一種鑒別天然麝香和人工麝香的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別天然麝香與人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作為對照品，采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行定性鑒別。本發(fā)明方法用于鑒別天然麝香與人工麝香，樣品前處理簡單，檢測快速、準(zhǔn)確、環(huán)保。
【專利說明】一種鑒別天然麝香和人工麝香的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別天然麝香和人工麝香的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然磨香(Moschus)是一味名貴、稀有的中藥材，是鹿科動(dòng)物林磨Moschusberezovskii Flerov>5)^ Moschus sifanicus Przewalski 或原磨 Moschus moschiferusLinnaeus成熟雄體香囊中的干燥分泌物。麝為國家一級保護(hù)野生動(dòng)物，天然麝香的來源、產(chǎn)量均十分有限，目前臨床使用的多為人工麝香。
[0003]人工麝香是根據(jù)天然麝香的化學(xué)成分研發(fā)的國家一類新藥，其化學(xué)成分的種類和含量與天然麝香十分相似，主要含有麝香酮、芳活素、海可素等，其中麝香酮是主要活性成分。與人工麝香相比，天然麝香還含有許多種未知的微量成分，且這些微量成分中有些其本身即具有生物活性，有些與其它藥物配伍后產(chǎn)生新的藥理活性物質(zhì)，發(fā)揮整體調(diào)節(jié)作用，而人工麝香中不含有這些成分。這也是國家規(guī)定藥品中使用人工麝香不能寫成麝香的原因之一。例如，天然麝香中含有抗炎多肽，其抗炎效果較氫化可的松更為顯著，而人工麝香中沒有此類抗炎多肽的成分，其抗炎效果不及天然麝香等。
[0004]天然麝香與人工麝香的價(jià)格差距懸殊，且天然麝香中很多有效生物成分如麝香吡啶、抗炎蛋白等是人工麝香所不具有的。為了控制麝香藥材的質(zhì)量，《中國藥典》(2010年版)規(guī)定了外觀檢查和麝香酮含量測定。然而，外觀檢查項(xiàng)目受人為因素影響較大，麝香酮含量測定則因合成品的摻雜而影響其檢驗(yàn)意義。因此，需要一種能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別天然麝香與人工麝香的方法。
[0005]梁穎、汪小根(GC-MS法初步分析天然麝香與人工麝香，《中藥新藥與臨床藥理》，2005年，第16卷第3期，p204-205)報(bào)道了以麝香吡啶、3-甲基環(huán)十三酮作為專屬性成分，采用GC-MS法鑒別天然麝香和人工麝香，該方法可準(zhǔn)確鑒別天然麝香與人工麝香，但存在如下不足:提取試劑采用苯，毒性大；供試品前處理時(shí)間長，1.5h以上；分離時(shí)間長，專屬性成分的保留時(shí)間在20min以上。
[0006]周健等(應(yīng)用紅外光譜技術(shù)鑒別中藥麝香的真?zhèn)?，光譜學(xué)與光譜分析，2010年，第30卷第9期，p2368-2371)報(bào)道了采用傅里葉變換-紅外光譜(FTR-1R)法對天然麝香和人工麝香進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二者紅外譜圖十分相似，有共同的吸收峰且大多數(shù)強(qiáng)度一致，難以鑒別；雖然采用二階導(dǎo)數(shù)譜圖的對比與分析，發(fā)現(xiàn)天然麝香和人工麝香在某些峰上出現(xiàn)差異，但是差異較小，難以確切地將二者區(qū)分開。
[0007]超高效合相色譜(UPC2)是一種高分離度，高靈敏度，高分析速度、低成本的新型分離技術(shù)，它基于超臨界流體色譜( SFC)原理的分析系統(tǒng)，以液體和超臨界氣體的混合物作為流動(dòng)相，可直接進(jìn)樣分析不同溶劑類型的萃取物，分析溫度低，易于質(zhì)譜檢測器串聯(lián)使用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]發(fā)明人在研究天然麝香和人工麝香的化學(xué)成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，天然麝香中含有兩種微量的直鏈脂肪酸——二十六酸(分子式C26H52O2)和二十八酸(分子式C28H56O2)，而在人工麝香中未發(fā)現(xiàn)這兩種化學(xué)成分。當(dāng)使用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPC2-MS)進(jìn)行檢測時(shí)，二十六酸和二十八酸色譜峰具有良好的分離度，且樣品前處理簡單，檢測高效。因此，可將這兩種化學(xué)成分作為鑒別天然麝香和人工麝香的指標(biāo)性成分。
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種以二十六酸和二十八酸為指標(biāo)性成分，以超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別天然麝香與人工麝香的方法，該方法準(zhǔn)確、高效、操作簡單。
