頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便的頭孢氨芐殘留量的熒光免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備，該試紙條包括在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，硝酸纖維素膜包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，結(jié)合墊上涂覆有熒光標(biāo)記的頭孢氨芐單克隆抗體。該頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法包括：頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原的合成，羊抗小鼠免疫球蛋白抗體的制備，而后包被于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線和質(zhì)控線；熒光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體的制備，后涂覆于玻璃纖維上作為結(jié)合墊；在背板上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜以及吸水墊；得到的試紙條切割成4mm寬度于常溫保存。
【專利說明】頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種獸藥殘留的熒光免疫速測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種用于頭孢氨芐殘留檢測(cè)的熒光免疫層析檢測(cè)試紙條及其制備。
【背景技術(shù)】
[0002]頭孢氨芐(Cephalexin)是β-內(nèi)酰胺類抗生素。獸醫(yī)臨床廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，均可造成它在畜產(chǎn)品中的殘留，給人類健康帶來嚴(yán)重危害。針對(duì)該藥物在食品中的殘留，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，牛奶中的最大殘留限量為100 μ g/kg，肌肉、脂肪中的最大殘留限量為200μ g/kg。
[0003]目前，用于檢測(cè)頭孢氨芐的方法主要有微生物法、色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法、免疫分析法等。微生物檢測(cè)法操作簡(jiǎn)單，但其檢測(cè)周期長且結(jié)果誤差較大。色譜法或色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)雖然靈敏度高，但是樣品前處理及測(cè)定操作繁瑣、費(fèi)用高，不適于大量樣品的快速檢測(cè)。
[0004]Coons等于1941年首次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為突光抗體技術(shù)(fluorescent antibody technique)。用突光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱突光抗體法；用己知的突光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)，其中又以熒光抗體方法較常用。基于免疫熒光技術(shù)，同時(shí)結(jié)合色譜層析原理的分析方法稱為熒光免疫層析法，以其具有靈敏、快速、特異、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查，用于檢測(cè)牛奶中頭孢氨芐藥物殘留量的熒光免疫層析檢測(cè)試紙條。
[0006]本發(fā)明所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條，在背板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊制成頭孢氨芐殘留熒光免疫定量層析試紙條。
[0007]優(yōu)選地，所述結(jié)合墊上涂覆的稀土熒光納米顆粒的直徑范圍為50_100nm。
[0008]所述稀土熒光納米顆粒，可以發(fā)射的波長范圍是600_630nm，熒光納米顆粒含有稀土絡(luò)合物，在基態(tài)下是穩(wěn)定的，在激發(fā)光源(340-365nm)的作用下能夠發(fā)射出波長范圍在600-630nm 的熒光。
[0009]優(yōu)選地,所述結(jié)合墊上涂覆的突光納米顆粒標(biāo)記抗體為稀土突光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體，硝酸纖維素膜上面包被有檢測(cè)線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法。[0011]本發(fā)明所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條的制備方法，包括以下步驟:
[0012]A.頭孢氨芐單克隆抗體的具體制備過程為:
[0013](I)動(dòng)物免疫:采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動(dòng)物，以頭孢氨芐與載體蛋白牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原；
[0014](2)細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0015](3)單克隆抗體的制備與純化:使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株IO6個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，進(jìn)行純化后得單克隆抗體分裝，_20°C保存。
[0016]B.熒光納米顆粒的醛基化:
[0017]取2mg熒光納米顆粒(20mg/mL，100 μ L)，以25mM的碳酸鹽緩沖液(pH = 9.5)洗滌3遍(12000r/min，4分鐘)后懸浮于100 μ L上述碳酸鹽緩沖液中。加入120 μ L醛基化的葡聚糖，混勻，短時(shí)超聲，避光反應(yīng)3-4小時(shí)(室溫)。以上述碳酸鹽緩沖液洗滌3遍(12000r/min，4分鐘)后，懸浮于100 μ L碳酸鹽緩沖液中。1500r/min離心I分鐘，去除雜質(zhì)，放置在4 °C備標(biāo)記抗體之用。
