一種氧化損傷體外檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氧化損傷檢測方法及檢測試劑盒。所述方法包括以下步驟：（1）采集尿樣作為檢驗樣品；（2）向檢驗樣品中加入磷酸鹽緩沖溶液，使得溶液pH值在3.7至3.9之間或4.5至5之間；（3）加入品紅顯色劑，使得品紅濃度在0.04g/L至1.4g/L之間，靜置3～5min，根據溶液顏色深淺或348nm吸光值，按照溶液顏色越深或吸光值越大氧化損傷程度越高的原則，確定其氧化損傷程度。所述試劑盒包括磷酸鹽緩沖液制備的緩沖劑、品紅顯色劑和比色卡；所述比色卡包括5種顏色分別對應無損傷、輕度損傷、中度損傷、重度損傷和極重損傷。本發(fā)明提供的檢測方法及檢測試劑盒，穩(wěn)定性好，靈敏準確，儲存方便。
【專利說明】一種氧化損傷體外檢測方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領域，更具體地，涉及一種氧化損傷體外檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]隨著社會步伐的加快，人們的生活節(jié)奏的加快、工作壓力和競爭壓力的增大，導致大部分人群處于亞健康狀態(tài)?，F在出現的許多慢性疾病和發(fā)病率逐年上升的疾病如心血管疾病、心臟病和糖尿病等都跟人體產生自由基水平的多少密切相關，而自由基會通過對人體的氧化還原反應導致人體的氧化損傷?，F代社會生活中人們健康意識的逐漸增強和科技日新月異，在家庭中可以廣泛使用的快速診斷技術方興未艾，所以及時檢測和了解人體氧化損傷程度，并指導人們及時診治或通過改變不良的生活習慣和調節(jié)不好的飲食習慣，從而時刻處于健康狀態(tài)?；谝陨显颍叫枰环N氧化損傷體外快速檢測方法和產品。
[0003]現本領域內的主要專利有美國專利N0.6165797、有羅伯特*D ?埃布爾斯發(fā)明及梅迪-泰克控股公司申請的“用于檢測丙二醛的試劑、制備該試劑的方法以及使用該試劑的試劑盒”的公開番號為W02004/01191國際專利和日本申請的公開番號為W02004/11635A1的國際專利，申請?zhí)枮?3818036.7的中國專利。因美國專利N0.6165797為單組分，未能控制好PH值的影響而易出現假陽性，美國和日本申請的兩項國際專利大同小異，其用0.9~1.1mL的實驗樣品比約0.1~0.2mL的檢測試劑混合，實驗樣品為晨尿中段尿，檢測試劑是由IOg焦亞硫酸鈉、IOmL濃縮的磷酸、5g堿性品紅、約1000mL水組成的pH=l.88的溶液，約2~5分鐘后觀察顏色生成。
[0004]現有技術有兩方面問題:其主要存在有以下兩種問題:1.尿液的PH變化范圍較大，而檢測試劑緩沖能力不夠，導致反應PH值有較大的變化，結果易受pH值的影響從而出現較大偏差。2.選擇反應的pH值較高，在此pH值下顯色劑自身顯色且底色較深，會掩蓋尿液中醛類與檢測試劑產生的顏色反應，影響結果的準確性，甚至出現假陽性。

【發(fā)明內容】

[0005]針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種氧化損傷體外檢測方法及檢測試劑盒，其目的在于采用緩沖液和顯色劑雙組份試劑，兩個步驟的測試方法，由此解決檢測試劑緩沖能力不夠、反應PH值較高導致結果準確性低的技術問題。
[0006]為實現上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種氧化損傷檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0007]( I)采集尿樣作為檢驗樣品；
[0008](2)向檢驗樣品中加入pH值在3至5之間的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，使得溶液pH值在3.7至3.9之間或4.5至5之間；
[0009](3)向步驟(2)中的混合液，加入品紅顯色劑，混合均勻后使得品紅在最終混合液中濃度在0.04g/L至1.4g/L之間，靜置3~5min，根據溶液顏色深淺或348nm吸光值，按照溶液顏色越深或吸光值越大氧化損傷程度越高的原則，確定其氧化損傷程度。
[0010]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(I)中采集的尿樣為早晨中段尿樣。
[0011]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(2)中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為4mol/L至6mol/L。
[0012]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(3)品紅顯色劑，pH值在1.0至4.0之間，每升包括堿性品紅0.5g至15g和亞硫酸鹽0.03mol至0.35mol。
[0013]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(3)顯色劑，其制備步驟包括:
[0014](a)每稱取0.lg-3g堿性品紅試劑溶于200ml水，形成堿性品紅溶液；
