一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙及其制備方法，所述試紙為由磁性樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板組成的檢測試紙，且在硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)含有煙草花葉病毒包被抗體，所述質(zhì)控區(qū)含有能與煙草花葉病毒標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體；在磁性樣品墊加入待測樣品后，使用超順磁共振檢測儀MAR測定檢測區(qū)的磁場強(qiáng)度，通過與設(shè)定的臨界值比對而確定其陽性或陰性結(jié)果；質(zhì)控區(qū)的測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明提供的試紙實(shí)現(xiàn)了對煙草花葉病毒的客觀化測定，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明提供的制備方制作步驟簡單，節(jié)約成本。
【專利說明】一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測煙草中煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]煙草花葉病毒(TbAacco祖saic η>?5.,ΤΜν)是一類分布廣泛,并能夠感染多種植物的有害病毒，此病毒最早于1857年就曾被Swieten在煙草生長的反?，F(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)，并記載了感染此病毒的植物的病理特征。1886年Mayer首次將此病毒命名為“Mosaic”，并且通過一系列實(shí)驗(yàn)證明了此病毒具有傳染性。直到1939年，德國的科學(xué)家Kausche等利用電子顯微鏡技術(shù)第一次觀察到了煙草花葉病毒(TMV)的桿狀病毒顆粒。
[0003]煙草花葉病毒引起的植物病害在全世界煙葉種植地區(qū)均有發(fā)生，我國的南北煙葉種植區(qū)廣泛的存在此病害，尤以南方煙葉種植地區(qū)發(fā)病率為高。目前對于煙草病毒的診斷主要通過ELISA (酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)技術(shù))檢測和應(yīng)用電子顯微鏡檢測；ELISA是目前較為廣泛的方法，然而該方法必須要使用抗血清，商業(yè)渠道購買的抗血清價格昂貴且品種較少，無法滿足煙草生產(chǎn)上多種病毒病診斷的需要，自制抗血清程序復(fù)雜,產(chǎn)生的抗血清質(zhì)量往往不高，不宜用于準(zhǔn)確的診斷，同時對那些在植物體內(nèi)含量較低的病毒，該檢測方法往往靈敏度不夠，無法實(shí)現(xiàn)可靠的診斷。
[0004]由于傳統(tǒng)病毒診斷方法往往需要較長的時間，并且每次診斷只能針對單一的病原物，面對病毒復(fù)合浸染的情況往往顯得束手無策，有時甚至?xí)贸鲥e誤的結(jié)論，從而導(dǎo)致生產(chǎn)上大面積防治措施不能及時到位。因此急需研究一種靈敏度高、測試準(zhǔn)確、穩(wěn)定性強(qiáng)的煙草花葉病毒診斷試紙。
[0005]超順磁性復(fù)合粒子具有良好的磁學(xué)特性，由于其受背景干擾小，特別適宜于不含磁性物質(zhì)的生物樣品的檢測。而應(yīng)用廣泛的膠體金標(biāo)記分子和熒光標(biāo)記分子在用于測流免疫層析檢測時，只可在其檢測區(qū)膜表面觀測到約10%的信號分子強(qiáng)度，而用超順磁性復(fù)合粒子作為標(biāo)記材料，則可檢測到檢測區(qū)膜三維立體結(jié)構(gòu)中的所有磁信號分子，可極大提高靈敏度，并可用對應(yīng)的磁信號檢測儀實(shí)現(xiàn)定量測定，因此，超順磁性復(fù)合粒子成為近年來在LFIAs中最受:關(guān)注的材料。
[0006]然而，目前的生物檢測用磁性納米復(fù)合粒子多采用化學(xué)法如共沉淀法先制備得到有機(jī)相的磁性納米粒子，再采用硅(SiO2)或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明膠等高分子材料對其表面進(jìn)行穩(wěn)定化包覆修飾，以得到穩(wěn)定的、水溶性的磁性標(biāo)記材料。上述制備修飾方法往往較為繁瑣復(fù)雜，得到的超順磁性復(fù)合粒子在尺寸大小、生物相容性、飽和磁強(qiáng)度、外磁場響應(yīng)速度、穩(wěn)定性和標(biāo)記效率等方面不能同時滿足LFIAs的要求:其尺寸多在200-300nm之間，由于磁珠顆粒偏大，在試紙上的泳動時間較慢，顯色時間較長；而太小的粒子又無法提供足夠的磁共振信號；另外還有生物相容性不穩(wěn)定、磁珠容易聚合等問題；這上述不足限制了超順磁性復(fù)合粒子在LFIAs中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題進(jìn)行研究，力求開發(fā)一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便的完成檢測的磁性試紙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的第一目的在于提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、測定準(zhǔn)確，可應(yīng)用于煙草花葉病毒檢測的磁性免疫層析試紙。
