典中，一般是規(guī)定在給定檢測條件下，樣品與標準指紋圖譜的相似度不低于某個值(這個值通常在0.85 - 0.95之間)(相似度的計算可以通過把標準品和樣品的色譜圖導入到相似度評價軟件中進行)，如果低于這個值(0.85)，則認為其品質是不合格的。
[0045]本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明的枳實藥材HPLC指紋圖譜和/或本發(fā)明的枳實藥材標準HPLC指紋圖譜在鑒別枳實藥材真?zhèn)位蛘哞b別枳實藥材質量(是否合格)中的用途。
[0046]本發(fā)明中，所述乙醇或者甲醇的含量或者濃度，如果沒有特別說明，均為體積濃度或者體積百分含量。
[0047]有益效果:[0048]1.將枳實藥材作為一個整體對待，通過比較其共有峰可以找出不同藥材之間的細
微差異。
[0049]2.該方法提取了一段波長的色譜圖，可以更全面的反應樣品的特征峰信息。
[0050]3.該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較好。
[0051]4.適于對枳實藥材真?zhèn)魏推焚|進行鑒別。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1:第I批枳實藥材的HPLC指紋圖譜；其中I 一 17為枳實藥材共有特征峰?？勺鳛闃藴手讣y圖譜。
[0053]圖2:8批樣品根據中位數(shù)法生成的對照譜圖；其中I 一 17為枳實藥材共有特征峰?？勺鳛闃藴手讣y圖譜。
[0054]圖3:為實施例3中檢測到的兩批質量有問題的藥材與標準指紋圖譜對比圖?！揪唧w實施方式】
[0055]下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。其中，所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
[0056]實施例1:枳實藥材HPLC指紋圖譜的律立和駘證
[0057]1、儀器與試藥
[0058]島津(SHIMADZU) LC20A高效液相色譜儀，配有LC-20AT 二元泵、SPD-M20A 二級管陣列檢測器、CT0-20A柱溫箱和SIL-20AC自動進樣器、LCsolution色譜工作站管理軟件以及在線脫氣裝置。
[0059]水為純凈水；甲醇及乙腈均為色譜純；其余試劑為分析純。
[0060]8批枳實藥材均購自正規(guī)藥店的道地藥材(附帶有根據藥典的檢測報告)。
[0061]2、枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立
[0062]2.1供試品溶液的制備:稱取第I批枳實藥材10g，加入IOOmL蒸餾水回流提取2次，每次2h，過濾，合并兩次濾液。適當濃縮后，加入無水乙醇，至乙醇含量為70%，均勻攪拌，靜置過夜，離心(25min，2500rpm)，用70%乙醇洗滌沉淀，離心(25min，2500rpm)，合并上清，濃縮除醇，將得到的提取液冷凍干燥，得到枳實中等極性部位樣品。精密稱取上述樣品
0.0200g,用50%甲醇定容至IOmL容量瓶中，以0.45 μ m微孔濾膜過濾，得到枳實供試品溶液。
[0063]2.2高效液相色譜分析:色譜柱填料為Agilent TC-C18,規(guī)格為250mmX4.6mm,5μηι;流動相為乙腈-水(含0.1%甲酸)梯度洗脫；梯度洗脫條件為:0min — 20min — 45min—60min — 75min — 77min,乙腈 3% — 20% — 20% — 30% — 80% — 100% ;流速 1.0mL/min ;檢測波長為240 - 31Onm ;柱溫30°C ;進樣量為20 μ L。
[0064]得到第I批枳實藥材的HPLC指紋圖譜，如附圖1。
[0065]如附圖1所示，該指紋圖譜有17個共有特征峰，保留時間分別為:18.55min、20.07min、21.47min、21.76min、23.15min、27.64min、28.19min、29.78min、33.94min、37.03min、39.llmin、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min 和 75.93min,這17個特征峰構成了枳實藥材的指紋特征，可作為枳實藥材的標準指紋圖譜。
[0066]另外，不拘于理論的限制，附圖1最左邊有一個較為明顯的峰。這是因為在進行反相C18HPLC分析時，所有極性較大，超過了 C18分離能力的樣品都會在最前面出峰，這個峰通常是很多化合物的混合峰，通常被認為是雜質，無意義。
[0067]3、方法學驗證:
[0068]3.1精密度試驗:取2.1項供試品溶液按2.2項下條件連續(xù)6次進樣，考察各個共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD。結果顯示，相對保留時間RSD〈0.07%,相對峰面積RSD ^ 5.0%，精密度良好。
[0069]3.2穩(wěn)定性試驗:取2.1項供試品溶液按2.2項下條件，在0、2、4、6、12、24h分別進樣，考察各個共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD。結果顯示，相對保留時間RSD〈0.05%，相對峰面積RSD〈5.0%，穩(wěn)定相良好，可判斷樣品24h內基本穩(wěn)定。
[0070]3.3重復性試驗:按2.1項供試品溶液制備方法平行處理6份樣品，按2.2項條件分別測定，考察各個共有峰相對保留時間以及相對峰面積的RSD。結果顯示，相對保留時間RSD〈0.06%，相對峰面積RSD ^ 6.5%，該方法重復性良好。
[0071]4、相似度評價:
[0072]按照上面的第2項中相同的方法得到第2 - 8批枳實藥材的HPLC指紋圖譜。均存在17個特征峰。8批樣品根據中位數(shù)法生成的指紋譜圖如附圖2所示。 [0073]將8批樣品的HPLC圖譜導入國家藥監(jiān)局頒布的指紋圖譜相似度評價軟件進行評價，所獲得的相似度結果見下面的表1。
[0074]表1:相似度評價結果
[0075]