[0015](b)向堿性品紅溶液中加入亞硫酸鹽0.006mol至0.07mol,溶解后用強酸調節(jié)pH值在1.0至4.0。
[0016](c)向步驟(b)得到的溶液中，按照質量比例0.5%至30%逐漸加純凈活化的活性炭，同時間斷震蕩至溶液無色，過濾。
[0017]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(3)顯色劑的制備方法步驟(b)中的強酸為濃硫酸、濃硝酸和/或濃鹽酸。
[0018]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(3)當溶液顏色在無色至微黃之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，溶液顏色在微黃至淺紅之間時，確定氧化損傷程度為輕度損傷，溶液顏色在淺紅至紅色之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，溶液顏色在紅色至深紅之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，溶液顏色在深紅至紫色之間時，確定氧化損傷程度為極重損傷。
[0019]優(yōu)選地，所述的檢測方法，其所述步驟(3)當溶液348nm處吸光值在0-0.2之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，當溶液348nm處吸光值在0.2-0.4之間時,確定氧化損傷程度為輕度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.4-0.6之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.6-0.8之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.8-1.0之間時,確定氧化損傷程度為極重損傷。
[0020]按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種氧化損傷檢測試劑盒，其特征在于，包括緩沖齊U、顯色劑和比色卡；所述緩沖劑為PH值在3.0至5.0之間，濃度在4mol/L至6mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑為無色的堿性品紅溶液，所述品紅溶液包括，0.5g/L至15g/L的堿性品紅，0.03mol/L至0.35mol/L的亞硫酸鹽，pH值在1.0至4.0之間；所述比色卡包括5種顏色分別對應無損傷、輕度損傷、中度損傷、重度損傷和極重損傷。
[0021]優(yōu)選地，所述的試劑盒，其緩沖劑和顯色劑的體積比為1:0.1-2。
[0022]優(yōu)選地，所述的試劑盒，其比色卡對應無損傷的顏色為無色至微黃，對應輕度損傷的顏色為微黃至淺紅，對應中度損傷的顏色為淺紅至紅色，對應重度損傷的顏色為紅色至深紅，對應極重損傷的顏色為深紅至紫色。
[0023]總體而言，通過本發(fā)明所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有益效果:
[0024]一.穩(wěn)定性更好。
[0025]1.基于溶液會隨二氧化硫的逐漸釋放和pH值的升高，有自身顯色的特點，我們把PH值調至更低的范圍，比現有技術更加穩(wěn)定、可靠。
[0026]2.用濃硫酸代替濃磷酸。通過我們的實驗數據可得，用濃硫酸配制的顯色劑要比用濃磷酸配制的保存時間要長和穩(wěn)定性要好。
[0027]3.采用雙組份的形式和緩沖能力更強的緩沖溶液。采用雙組份可以使顯色劑和緩沖溶液分開，有力降低試劑的PH值，使試劑更穩(wěn)定、保存時間更長。用l_7mol/L的磷酸鈉鹽緩沖溶液，緩沖能力更強，使尿液因PH值和緩沖能力的不同而導致反應pH值不同，從而導致反應后顏色變化程度不同的問題得以真正解決。
[0028]二.相關性更好。本顯色方法與公認的檢測丙二醛試劑盒TBA法對比，檢測結果的相關性更聞。
[0029]三.反應底色:本試劑與尿液反應的pH值較低，在此pH值條件下，顯色劑自身顯色的顏色值很低，而尿液與試劑反應的反應速率較快，能夠滿足要求。
[0030]四.儲存條件。相對于現有技術中要求的避光、密封和4°C低溫保存相比，我們產品可以在避光、密封的條件下室溫存放，且保存時間會更長。
[0031]五.制備過程更快、更方便、更環(huán)保。相對于現有技術，在除色過程中我們用活性炭來取代骨灰，因活性炭的高效的吸附能力和可以經過去吸附等處理后重復利用的優(yōu)點，不僅節(jié)省了用材，而且更加方便和環(huán)保。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1是本發(fā)明提供的氧化損傷體外檢測方法的流程圖；
[0033]圖2是spss軟件分析TBA法測量得到的吸光值與總醛量相關性結果圖；
[0034]圖3是溶液顏色和反應時間的關系圖；
[0035]圖4是品紅顯色劑底色吸光值隨反應體系pH值得變化關系圖。
[0036]在所有附圖中，相同的附圖標記用來表示相同的元件或結構，其中:
【具體實施方式】
[0037]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0038]本發(fā)明提供的氧化損傷檢測方法，包括以下步驟:
[0039](I)采集尿樣作為檢驗樣品。優(yōu)選地，采集早晨中段尿樣作為檢驗樣品。
[0040](2)向檢驗樣品中加入pH值在3至5之間的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，使得溶液pH至在3.7至3.9之間或4.5至5之間，優(yōu)選pH值范圍為3.7至3.9，更有選pH值為3.8。所述磷酸鹽緩沖溶液的濃度優(yōu)選為4mol/L至6mol/L，更優(yōu)選為5mol/L。在此濃度下，磷酸鹽緩沖能力強，使用體積小。
[0041](3)向步驟(2)中的混合液，加入品紅濃顯色劑使得品紅濃度在0.04g/L至1.4g/L之間，混合均勻后，靜置直至溶液顏色不再變深，根據溶液顏色損傷程度約高或348nm吸光值，按照溶液顏色越深或吸光值越大氧化損傷程度越高的原則，確定其氧化損傷程度。優(yōu)選地，靜置4分鐘后，溶液顏色較穩(wěn)定，適合觀察或吸光度測定。所述品紅顯色劑，pH值在
1.0至4.0之間，每升包括堿性品紅0.5g至15g和亞硫酸鹽0.03mol至0.35mol,優(yōu)選地，包括堿性品紅2.5g。所述顯色劑，其制備步驟包括:Ca)每稱取0.lg-3g堿性品紅試劑溶于200ml水，形成堿性品紅溶液，優(yōu)選地，稱取堿性品紅0.5g ; (b)向堿性品紅溶液中加入0.006mol至0.07mol亞硫酸鹽，溶解后用強酸調節(jié)pH值在1.0至4.0 ;所述強酸可為濃鹽酸、濃硫酸和/或濃硝酸，優(yōu)選地，采用濃硫酸調節(jié)PH值，由于采用濃硫酸較之濃磷酸能獲得更長的保存時間和更好的試劑穩(wěn)定性；所述濃鹽酸為質量分數超過34%的鹽酸溶液，常用為質量分數37%的鹽酸,所述濃硫酸為質量分數超過70%的硫酸溶液,常用為質量分數為98%的硫酸,所述濃硝酸為質量分數超過60%的硝酸溶液,常用為質量分數65%的硝酸；(c)向步驟(b)得到的溶液中，按照質量比例0.5%至30%逐漸加純凈活化的活性炭，同時間斷震蕩至溶液無色，過濾；所述純凈活化的活性炭優(yōu)選為鹽酸處理的活性炭，所述鹽酸濃度為1%至8% (質量比)。
[0042]當溶液顏色在無色至微黃之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，溶液顏色在微黃至淺紅之間時，確定氧化損傷程度為輕度損傷，溶液顏色在淺紅至紅色之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，溶液顏色在紅色至深紅之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，溶液顏色在深紅至紫色之間時，確定氧化損傷程度為極重損傷。所述顏色，按照三基色編碼分別為:微黃:Y10M0C0 ;淺紅:Y10M10C0 ;紅色:Y10M40C0 ;深紅:Y10M80C0 ;紫色:Y10M80C60。其中，Y、M、C分別表示三基色中的黃、品紅和藍色。相應的，可采用溶液348nm處吸光值作為更精確的判斷標準:當溶液348nm處吸光值在0-0.2之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，當溶液348nm處吸光值在0.2-0.4之間時，確定氧化損傷程度為輕度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.4-0.6之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.6-0.8之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.8-1.0之間時，確定氧化損傷程度為極重損傷。
[0043]本發(fā)明提供的氧化損傷檢測試劑盒，包括緩沖劑、顯色劑和比色卡；所述緩沖劑為pH值在3.0至5.0之間,濃度在4mol/L至6mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑為無色的堿性品紅溶液，所述品紅溶液包括，0.5g/L至15g/L的堿性品紅，0.03mol/L至0.35mol/L的亞硫酸鹽，PH值在1.0至4.0之間；所述比色卡包括5種顏色分別對應無損傷、輕度損傷、中度損傷、重度損傷和極重損傷。所述緩沖劑和顯色劑的體積比為1:0.1-2。所述比色卡對應無損傷的顏色為無色至微黃，對應輕度損傷的顏色為微黃至淺紅，對應中度損傷的顏色為淺紅至紅色，對應重度損傷的顏色為紅色至深紅，對應極重損傷的顏色為深紅至紫色。所述顏色，按照三基色編碼分別為:微黃:Y10M0C0 ;淺紅:Y10M10C0 ;紅色:Y10M40C0 ;深紅:Y10M80C0 ;紫色:Y10M80C60。其中，Y、M、C分別表示三基色中的黃、品紅和藍色。