[0009]本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，該試紙包括含有煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的磁性樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板，所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)含有煙草花葉病毒包被抗體，所述質(zhì)控區(qū)含有能與所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體。
[0010]所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體為煙草花葉病毒抗體和超順磁性復(fù)合粒子以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體。
[0011]所述超順磁性復(fù)合粒子為粒徑為lOOnm、磁飽和強(qiáng)度為40 emu/g,對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性Fe3O4納米粒子。
[0012]所述煙草花葉病毒抗體的親和常數(shù)為IO8 M'
[0013]所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體。
[0014]所述煙草花葉病毒包被抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體；所述抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。
[0015]所述煙草花葉病毒包被抗體的濃度為2 mg /ml，所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為I
mg /ml ο
[0016]所述磁性樣品墊采用玻璃纖維膜制作。
[0017]本發(fā)明的第二目的在于提供一種制備上述檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的方法。
[0018]本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟:
A、制備煙草花葉病毒標(biāo)記抗體:
1)將2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0.96mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U.15mg 的 N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和 Iml 0.1M MES 緩沖液(pH=4.7)混勻，在 37° C溫度條件下反應(yīng)0.5h，得到活化后磁性粒子；
2)將步驟I中得到的活化后磁性粒子、0.15mg煙草花葉病毒抗體和0.8ml濃度為50mM, pH為8.5的硼砂緩沖液混勻，在37° C溫度條件下反應(yīng)3.5h，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；
3)將步驟2中得到的反應(yīng)液中加入濃度為5%的BSA混勻，在37°C溫度條件下反應(yīng)
0.5h，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；
4)將步驟3中得到的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子用0.02M PBS緩沖液(pH=7.4)進(jìn)行洗滌、懸浮，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體，4 °(:保存待用；
B、制備設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜:
將所述煙草花葉病毒包被抗體和抗抗體分別噴在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，然后放入干燥室中干燥；
C、制備含有煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的磁性樣品墊: 將步驟A中制得的煙草花葉病毒標(biāo)記抗體用緩沖液稀釋50倍，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液；將玻璃纖維膜在溫度為37°C的緩沖液中浸泡I小時；用上述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液噴涂上述玻璃纖維膜，得到磁性樣品墊，然后放入干燥室中干燥；
D、將所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，4°C貯存。
[0019]所述步驟C中使用的緩沖液由2ml TritonX100、10g BSA、50g鹿糖和950ml濃度為0.02M、pH為7.4的PBS緩沖液混合得到，調(diào)節(jié)pH至7.4，并定容到IOOOml。