[0010]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0011]一種鑒別天然麝香與人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作為對照品，采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別，包括如下步驟:
[0012](I)分別稱取二十六酸、二十八酸對照品適量，精密稱定，加溶劑分別配制成濃度為I?10 μ g / mL的二十六酸對照品溶液和濃度為I?10 μ g / mL的二十八酸對照品溶液；或者
[0013]分別稱取二十六酸、二十八酸對照品適量，精密稱定，加溶劑配制成二十六酸和二十八酸的濃度均為1-10 μ g/mL的混合對照品溶液；
[0014](2)稱取麝香樣品適量，精密稱定,加入所述麝香樣品質(zhì)量200-500倍量的溶劑，超聲提取10-30分鐘，過濾，得供試品溶液；
[0015](3)分別精密吸取所述二十六酸對照品溶液和所述二十八酸對照品溶液各I?10 μ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到二十六酸對照品總離子流圖和二十八酸對照品總離子流圖；或者
[0016]精密吸取所述混合對照品溶液1-10 μ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到混合對照品總尚子流圖；
[0017](4)精密吸取所述供試品溶液l-ΙΟμ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到供試品總離子流圖，根據(jù)二十六酸和二十八酸的準(zhǔn)分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)，在所述供試品總離子流圖基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲得供試品提取離子流圖；
[0018]當(dāng)所述供試品提取離子流圖中在與所述二十六酸對照品總離子流圖中的二十六酸色譜峰和所述二十八酸對照品總離子流圖中的二十八酸色譜峰保留時(shí)間基本相同的位置上同時(shí)顯示色譜峰時(shí)，或者所述供試品提取離子流圖中在與所述混合對照品總離子流圖中的二十六酸色譜峰和二十八酸色譜峰保留時(shí)間基本相同的位置上同時(shí)顯示色譜峰時(shí)，所述麝香樣品為天然麝香；否則為人工麝香。
[0019]一般來說，二十六酸對照品和二十八酸對照品的純度較高，例如在95%以上，或者98%以上，可以直接采用所述二十六酸對照品總離子流圖和二十八酸對照品總離子流圖，或者采用所述混合對照品總離子流圖進(jìn)行質(zhì)譜峰的標(biāo)示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)采用的二十六酸對照品和二十八酸對照品的純度不夠高，其中存在影響二十六酸或二十八酸色譜信號的干擾成分時(shí)，也可以在所述二十六酸和二十八酸總離子流圖基礎(chǔ)上進(jìn)一步得到二者的提取離子流圖，用于質(zhì)譜峰的標(biāo)示。
[0020]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，麝香供試品溶液中二十六酸和二十八酸的質(zhì)譜峰信號容易受到麝香樣品中其他化學(xué)成分信號的干擾，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)，因此本發(fā)明方法中采用了供試品溶液的提取離子流圖，以除去其他化學(xué)成分的信號干擾，以更直觀地判斷供試品溶液中是否含有二十六酸和二十八酸。
[0021]本發(fā)明中，超高效合相色譜條件和質(zhì)譜條件可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法確定。
[0022]在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(3)和步驟(4)中，超高效合相色譜條件為:
[0023]高壓填充的C18硅膠鍵合相色譜柱；流動(dòng)相A為二氧化碳，流動(dòng)相B為體積比為50: 50: 0.1-0.5 的甲醇-乙腈-甲酸；流速為 1.0-2.0mL / min ;柱溫為 30°C -40°C ；補(bǔ)償液采用流速0.3-0.8mL / min的甲醇；背壓為1500psi ;設(shè)置如下梯度洗脫程序:0到Imin時(shí)，流動(dòng)相B體積比為1-3% ；1到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由1_3%升高到2_4% ；2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為2-4% ；3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由2-4%升高到3-9% ;
[0024]所述質(zhì)譜條件為:
[0025]電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.2-2.7kV ;錐孔電壓:30V ;電離源溫度為120°C ;脫溶劑氣溫度為500°C ;氣體流速為45-55L / h ;脫溶劑流速為800L / h。
[0026]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，所述梯度洗脫程序中“I到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由I?3%升高到2-4%”、“3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由2_4%升高到3_9%”的表述中，“升高”表示后者的數(shù)值高于前者。例如“I到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由1_3%升高到2-4%”中，盡管“1-3%”和“2-4%”的取值范圍有重疊，但在本發(fā)明中，在“2-4%”范圍內(nèi)的取值應(yīng)當(dāng)高于“ 1-3% ”范圍內(nèi)的取值。
[0027]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述超高效合相色譜條件中，O到Imin時(shí),流動(dòng)相B體積比為1-3% ；1到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由1-3%升高到3.2-4.0% ；2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為3.2-4.0% ；3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3.2-4.0%升高到4.1-9.0%o
[0028]在一種更優(yōu)選的實(shí)施方式中,所述超高效合相色譜條件中,O到Imin時(shí),流動(dòng)相B體積比為3% ；1到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3%升高到3.5% ；2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為3.5% ；3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3.5%升高到7%。
[0029]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述超高效合相色譜條件中，所述流動(dòng)相B為體積比為50: 50: 0.1的甲醇-乙腈-甲酸，所述流速為1.6mL / min，所述補(bǔ)償液的流速為
0.3mL / min的甲醇；所述質(zhì)譜條件中，毛細(xì)管電壓為2.5kV，所述氣體流速為50L / h。
[0030]所述色譜柱可選用例如Waters ACQUITY UPC2HSS C18SB色譜柱。
[0031]采用上述超高效合相色譜條件，可實(shí)現(xiàn)二十六酸和二十八酸的色譜峰與它們各自相鄰的色譜峰的完全基線分離，分離度良好，運(yùn)行時(shí)間短，可重現(xiàn)性好。
[0032]采用上述質(zhì)譜條件，二十六酸和二十八酸的質(zhì)譜信號檢測靈敏度高，獲得的質(zhì)譜峰強(qiáng)度較高，有利于這兩種成分的確認(rèn)。
[0033]所述“保留時(shí)間基本相同”，是指對照品色譜圖中二十六酸和/或二十八酸的保留時(shí)間與供試品色譜圖中的保留時(shí)間的誤差在±10%范圍內(nèi)，優(yōu)選在±5%范圍內(nèi)。這是由于受儀器、色譜柱、流動(dòng)相、試驗(yàn)條件等影響，同一化合物的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生漂移，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易理解的。
[0034]上述鑒別方法，步驟(I)和⑵的順序可以互換，步驟(3)和⑷的順序可以互換。
[0035]步驟⑴和⑵所述溶劑可選自乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或甲醇，優(yōu)選為乙酸乙酯或正己烷。
[0036]步驟⑴中配制所述對照品溶液與步驟(2)中配制所述供試品溶液使用的溶劑可以相同，也可以不同，優(yōu)選使用相同的溶劑。[0037]優(yōu)選地，步驟⑴中所述二十六酸對照品溶液中二十六酸的濃度為5-10 μ g / mL,所述二十八酸對照品溶液中二十八酸的濃度為5-10 μ g/m,所述混合對照品溶液中二十六酸和二十八酸的濃度均為5-10 μ g / mL。
[0038]與現(xiàn)有的鑒別天然麝香與人工麝香的技術(shù)相比，本發(fā)明的鑒別方法的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0039](1)首次采用二十六酸和二十八酸這兩種脂肪酸類成分作為指標(biāo)性成分，以超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別天然麝香和人工麝香，這兩種成分用少量常規(guī)有機(jī)溶劑超聲即可充分提取出來，分析前處理方法簡單。