[0044]一般認為尿液中丙二醛量可用于測定氧化損傷，本發(fā)明提供的方法能快速測定尿液中的總醛量，通過定量實驗得到不同PH值下總醛量和丙二醛在尿液中的濃度如表I所示，其中吸光度值按照本發(fā)明提供的方法測定，與總醛量成正比，MDA含量即硫代巴比妥酸檢測法(TBA法)測定的丙二醛含量。TBA法測量得到的吸光值與總醛量(MDA含量)的關系用統(tǒng)計軟件spsslS.0進行相關性分析，結果見圖2。由圖2可知，TBA法測量得到的吸光值與總醛量的相關性的P值為0.025，小于0.05，因此TBA法測量得到的吸光值與總醛量相關，也即丙二醛量與本發(fā)明提供的測量方法測量得到的吸光值相關。由于尿樣中丙二醛量可體現氧化損傷程度，因此本方法檢測得到的尿樣中總醛量也可作為氧化損傷程度的指標。
[0045]表1.顯色法和TBA法實測尿樣的結果
[0046]
【權利要求】
1.一種氧化損傷檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采集尿樣作為檢驗樣品； (2)向檢驗樣品中加入pH值在3至5之間的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻，使得溶液pH值在3.7至3.9之間或4.5至5之間； (3)向步驟(2)中的混合液，加入品紅顯色劑，混合均勻后使得品紅在最終混合液中濃度在0.04g/L至1.4g/L之間，靜置3~5min，根據溶液顏色深淺或348nm吸光值，按照溶液顏色越深或吸光值越大氧化損傷程度越高的原則，確定其氧化損傷程度。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中磷酸鹽緩沖溶液的濃度為 4mol/L 至 6mol/L。
3.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，所述步驟(3)品紅顯色劑，pH值在1.0至4.0之間，每升包括堿性品紅0.5g至15g和亞硫酸鹽0.03mol至0.35mol。
4.如權利要求3所述的檢驗方法，其特征在于，所述步驟(3)顯色劑，其制備步驟包括: Ca)每稱取0.lg-3g堿性品紅試劑溶于200ml水，形成堿性品紅溶液； (b)向堿性品紅溶液中加入亞硫酸鹽0.006mol至0.07mol,溶解后用強酸調節(jié)pH值在.1.0 至 4.0。 (c)向步驟(b)得到的溶液中，按照質量比例0.5%至30%逐漸加純凈活化的活性炭，同時間斷震蕩至溶液無色，過濾。
5.如權利要求4所述的檢驗方法，其特征在于，所述步驟(3)顯色劑的制備方法步驟(b)中的強酸為濃硫酸、濃硝酸和/或濃鹽酸。
6.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，所述步驟(3)當溶液顏色在無色至微黃之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，溶液顏色在微黃至淺紅之間時，確定氧化損傷程度為輕度損傷，溶液顏色在淺紅至紅色之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，溶液顏色在紅色至深紅之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，溶液顏色在深紅至紫色之間時，確定氧化損傷程度為極重損傷。
7.如權利要求1所述的檢驗方法，其特征在于，所述步驟(3)當溶液348nm處吸光值在.0-0.2之間時，確定氧化損傷程度為無損傷，當溶液348nm處吸光值在0.2-0.4之間時，確定氧化損傷程度為輕度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.4-0.6之間時，確定氧化損傷程度為中度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.6-0.8之間時，確定氧化損傷程度為重度損傷，當溶液348nm處吸光值在0.8-1.0之間時,確定氧化損傷程度為極重損傷。
8.一種氧化損傷檢測試劑盒，其特征在于，包括緩沖劑、顯色劑和比色卡；所述緩沖劑為pH值在3.0至5.0之間,濃度在4mol/L至6mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色劑為無色的堿性品紅溶液，所述品紅溶液包括，0.5g/L至15g/L的堿性品紅，0.03mol/L至0.35mol/L的亞硫酸鹽，pH值在1.0至4.0之間；所述比色卡包括5種顏色分別對應無損傷、輕度損傷、中度損傷、重度損傷和極重損傷。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述緩沖劑和顯色劑的體積比為1:0.1-2。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述比色卡對應無損傷的顏色為無色至微黃，對應輕度損傷的顏色為微黃至淺紅，對應中度損傷的顏色為淺紅至紅色，對應重度損傷的顏色為紅色至深紅，對應極重損傷的顏色為深紅至紫色。
【文檔編號】G01N21/78GK103901029SQ201410118249
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權日:2014年3月27日
【發(fā)明者】吳志剛, 周濤 申請人:華中科技大學