[0018]C.熒光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體的制備:
[0019]將0.5mg頭孢氨芐單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液4°C透析過夜，與上述醛基化的熒光納米顆?；旌?，4°C反應(yīng)過夜。然后，加入硼氰化鈉，終濃度為5mM，4°C反應(yīng)2-4小時(shí)。再加入等體積的封閉液(50mM tris-HClpH7.8，含2% BSA、4%蔗糖)，封閉12小時(shí)或過夜；最后用50mM tris-HCl ρΗ7.8洗滌標(biāo)記好的抗體3遍(12000r/min，4分鐘，4°C )，然后用100 μ L50mM tris-HCl ρΗ7.8 (含 0.9% NaCl、0.2% BSA、0.05% Tween-20)懸浮，4°C避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0020]D.涂覆有突光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊:
[0021]將玻璃纖維膜浸泡于0.2mol/L Tris-HCl (ρΗ7.8), 1.0% TritonX-100，3.0% BSA的處理液中，于4°C條件下浸泡2小時(shí)；然后于37°C下烘干2小時(shí)，備用。再將玻璃纖維膜切成IOmm的寬度，然后在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭噴到玻璃纖維膜，在37°C下烘干I小時(shí)，備用。
[0022]E.檢測(cè)線和質(zhì)控線包被到硝酸纖維素膜上:
[0023]所述檢測(cè)線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原；將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。取頭孢氨芐IOmg溶于5mL PBS (0.0lmol/L，pH7.4)中，加入I %戊二醛溶液攪拌30分鐘，取0VA30mg溶于ImL PBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存。羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗體球蛋白制成。分別用包被稀釋液將頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體調(diào)節(jié)到0.3-1.0mg/mL，膜液量為25 μ L/25-30cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4-7mm，然后于37°C下烘干2小時(shí)，封袋，以備試紙背板貼板之用。[0024]F.在背板上一次相互搭接的粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，得到試紙條，按照要求切割為4mm寬，與干燥劑一起密封備用。
[0025]本發(fā)明還提供一種利用所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條檢測(cè)頭孢氨芐殘留的方法，包括以下步驟:
[0026](I)樣品前處理:牛奶樣品離心(12000r/min，IOmin)脫脂后直接測(cè)定；
[0027](2)用試紙條檢測(cè):在試紙條的上樣點(diǎn)直接滴加上述離心脫脂牛奶樣品，層析15-20分鐘后，測(cè)615nm處的熒光強(qiáng)度值；
[0028](3)檢測(cè)結(jié)果分析:
[0029]用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度平均值(H)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值(Htl)再乘以100%，得到百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值；計(jì)算公式為:檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值) = (H/H0)X100% ;公式中H為標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值，Htl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值；以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對(duì)數(shù)值為X軸，檢測(cè)線百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值，相對(duì)應(yīng)出一個(gè)樣品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量。
[0030]本發(fā)明的檢測(cè)原理為:
[0031]當(dāng)供試品沿試紙條通過毛細(xì)作用從下向上虹吸時(shí)，根據(jù)層析原理，在層析移動(dòng)過程中，經(jīng)試紙條檢測(cè)端，向另一端移動(dòng)，先后依次經(jīng)過結(jié)合墊、硝酸纖維素膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線到達(dá)吸水墊。層析后，若在紫外燈照射下，質(zhì)控線未出現(xiàn)紅色熒光條帶，則試紙條視為無效；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色熒光條帶，則試紙條視為有效。層析后用現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)儀檢測(cè)時(shí)，質(zhì)控線熒光信號(hào)強(qiáng)度小于100，則試紙條視為無效；質(zhì)控線熒光信號(hào)強(qiáng)度大于100，則試紙條視為有效；以檢測(cè)線熒光條帶深淺(或者熒光信號(hào)強(qiáng)度)分析樣品中頭孢氨芐濃度，熒光條帶越深(信號(hào)強(qiáng)度越強(qiáng))，則樣品中頭孢氨芐濃度越低。