[0040](2)采用本發(fā)明方法，麝香供試品溶液中二十六酸和二十八酸成分可實(shí)現(xiàn)完全基線分離，運(yùn)行時(shí)間短。例如在本發(fā)明優(yōu)選的超高效合相色譜條件和質(zhì)譜條件中，兩種指標(biāo)性成分的保留時(shí)間在6分鐘以內(nèi)，耗時(shí)短，且質(zhì)譜信號檢測靈敏度高，能夠高效、準(zhǔn)確地鑒別天然麝香和人工麝香。
[0041](3)本發(fā)明采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，超高效合相色譜的主要流動(dòng)相為CO2,流體黏度小，與高效液相色譜法使用的液體流動(dòng)相擴(kuò)散率更高、更有利于傳質(zhì)；與氣相色譜法相比，CO2單獨(dú)作為流動(dòng)相可在更低的溫度下實(shí)現(xiàn)分離，更好地檢測到本發(fā)明的指標(biāo)性成分二十六酸和二十八酸；此外，CO2成本低且無毒，有利于保護(hù)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員的健康。
[0042](4)經(jīng)過對多批天然麝香和人工麝香的驗(yàn)證，本發(fā)明方法對天然麝香和人工麝香的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確無誤。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1為混合對照品溶液總離子流圖。
[0044]圖2為天然麝香樣品總離子流圖。
[0045]圖3為人工麝香樣品總離子流圖。
[0046]圖4為天然麝香樣品提取離子流圖。
[0047]圖5為人工麝香樣品提取離子流圖。
【具體實(shí)施方式】
[0048]以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0049]實(shí)施例中使用Waters AcQuity超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀；二十六酸對照品和二十八酸對照品均購自上海易利生物科技有限公司，批號分別為M0388、M1342，純度均^ 98%;天然麝香，人工麝香購自北京同仁堂股份有限公司；乙腈、甲醇試劑為色譜純，其他試劑為分析純。
[0050]實(shí)施例1天然麝香與人工麝香的鑒別方法
[0051]1.混合對照品溶液的制備:
[0052]精密稱取二十六酸對照品和二十八酸對照品各0.5mg,置于50mL容量瓶中，加入正己烷溶劑溶解，定容，即得。
[0053]2.供試品溶液的制備:
[0054]精密稱取待測磨香樣品約0.05g,置于錐形瓶中，加入乙酸乙酯IOmL,超聲IOmin,過濾，即得。[0055]3.測試方法:
[0056]分別取混合對照品溶液和供試品溶液，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按照如下超高效合相色譜條件和質(zhì)譜條件，分別得到對照品溶液總離子流圖和供試品溶液總離子流圖，然后根據(jù)二十六酸和二十八酸的準(zhǔn)分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)，在所述供試品總離子流圖基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲得供試品提取離子流圖。
[0057]其中，超高效合相色譜(UPC2)的分離條件為:
[0058]色譜柱:ACQUITYUPC2HSS C18SB
[0059]流動(dòng)相A: 二氧化碳
[0060]流動(dòng)相B:甲醇-乙腈-甲酸(體積比50: 50: 0.1)
[0061]流速:1.6mL/ min
[0062]柱溫:40°C
[0063]進(jìn)樣量:2uL
[0064]補(bǔ)償液:0.3mL / min的甲醇
[0065]背壓:1500psi
[0066]梯度洗脫程序見表1:
[0067]表1
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別天然麝香與人工麝香的方法，所述方法以二十六酸和二十八酸作為對照品，采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行鑒別，包括如下步驟: (1)分別稱取二十六酸、二十八酸對照品適量，精密稱定，加溶劑分別配制成濃度為1-10 μ g/mL的二十六酸對照品溶液和濃度為l-ΙΟμ g/mL的二十八酸對照品溶液；或者 分別稱取二十六酸、二十八酸對照品適量，精密稱定，加溶劑配制成二十六酸和二十八酸的濃度均為1-1Oyg / mL的混合對照品溶液； (2)稱取麝香樣品適量，精密稱定，加入所述麝香樣品質(zhì)量200-500倍量的溶劑，超聲提取10-30分鐘，過濾，得供試品溶液； (3)分別精密吸取所述二十六酸對照品溶液和所述二十八酸對照品溶液各I~10μ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到二十六酸對照品總離子流圖和二十八酸對照品總離子流圖；或者 精密吸取所述混合對照品溶液1-10 