【權利要求】
1.一種枳實藥材HPLC指紋圖譜的建立方法，包括下述步驟: (1)枳實供試品的制備，和 (2)高效液相色譜分析方法。
2.根據權利要求1所述的建立方法，其中，所述步驟(1)包括: 1)稱取枳實藥材，加入5- 15倍量(ml/g)的蒸餾水回流提取I 一 5次，每次I 一 5h ; 2)將提取物過濾，合并濾液；將濾液濃縮，得到濃縮液； 3)向濃縮液中加入無水乙醇，至乙醇含量為50%- 90%，均勻攪拌，靜置I 一 24小時，離心，得到沉淀； 4)用50%- 90%乙醇洗滌沉淀，離心，合并上清，濃縮除醇，將得到的提取液冷凍干燥，得到供試品； 優(yōu)選地，還包括: 5)精密稱取供試品，用50%- 90%的甲醇定容，以微孔濾膜過濾，得到枳實供試品溶液。
3.根據權利要求2所述的建立方法，其特征在于如下的A— H項中的任意一項或者多項: A.步驟I)中，加入8— 12倍量(例如8、9、10、11、12)的蒸餾水； B.步驟I)中，回流提取2- 4次(例如2、3或4次)； C.步驟I)中，回流提取2— 4小時(例如2、3或4小時)； D.步驟3)中，至乙醇含量為 60% — 80% (例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或 80%)； E.步驟3)中，靜置時間為5— 15小時(例如8 - 12小時、8、9、10、11或12小時)； F.步驟4)中，乙醇濃度為 60% — 80% (例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或 80%)； G.步驟3)和4)中，所述離心獨立地為5- 50min, 1500 一 5000rpm (例如為15 —30min，2000 — 300rpm 或者 25min, 2500rpm);和 H.步驟5)中，甲醇濃度為 60% — 80% (例如 65% — 75%、60%、65%、70%、75% 或 80%)。
4.根據權利要求1所述的建立方法，其中，所述步驟(1)包括: (1-1)稱取枳實藥材10g，加入IOOmL蒸餾水回流提取2次，每次2h，過濾，合并兩次濾液；適當濃縮后，加入無水乙醇，至乙醇含量為70%，均勻攪拌，靜置過夜，25min，2500rpm離心，用70%乙醇洗滌沉淀，25min, 2500rpm離心，合并上清，濃縮除醇，將得到的提取液冷凍干燥，得到供試品； 優(yōu)選地，還包括: (1- 2)精密稱取枳實中等極性部位樣品0.0200g，用50%甲醇定容至IOmL容量瓶中，以0.45 μ m微孔濾膜過濾，得到枳實供試品溶液。
5.根據權利要求1所述的建立方法，其中，所述步驟(2)包括: 色譜柱填料為Agilent TC-C18 ;流動相為含0.1%甲酸的乙腈-水梯度洗脫；梯度洗脫條件為:0min — 20min — 45min — 60min — 75min — 77min,乙臆3% — 20% — 20% — 30% — 80% — 100% ;流速 1.0mL/min ;檢測波長為 240 — 31Onm ;柱溫30°C ;進樣量為2 — 20 μ L ;得到枳實藥材指紋圖譜； 具體地，所述步驟(2)包括: 色譜柱填料為Agilent TC-C18，規(guī)格為250mmX4.6mm，5 μ m ;流動相為含0.1%甲酸的乙腈_水梯度洗脫；梯度洗脫條件為:0min — 20min — 45min — 60min — 75min — 77min,乙腈 3% — 20% — 20% — 30% — 80% — 100% ;流速 1.0mL/min ;檢測波長為 240_310nm ;柱溫300C ;進樣量為20 μ L ;得到枳實藥材指紋圖譜。
6.一種枳實藥材HPLC指紋圖譜，其由權利要求1至5中任一項所述的建立方法得到。
7.一種枳實藥材標準HPLC指紋圖譜，其選自如下的(I)至(3)中的任意一項: (1)其有17個共有特征峰，保留時間分別為:18.55min、20.07min、21.47min、21.76min>23.15min>27.64min>28.19min>29.78min>33.94min>37.03min>39.llmin、43.42min、48.18min、65.71min、69.30min、74.43min 和 75.93min ;或者其保留時間與上述各保留時間的 RSD〈0.10%、〈0.07%、〈0.06% 或〈0.05% ； (2)使用單批次或多批次枳實道地藥材并且按照權利要求1至5中任一項所述的建立方法得到的枳實藥材HPLC指紋圖譜；和 (3)將使用多批次枳實道地藥材并且按照權利要求1至5中任一項所述的建立方法得到的HPLC指紋圖譜通過平均數(shù)法或者中位數(shù)法制成對照譜圖。
8.一種鑒別枳實藥材質量的方法，包括將待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜與枳實藥材標準HPLC指紋圖譜進行比較的步驟；具體地，所述待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜為使用待檢枳實藥材并且按照權利要求1至5中任一項所述的建立方法得到；具體地，所述枳實藥材標準HPLC指紋圖譜為權利要求7所述的枳實藥材標準HPLC指紋圖譜。
9.根據權利要求8所述的鑒別方法，其中，待檢枳實藥材的HPLC指紋圖譜與枳實藥材標準HPLC指紋圖譜的相似度如果不低于0.85，則為質量合格；如果低于0.85，則為不合格；具體地，所述相似度通過國家藥監(jiān)局頒布的指紋圖譜相似度評價軟件得到。
10.權利要求6的枳實藥材HPLC指紋圖譜和/或權利要求7的枳實藥材標準HPLC指紋圖譜在鑒別枳實藥材真?zhèn)位蛘哞b別枳實藥材質量中的用途。
【文檔編號】G01N30/02GK103837621SQ201410106425
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權日:2014年3月21日
【發(fā)明者】喬善義, 孫磊, 劉曉晴 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所