[0032]本發(fā)明中檢測(cè)動(dòng)物性食品中頭孢氨芐的熒光免疫層析檢測(cè)試紙條定性或定量檢測(cè)牛奶中頭孢氨芐的殘留量，樣品前處理過程簡(jiǎn)單，牛奶樣品離心脫脂后，可直接測(cè)定，并且能同時(shí)檢測(cè)大批樣品。測(cè)定方法簡(jiǎn)單、省時(shí)，整個(gè)檢測(cè)過程只需30分鐘可以完成。牛奶中頭孢氨芐殘留的最低檢測(cè)線為0.16 μ g/L，具有特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)，可在動(dòng)物性食品中頭孢氨芐的殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為實(shí)施例1中的頭孢氨芐的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1:頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條的制備
[0035]1.蛋白偶聯(lián)抗原的合成
[0036](I)頭孢氨芐免疫抗原的合成
[0037]將頭孢氨芐和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。
[0038]具體操作如下:取頭孢氨芐15mg溶于5mL PBS (0.01mol/L, pH7.4)中，加入25mg碳二亞胺(EDC)和IOmgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌30分鐘，取BSAlOmg溶于活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，再4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存。
[0039](2)頭孢氨芐包被抗原的合成
[0040]將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。
[0041]具體操作如下:取頭孢氨芐IOmg溶于5mL PBS (0.01mol/L, pH7.4)中，加入I %戊二醛溶液攪拌30分鐘，取0VA30mg溶于lmLPBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存。
[0042]2.單克隆抗體的制備
[0043](I)動(dòng)物免疫
[0044]將合成的免疫原與等量的弗氏完全佐劑乳化，腹腔注射8周齡雌性BALB/C小鼠，劑量為100 μ g/只。然后以100 μ g/只的劑量加弗氏不完全佐劑腹腔注射加強(qiáng)免疫3次，間隔2周。分別于每次免疫后10天小鼠眼眶后緣靜脈采血，測(cè)定抗體效價(jià)。
[0045](2)細(xì)胞融合和克隆化
[0046]取免疫小鼠的脾細(xì)胞，按5:1比例與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法篩選能夠穩(wěn)定分泌頭孢氨芐單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存。
[0047](3)單克隆抗體的制備與純化
[0048]使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑0.5mL/只，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞IO6個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，分裝，-20°c保存。
[0049]3.熒光納米顆粒的醛基化:
[0050]取2mg熒光納米顆粒(20mg/mL，100 μ L)，以25mM的碳酸鹽緩沖液(ρΗ=9.5)洗滌3遍(12000r/min，4分鐘)后懸浮于100 μ L上述碳酸鹽緩沖液中。加入120 μ L醛基化的葡聚糖，混勻，短時(shí)超聲，避光反應(yīng)3-4小時(shí)(室溫)。以上述碳酸鹽緩沖液洗滌3遍(12000r/min,4分鐘)后，懸浮于100 μ L碳酸鹽緩沖液中。1500r/min離心I分鐘,去除雜質(zhì),放置在4 °C備標(biāo)記抗體之用。
[0051]4.熒光納米顆粒標(biāo)記頭孢氨芐單克隆抗體的制備:
[0052]將0.5mg頭孢氨芐單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液4°C透析過夜，與上述醛基化的熒光納米顆粒混合，4°C反應(yīng)過夜。然后，加入硼氰化鈉，終濃度為5mM，4°C反應(yīng)2-4小時(shí)。再加入等體積的封閉液(50mM tris-HClpH7.8，含2% BSA、4%蔗糖)，封閉12小時(shí)或過夜；最后用50mM tris-HCl ρΗ7.8洗滌標(biāo)記好的抗體3遍(12000r/min，4分鐘，4°C )，然后用100 μ L50mM tris-HCl ρΗ7.8 (含 0.9% NaCl、0.2% BSA、0.05% Tween-20)懸浮，4°C避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0053]5.涂覆有突光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊:
[0054]將玻璃纖維膜浸泡于0.2mol/L Tris-HCl (ρΗ7.8), 1.0% TritonX-100，3.0% BSA的處理液中，于4°C條件下浸泡2小時(shí)；然后于37°C下烘干2小時(shí)，備用。再將玻璃纖維膜切成IOmm的寬度，然后在Bio-Dot XYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭噴到玻璃纖維膜，在37°C下烘干I小時(shí)，備用。[0055]6.檢測(cè)線和質(zhì)控線包被到硝酸纖維素膜上:
[0056]所述檢測(cè)線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)制得的包被抗原；將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。取頭孢氨芐IOmg溶于5mL PBS (0.0lmol/L，pH7.4)中，加入I %戊二醛溶液攪拌30分鐘，取0VA30mg溶于lmLPBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存。羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗體球蛋白制成。分別用包被稀釋液將頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體調(diào)節(jié)到0.3-1.0mg/mL，膜液量為25 μ L/25-30cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4-7mm，然后于37°C下烘干2小時(shí)，封袋，以備試紙背板貼板之用。
[0057]7.試紙條的制備
[0058]在背板上一次相互搭接的粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，得到試紙條，按照要求切割為4mm寬，與干燥劑一起密封備用。
[0059]所述玻璃纖維膜上涂覆的熒光納米顆粒的直徑范圍是70nm，上述方法制備中的所述熒光納米顆粒，可以發(fā)射的波長范圍是600-630nm。
[0060]實(shí)施例1制備試紙條的試驗(yàn)例:
[0061]試驗(yàn)例I
[0062]樣品中頭孢氨芐殘留的檢測(cè)
[0063](I)樣品前處理
[0064]牛奶樣本:取適量牛奶樣本，4°C，12000r/min，離心10分鐘，去除上層脂肪，取下層溶液用樣品150 μ L用于分析。
[0065](2)用試紙條檢測(cè)
[0066]在試紙條上樣點(diǎn)直接滴加上述離心脫脂牛奶樣品，層析15-20分鐘后，用自制的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)儀檢測(cè)讀數(shù)，或者用熒光掃描儀得到熒光強(qiáng)度值；
[0067](3)檢測(cè)結(jié)果分析:
[0068]用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度平均值(H)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值(Htl)再乘以100%，得到百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值；計(jì)算公式為:檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值) = (Η/Η0)Χ100% ;公式中H為標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值，Htl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值；以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對(duì)數(shù)值為X軸，檢測(cè)線百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值，相對(duì)應(yīng)出一個(gè)樣品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量。
[0069]試驗(yàn)例2
[0070]試紙條靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0071]分別測(cè)定20個(gè)不同批次的空白標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算平均百分檢測(cè)線高度值(Htl)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出HJ3S對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為理論檢測(cè)下限(L0D)，該濃度即為靈敏度。[0072]結(jié)果表明本發(fā)明開發(fā)的試紙條對(duì)牛奶樣品中頭孢氨芐殘留的最低檢測(cè)限為0.09 μ g/Lo
[0073]試驗(yàn)例3
[0074]試紙條特異性測(cè)定
[0075]選擇包括與頭孢氨芐結(jié)構(gòu)和功能類似青霉素及其他5類抗生素測(cè)定交叉反應(yīng)率。通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對(duì)其它藥物的交叉反應(yīng)率:
[0076]交叉反應(yīng)率(％ )=(引起50%抑制頭孢氨芐的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)X100%o
[0077]試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，測(cè)試的6種藥物與頭孢氨芐沒有交叉反應(yīng)。
[0078]表1頭孢氨芐檢測(cè)試劑盒的交叉反應(yīng)性
[0079]
【權(quán)利要求】
1.一種頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于:在背板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、涂覆有熒光標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，硝酸纖維素膜包被有檢測(cè)線為頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和質(zhì)控線為羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體。頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條中各部分含有以下成分: A.結(jié)合墊，上面涂覆有熒光標(biāo)記抗體，所述標(biāo)記抗體為稀土熒光納米顆粒與頭孢氨芐特異性抗體采用化學(xué)交聯(lián)法進(jìn)行連接得到的偶聯(lián)物，具體制備過程為: (1)頭孢氨芐-牛血清白蛋白免疫抗原的合成:將頭孢氨芐和牛血清白蛋白(BSA)采用碳二亞胺法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。