μ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到混合對照品總尚子流圖； (4)精密吸取所述供試品溶液1-10μ L，注入超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，得到供試品總離子流圖，根據(jù)二十六酸和二十八酸的準(zhǔn)分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)，在所述供試品總離子流圖基礎(chǔ)上進(jìn)一步獲得供試品提取離子流圖； 當(dāng)所述供試品提取離子流圖中在與所述二十六酸對照品總離子流圖中的二十六酸色譜峰和所述二十八酸對照品總離子流圖中的二十八酸色譜峰保留時(shí)間基本相同的位置上同時(shí)顯示色譜峰時(shí)，或者所述供試品提取離子流圖中在與所述混合對照品總離子流圖中的二十六酸色譜峰和二十八酸色譜峰保留時(shí)間基本相同的位置上同時(shí)顯示色譜峰時(shí)，所述麝香樣品為天然麝香，否則為人工麝香。`
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)和步驟(4)中，超高效合相色譜條件為: 高壓填充的C18硅膠鍵合相色譜柱；流動(dòng)相A為二氧化碳，流動(dòng)相B為體積比為50: 50: 0.1-0.5的甲醇-乙腈-甲酸；流速為1.0-2.01^/1^11;柱溫為301:-401:;補(bǔ)償液采用流速0.3-0.8mL / min的甲醇；背壓為1500psi ;設(shè)置如下梯度洗脫程序:0到Imin時(shí)，流動(dòng)相B體積比為I~3%;1到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由I~3%升高到2_4%;2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為2-4% ；3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由2-4%升高到3-9% ；； 質(zhì)譜條件為: 電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓為2.0-2.7kV ;錐孔電壓:30V ;電離源溫度為1200C ;脫溶劑氣溫度為500°C ;氣體流速為45-55L / h ;脫溶劑流速為800L / h。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序?yàn)?0到Imin時(shí)，流動(dòng)相B體積比為1-3 %; I到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由1-3 %升高到3.2-4.0 % ;2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為3.2-4.0 % ;3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3.2-4.0 %升高到4.1-9.0 %。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序?yàn)?0到Imin時(shí)，流動(dòng)相B體積比為3% ；1到2min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3%升高到3.5% ；2到3min時(shí)，流動(dòng)相B體積比為3.5% ；3到6min時(shí)，流動(dòng)相B體積比由3.5%升高到7%。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述超高效合相色譜條件中，所述流動(dòng)相B為體積比為50: 50: 0.1的甲醇-乙腈-甲酸，所述流速為1.6mL / min，所述補(bǔ)償液的流速為0.3mL / min的甲醇；所述質(zhì)譜條件中，毛細(xì)管電壓為2.5kV，所述氣體流速為50L / h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)和⑵所述溶劑可選自乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷或甲醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1_4、6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述二十六酸對照品溶液中二十六酸的濃度為5-10 μ g/mL，所述二十八酸對照品溶液中二十八酸的濃度為5-10 μ g / m,所述混合對照品溶液中二十六酸和二十八酸的濃度均為5_10 μ g / mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述溶劑與步驟(2)所述溶劑是同一種溶 劑。
【文檔編號】G01N30/02GK103869020SQ201410120482
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】馬群, 解素花, 喬延江, 顧海鷗, 杜菁, 劉永剛 申請人:北京中醫(yī)藥大學(xué), 北京同仁堂股份有限公司