[0020]本發(fā)明提供了一種由磁性樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板組成的檢測試紙，且在硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)含有煙草花葉病毒包被抗體，所述質(zhì)控區(qū)含有能與所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體；在磁性樣品墊加入待測樣品后，基于測流免疫層析原理，樣品中的煙草花葉病毒與煙草花葉病毒標(biāo)記抗體結(jié)合后層析到檢測區(qū)處噴涂的煙草花葉病毒包被抗體，在檢測區(qū)處形成煙草花葉病毒包被抗體-抗原-煙草花葉病毒標(biāo)記抗體免疫復(fù)合物；同時，多余的煙草花葉病毒標(biāo)記抗體則在質(zhì)控區(qū)處與抗抗體結(jié)合形成煙草花葉病毒標(biāo)記抗體-抗抗體免疫復(fù)合物；使用超順磁共振檢測儀MAR測定檢測區(qū)的磁場強(qiáng)度，通過與設(shè)定的臨界值比對而確定其陽性或陰性結(jié)果；質(zhì)控區(qū)的測定結(jié)果則作為該測定方法的質(zhì)控內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明提供的試紙實(shí)現(xiàn)了對煙草花葉病毒的客觀化測定，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明中檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022]圖中:1為磁性樣品墊、2為硝酸纖維素膜、3為吸水墊、4為檢測區(qū)、5為質(zhì)控區(qū)、6為背板。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明所作的任何變換，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0024]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到，即屬于現(xiàn)有技術(shù)。
[0025]實(shí)際檢測過程中，所述超順磁性復(fù)合粒子要由磁性樣品墊泳動至硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，在檢測區(qū)發(fā)生煙草花葉病毒包被抗體-抗原-煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的反應(yīng)，在質(zhì)控區(qū)發(fā)生煙草花葉病毒標(biāo)記抗體-抗抗體的反應(yīng)；若超順磁性復(fù)合粒子的粒徑太大(>300nm)，則在試紙上的涌動時間長，測試慢；同時，在偶聯(lián)時較容易發(fā)生聚集，并容易產(chǎn)生非特異反應(yīng)；而粒徑太小則磁強(qiáng)度往往不夠。因此在選擇標(biāo)記材料時，優(yōu)選粒徑為80-200nm的超順磁性復(fù)合粒子。
[0026]超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強(qiáng)度及其外磁場響應(yīng)速度直接決定了檢測靈敏度和檢測精確性，傳統(tǒng)方法制備的超順磁性復(fù)合粒子的飽和磁強(qiáng)度通常都〈30 emu/g,外磁場響應(yīng)速度則在100?200秒。為提高檢測靈敏度及檢測準(zhǔn)確性，優(yōu)選磁飽和強(qiáng)度為35?70emu/g，對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20?50秒的超順磁性復(fù)合粒子。[0027]為將超順磁性復(fù)合粒子用于煙草花葉病毒檢測，超順磁性復(fù)合粒子表面需帶有易于與煙草花葉病毒抗體偶聯(lián)的基團(tuán)，這些基團(tuán)可以是羧基、氨基等基團(tuán)，優(yōu)選的基團(tuán)是帶羧基的表面官能團(tuán)，通常采用化學(xué)方法連接抗體，即用EDC和NHS活化超順磁性復(fù)合粒子后，再與抗體發(fā)生羧合反應(yīng)而完成偶聯(lián)反應(yīng)。超順磁性復(fù)合粒子表面的羧基含量不同會影響到檢測的靈敏度，為提高靈敏度，優(yōu)選羧基含量為50?300 μ mol/g的活化后磁性粒子。
[0028]本發(fā)明采用的超順磁性復(fù)合粒子購自深圳市泰勒斯科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MP-2，該公司所采用的制備方法是將用化學(xué)法制得的油溶性Fe3O4溶解在有機(jī)試劑中得到溶液A，將雙親性齊聚物溶于3次蒸餾水中并調(diào)節(jié)pH為8?10得溶液B，常溫下將溶液B注入溶液A中得到混合液，對混合液進(jìn)行充分?jǐn)嚢枋褂袡C(jī)溶劑揮發(fā)，然后進(jìn)行離心分離，將離心分離的產(chǎn)物干燥后即可得水溶性的超順磁性復(fù)合粒子。用上述方法制備獲得的超順磁性復(fù)合粒子飽和磁強(qiáng)度高、磁響應(yīng)快、磁珠尺寸均勻、單分散性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、涌動時間快，可很好地滿足LFIAs的檢測要求；具體來說采用上述方法制備獲得的超順磁性Fe3O4納米粒子的粒徑為lOOnm、磁飽和強(qiáng)度為40 emu/g,對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g,非常適宜用于煙草花葉病毒的免疫檢測。
[0029]當(dāng)然，在免疫檢測中抗體的性能指標(biāo)對于檢測的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，通常而言，特異性強(qiáng)、親和力高的抗體，可以顯著地提高檢測的準(zhǔn)確性；為提高靈敏度，優(yōu)選親和常數(shù)為IO8 M-1的煙草花葉病毒抗體。
[0030]實(shí)施例1
檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的制備。
[0031]A、制備煙草花葉病毒標(biāo)記抗體:
1)將2.5mg超順磁性復(fù)合粒子用0.1M MES緩沖液(pH=4.7)洗滌并用0.4T的磁架分離富集后，用Iml MES緩沖液重懸，然后加入0.96mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)和1.15mg的N-羥基丁二酰亞胺(NHS)混勻，在37 °C溫度條件下反應(yīng)0.5h，得到活化后磁性粒子；
2)將步驟I中得到的活化后磁性粒子、0.15mg煙草花葉病毒抗體和0.8ml濃度為50mM, pH為8.5的硼砂緩沖液混勻，在37° C溫度條件下反應(yīng)3.5h，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液；
3)將步驟2中得到的反應(yīng)液中加入濃度為5%的BSA混勻，在37°C溫度條件下反應(yīng)
0.5h，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液；
4)將步驟3中得到的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子用0.02M PBS緩沖液(pH=7.4)進(jìn)行洗滌、懸浮，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體，4 °(:保存待用；
B、制備設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜:
將所述煙草花葉病毒包被抗體的濃度配制為2mg /ml ;采用0.02M PB(pH=7.4)的緩沖液將羊抗鼠IgG抗體(長沙博優(yōu)生物科技有限公司，ABGAM-0500)的濃度配制為I mg /ml,采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的BioJet噴頭將上述配置好的煙草花葉病毒包被抗體和羊抗鼠IgG抗體分別噴在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，將上述硝酸纖維素膜放置于相對濕度為10%以下的干燥車間抽濕4小時后放入干燥室中干燥備用；
C、制備含有煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的磁性樣品墊:將步驟A中制得的煙草花葉病毒標(biāo)記抗體用含0.2% TritonX100、l% BSA、5%蔗糖的
0.02M PBS (pH=7.4)的緩沖液稀釋50倍，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液；將玻璃纖維膜在溫度為 37°C 的含 0.2% TritonX100、l% BSA、5% 蔗糖的 0.02M PBS (pH=7.4)的緩沖液中浸泡I小時；采用BioDot的XYZ3050噴膜系統(tǒng)中的AirJet噴頭將上述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液噴涂在上述玻璃纖維膜上，得到磁性樣品墊，將上述磁性樣品墊放置于相對濕度為10%以下的干燥車間抽濕4小時后放入干燥室中干燥備用；
D、在10萬級潔凈和干燥的車間中將上述干燥好的磁性樣品墊、硝酸纖維素膜，以及吸水墊從上到下依次固定在背板上進(jìn)行搭配組裝后，采用BioDot的CM4000裁切系統(tǒng)將貼好的紙板裁切，得到檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0032]實(shí)施例2
測試上述制備好的用于檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的靈敏度。
[0033]量取煙草花葉病毒提純樣品，選用0.02M的PBS(pH=7.4)緩沖液進(jìn)行稀釋，配制濃度為 0ng/ml、0.lng/ml、0.5 ng/ml、lng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、50 ng/ml、100ng/ml、500 ng/mlUOOOng/ml的煙草花葉病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用實(shí)施例1得到的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙進(jìn)行檢測；并采用超順磁共振檢測儀MAR (Magna BioSciences ,8094-101-01& 8094-101-02)讀取檢測結(jié)果；將上述檢測結(jié)果與臨界值進(jìn)行比較即可得出檢測區(qū)所檢測樣本的陽性或是陰性結(jié)果。上述的臨界值為大量測定不同煙葉樣品提取液的正常樣本所確定出的各不同正常樣本的測定均值。
[0034]檢測步驟:先將待檢測樣品的溫度恢復(fù)至室溫(25°C)，用精確移液器取待檢測樣品50 μ I垂直緩慢滴入磁性試紙條的加樣端，然后滴入IOOul 0.02Μ (ρΗ=7.4)的PBS沖洗液，20分鐘后用超順磁共振檢測儀MAR讀取檢測結(jié)果，超順磁共振檢測儀MAR設(shè)置的臨界值(⑶T-(FF)S 28，即大于三倍O值檢測濃度對應(yīng)的測試值(⑶T-0FF>8.9 X 3)，其檢測結(jié)果如表1所示。
[0035]表1不同濃度的煙草花葉病毒樣品磁性試紙檢測值
【權(quán)利要求】