取頭孢氨芐15mg溶于5mL PBS (0.01mol/L,pH7.4)中，加入25mg碳二亞胺(EDC)和IOmg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)攪拌30分鐘，取BSAlOmg溶于活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，再4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐免疫抗原，分裝凍存； (2)動(dòng)物免疫:采用雌性BALB/C純系小鼠作為免疫動(dòng)物，以頭孢氨芐-牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原； (3)細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選細(xì)胞株，得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； (4)單克隆抗體的制備與純化:使用雌性BALB/C純系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐劑，5天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞株IO6個(gè)/只，7天后取小鼠腹水，進(jìn)行純化后得單克隆抗體分裝，_20°C保存； (5)免疫探針制備:取熒光納米顆粒用碳酸鹽緩沖液pH9.5離心洗滌，懸浮，加入醛基化的葡聚糖反應(yīng)4h，加入上述頭孢氨芐單克隆抗體混合4°C過夜。加入硼氰化鈉溶液于4°C反應(yīng)4h，洗滌、4°C儲(chǔ)存，備用。 B.硝酸纖維素膜，上面包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線為頭孢氨芐與卵清蛋白(OVA)采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到的包被原，質(zhì)控線為羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)，具體制備過程為: (1)頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原的合成:將頭孢氨芐和卵清蛋白(OVA)，采用戊二醛法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原。取頭孢氨芐IOmg溶于5mLPBS(0.01mol/L,pH7.4)中，加入1%戊二醛溶液攪拌30分鐘，取0VA30mg溶于lmLPBS，加入到活化的頭孢氨芐溶液中，25°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)，4°C反應(yīng)過夜。4°C條件下，用PBS透析3天，得到頭孢氨芐包被抗原，分裝凍存； (2)羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體(羊抗鼠IgG)是用BALB/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫羊，提取免疫羊血清中的抗體球蛋白制成； (3)分別用包被稀釋液將頭孢氨芐-卵清蛋白包被抗原和羊抗BALB/C小鼠免疫球蛋白抗體調(diào)節(jié)到0.3-1.0mg/mL，膜液量為25 μ L/25-30cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔4-7_，然后于37°C下烘干2小時(shí)。 C.樣品墊，具體處理為:將玻璃纖維膜浸泡于0.2mol/LTris-HCl (pH7.8),1.0%TritonX-100, 3.0% BSA的處理液中，于4°C條件下浸泡2小時(shí)；然后于37°C下烘干2小時(shí)，備用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述試紙條在制備過程中所用的包被緩沖液為ΡΗ7.8,0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述熒光納米顆粒發(fā)射的波長范圍是600_630nm。
4.一種利用權(quán)利要求1所述的頭孢氨芐殘留熒光免疫層析檢測(cè)試紙條檢測(cè)頭孢氨芐殘留的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)樣品前處理:牛奶樣品離心(12000r/min，10分鐘)脫脂后直接測(cè)定； (2)用試紙條檢測(cè):在試紙條的上樣點(diǎn)直接滴加上述離心脫脂牛奶樣品，層析15-20分鐘后，測(cè)615nm處的熒光強(qiáng)度值； (3)檢測(cè)結(jié)果分析: 用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度平均值(H)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值(H0)再乘以100%，得到百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值；計(jì)算公式為:檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值) = (H/Ho)X100% ;公式中H為標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值，Htl為O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)線平均熒光強(qiáng)度值；以頭孢氨芐標(biāo)準(zhǔn)品濃度的半對(duì)數(shù)值為X軸，檢測(cè)線百分檢測(cè)線熒光強(qiáng)度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的檢測(cè)線百分熒光強(qiáng)度值，相對(duì)應(yīng)出一個(gè)樣品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品中頭孢氨芐的殘留量 。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103901201SQ201410123427
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】鄒明強(qiáng), 張帆, 陳艷, 胡佳麗 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院