1.一種檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，該試紙包括含有煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的磁性樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和背板，所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有相互分離的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測區(qū)含有煙草花葉病毒包被抗體，所述質(zhì)控區(qū)含有能與所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體特異結(jié)合的抗抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體為煙草花葉病毒抗體和超順磁性復(fù)合粒子以肽鍵共價結(jié)合形成的聚合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述超順磁性復(fù)合粒子為粒徑為lOOnm、磁飽和強(qiáng)度為40 emu/g,對應(yīng)的外磁場響應(yīng)速度為20秒、表面羧基含量為80 μ mol/g的超順磁性Fe3O4納米粒子。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒抗體的親和常數(shù)為IO8 M—1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4任一權(quán)利要求所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒包被抗體為煙草花葉病毒單克隆抗體；所述抗抗體為羊抗鼠IgG抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6 所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述煙草花葉病毒包被抗體的濃度為2 mg /ml,所述羊抗鼠IgG抗體的濃度為I mg /ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，其特征在于，所述磁性樣品墊采用玻璃纖維膜制作。
9.一種制備如權(quán)利要求1、2、3、4、6、7、8中任一權(quán)利要求所述的檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的方法，其特征在于，包括以下步驟: A、制備煙草花葉病毒標(biāo)記抗體: .1)將2.5mg超順磁性復(fù)合粒子、0.96mg的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)U.15mg 的 N-羥基丁二酰亞胺(NHS)和 Iml 0.1M MES 緩沖液(pH=4.7)混勻，在 37° C溫度條件下反應(yīng)0.5h，得到活化后磁性粒子； .2)將步驟I中得到的活化后磁性粒子、0.15mg煙草花葉病毒抗體和0.8ml濃度為.50mM, pH為8.5的硼砂緩沖液混勻，在37° C溫度條件下反應(yīng)3.5h，得到含有偶聯(lián)后磁性粒子的反應(yīng)液； .3)將步驟2中得到的反應(yīng)液中加入濃度為5%的BSA混勻，在37° C溫度條件下反應(yīng).0.5h，得到含有封閉后磁性粒子的反應(yīng)液； .4)將步驟3中得到的反應(yīng)液中的封閉后磁性粒子用0.02M PBS緩沖液(pH=7.4)進(jìn)行洗滌、懸浮，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體，4 °(:保存待用； B、制備設(shè)置有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜: 將所述煙草花葉病毒包被抗體和抗抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的兩端不同區(qū)域，形成檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，得到含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜，然后放入干燥室中干燥； C、制備含有煙草花葉病毒標(biāo)記抗體的磁性樣品墊: 將步驟A中制得的煙草花葉病毒標(biāo)記抗體用緩沖液稀釋50倍，得到煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液；將玻璃纖維膜在溫度為37°C的緩沖液中浸泡I小時；用上述煙草花葉病毒標(biāo)記抗體溶液噴涂上述玻璃纖維膜，得到磁性樣品墊，然后放入干燥室中干燥； D、將所述磁性樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊從上到下依次固定在背板上，裁切得到檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙，然后將試紙與干燥劑一起放入鋁箔袋密封包裝，.4°C貯存。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備檢測煙草花葉病毒的磁性免疫層析試紙的方法，其特征在于，所述步驟C中使用的緩沖液由2ml TritonXlOOUOg BSA、50g蔗糖和950ml濃度為.0.02M、pH為7.4 的PBS緩沖液混合得到，調(diào)節(jié)pH至7.4，并定容到1000ml。
【文檔編號】G01N33/569GK103901200SQ201410119000
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】馬嵐, 莫笑晗, 吳峰, 夏振遠(yuǎn), 袁航, 譚仲夏, 秦西云, 晉艷 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 清華大學(xué)深圳研究生院