離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備及其對(duì)膽固醇的檢測(cè)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備及其對(duì)膽固醇的檢測(cè)。首先，在離子液體兩相體系中用硼氫化鈉原位還原氯金酸得到離子液體包裹的金納米粒子，然后將膽固醇氧化酶（ChOx）直接固定在離子液體包裹金納米粒子復(fù)合物材料上，最后將合成的復(fù)合材料滴涂到玻碳電極表面呈修飾的玻碳電極。修飾的玻碳電極對(duì)膽固醇有好的電化學(xué)響應(yīng)，可用于直接檢測(cè)膽固醇，本發(fā)明制備的玻碳電極檢測(cè)膽固醇具有線性范圍寬，檢測(cè)限低的特點(diǎn)。
【專利說明】離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備及其對(duì)膽固醇的檢測(cè)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備及其對(duì)膽固醇的檢測(cè)。
[0002]【背景技術(shù)】
金納米粒子由于能夠高效的負(fù)載酶和保持酶的生物活性，從而在電化學(xué)傳感領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注。許多文獻(xiàn)報(bào)道，粒徑小的金納米粒子能夠加速酶催化氧化還原反應(yīng)中產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到電極表面，然而，當(dāng)金納米粒子表面沒有保護(hù)劑或者表面鈍化時(shí)，金納米粒子由于高的表面能而容易發(fā)生團(tuán)聚，導(dǎo)致金納米粒子的催化活性降低，本發(fā)明用離子液體穩(wěn)定金納米粒子，得到粒徑小且分散性好的金納米粒子。
[0003]離子液體可以作為優(yōu)異的溶劑用于固定和穩(wěn)定金屬納米粒子，而且可以提供一個(gè)良好的環(huán)境用于準(zhǔn)可逆的催化過程。酶在離子液體中的催化活性和穩(wěn)定性比一些有機(jī)溶劑高，而且高疏水性的離子液體有益于酶的活性和穩(wěn)定性。
[0004]血液中高含量的膽固醇會(huì)引起許多疾病，因此，快速、精確、可靠的檢測(cè)膽固醇有著重大的意義。現(xiàn)有的膽固醇傳感器大多是基于酶的生物傳感器，而且集中于研究有效的固定酶在固體電極表面，并且能夠?qū)崿F(xiàn)膽固醇氧化酶和電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。但是，支持介質(zhì)差的相容環(huán)境和酶的氧化還原活性位點(diǎn)深埋在蛋白質(zhì)里，限制了制備的酶?jìng)鞲衅鞯姆治鲂省Ｒ虼?，研制一種新的基質(zhì)用于有效的負(fù)載酶，而且能夠保持酶的生物活性的酶?jìng)鞲衅骶哂泻苤匾囊饬x。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

基于上述，本發(fā)明的目的在于提供一種離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備方法；
本發(fā)明另一目的在于用制備的離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極來檢測(cè)膽固醇的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
一種離子液體包裹金納米粒子修飾的玻碳電極制備方法，其步驟是:
a.將[BMM][PF6]和HAuC14水溶液等體積混合，加入0.01mol/L的檸檬酸三鈉，之后攪拌3 min。慢慢逐滴滴加5 mmol/L的硼氫化鈉到混合溶液中,攪拌15 min,靜置20 min得到分層的離子液體包裹的金納米粒子溶膠和水溶液，將水吸出，用蒸餾水洗滌溶膠三次，以除去剩余的檸檬酸三鈉；
將膽固醇氧化酶分散到離子液體包裹的金納米粒子溶膠中，水溫控制在25°C?40°C，以免酶失活，超聲30min，直到分散均勻，呈穩(wěn)定的黃黑色分散液，4°C冰箱儲(chǔ)存；
b.將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；將玻碳電極插入含有ImM鐵氰化鉀探針分子的0.1M氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、鉬為對(duì)電極、飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對(duì)裸玻碳電極進(jìn)行表征；再將電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用；
C.在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂步驟a得到的儲(chǔ)備液，從而制得膽固醇氧化酶離子液體包裹的金納米粒子修飾的玻碳電極(ChOx-1L-AuNPs/GCE)。
[0007]制備離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極對(duì)膽固醇的檢測(cè)方法，其步驟是:
a.以膽固醇氧化酶-離子液體包裹的金納米粒子修飾的玻碳電極(ChOx-1L-AuNPs/GCE)為工作電極、鉬柱為對(duì)電極、飽和的甘汞電極為參比電極，組成三電極體系，并將其共同浸入含有 0，0.1, 0.4, 0.6, 3.0, 5.0, 8.0, 10.0, 20.0, 30.0 和 50.0 μ M 的膽固醇的0.2Μ pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行差示脈沖掃描，得到不同濃度膽固醇的差示脈沖伏安曲線圖；
e.采用 origin 軟件作圖，繪制 ChOx-1L-AuNPs/GCE 在濃度為 0，0.1, 0.4，0.6，3.0，5.0，8.0，10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M膽固醇中的差示脈沖伏安曲線和膽固醇的
還原峰電流和其濃度與峰電流的比的線性關(guān)系圖。
[0008]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和產(chǎn)生的有益效果是:
1、本發(fā)明用離子液體和水溶液兩相體系制備了粒徑小，分散性好的離子液體包裹的金納米粒子，而且制備的離子液體包裹的金納米粒子對(duì)疏水性的分子(二茂鐵)有良好的電化學(xué)響應(yīng)。同時(shí)離子液體包裹的金納米粒子能夠有效的固定膽固醇氧化酶在固體電極表面，而且能夠保持酶的生物活性，實(shí)現(xiàn)膽固醇氧化酶和電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。這主要是由于結(jié)合了疏水性離子液體和金納米粒子各自的優(yōu)點(diǎn)，提高了離子液體包裹金納米粒子的導(dǎo)電性。
[0009]表I為本發(fā)明與現(xiàn)有的膽固醇傳感器對(duì)膽固醇檢測(cè)性能的比較:
Electrode Linear range (μ M) Detection limit (μ Μ) Electrochemicallymeasured species
全氟磺酸/膽固醇氧化酶/鉬納米-氧化鋅/玻碳電極0.5-15 — H202 膽固醇氧化酶/鉀摻雜的多壁碳納米管/玻碳電極 0.05 - 16 0.005 ChOx 二茂鐵氧化石墨烯/膽固醇氧化酶/玻碳電極0.5 -46.5 0.1 ChOx 膽固醇氧化酶-功能化石墨烯/石墨電極50 - 350 5.0 ChOx 全氟磺酸/膽固醇氧化酶/金納米粒子-多壁碳納米管/玻碳電極10 -500 4.3 ChOx 離子液體膽固醇氧化酶/普魯士藍(lán)/玻碳電極10 - 400.00 4.4 PB 膽固醇氧化酶離子液體包裹的金納米粒子/玻碳電極0.1 - 50 0.033 ChOx 從表I可以看出，本發(fā)明與現(xiàn)有的修飾電極檢測(cè)膽固醇相比，無論是在線性范圍還是 檢測(cè)限都有更好的檢測(cè)效果。
[0010]本發(fā)明將膽固醇氧化酶分散到離子液體包裹的金納米粒子溶膠中，將水溫控制在25°C?40°C，超過40°C酶會(huì)失去活性，小于25°C膽固醇氧化酶不能均勻的分散在離子液體中，并且離子液體的粘度降低，金納米粒子會(huì)發(fā)生團(tuán)聚，因此離子液體不能很好的包裹金納米粒子，影響膽固醇氧化酶的分散效果。
[0011 ] 與傳統(tǒng)的修飾電極相比，離子液體包裹金納米粒子修飾電極能夠有效的固定膽固醇氧化酶，而且酶的活性高，穩(wěn)定性好，可以實(shí)現(xiàn)直接的電子轉(zhuǎn)移。離子液體包裹金納米粒子構(gòu)筑的修飾玻碳電極對(duì)膽固醇的檢測(cè)具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)該修飾玻碳電極制備過程簡(jiǎn)單，能夠成為良好的候選材料用于構(gòu)建相應(yīng)的酶電極，從而為診斷膽固醇弓I起的疾病提供了 一個(gè)方便，且選擇性高的方法。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為疏水性離子液體相的紫外吸收光譜。圖中a.滴加硼氫化鈉之前疏水性離子液體[BMIM] [PF6]相b.滴加硼氫化鈉之后疏水性離子液體相的紫外吸收光譜。插入的圖:左圖未加NaBH4離子液體相的顏色，右圖加NaBH4離子液體相的顏色。
[0013]圖2 (A)疏水性離子液體包裹金納米粒子溶膠的低倍透射電鏡圖，(B)疏水性離子液體包裹金納米粒子溶膠的高倍透射電鏡圖。
[0014]圖3不同修飾(玻碳)電極在含有0.5 mM 二茂鐵的溶液中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。
[0015]圖 4 為 ChOx-1L-capped AuNPs/GCE 對(duì) 0，0.1, 0.4, 0.6, 3.0, 5.0, 8.0,10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M濃度的膽固醇檢測(cè)DPV圖。
[0016]圖5膽固醇濃度與電流的關(guān)系圖，插圖為膽固醇的還原峰電流與其濃度和峰電流的比值線性關(guān)系圖。
[0017]【具體實(shí)施方式】
為了更清楚的說明本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案再作進(jìn)一步的說明: 本發(fā)明實(shí)施過程中所使用的儀器和藥品:
CHI 660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)用于進(jìn)行循環(huán)伏安的實(shí)驗(yàn)，石英管加熱式自動(dòng)雙重純水蒸餾器(1810Β，上海亞太技術(shù)玻璃公司)用于蒸二次蒸餾水。紫外可見分光光度計(jì)(1102，上海天美科學(xué)儀器有限公司)和透射電子顯微鏡(JEOL JSM-6700F,日本光學(xué)公司)用于表征金納米粒子，電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)用于稱量藥品。超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。三氧化二鋁打磨粉(0.30 μ m，0.05 μ m，上海辰華儀器試劑公司)用于處理玻碳電極。飽和甘汞參比電極，鉬對(duì)電極，離子液體(蘭州化學(xué)物理研究所);膽固醇氧化酶(上海源葉生物技術(shù)有限公司);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、硝酸銀、硝酸鉀(西安化學(xué)試劑廠)；高純氮?dú)?純度為99.999% (02 < 0.001%))。實(shí)驗(yàn)過程中使用的水均為二次蒸餾水，實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純。
[0018]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案再作進(jìn)一步的說明:
一種離子液體包裹金納米粒子修飾的玻碳電極用于膽固醇檢測(cè)的制備方法，包括以下步驟:
a.將2 mL [BMIM] [PF6]和 2 mL HAuC14水溶液等體積混合，加入 200 μ L 0.01 mol/L的檸檬酸三鈉，之后攪拌3 min。慢慢逐滴滴加400 yL 5 mmol/L的硼氫化鈉到混合溶液中，攪拌15 min，靜置20 min得到分層的離子液體包裹的金納米粒子溶膠和水溶液，將水吸出，用蒸餾水洗滌溶膠三次，以除去剩余的檸檬酸三鈉；
將5 mg膽固醇氧化酶分散到200 UL離子液體包裹的金納米粒子溶膠中，水溫控制在30°C，以免酶失活，超聲30min，直到看到均勻，穩(wěn)定的黃黑色分散液，4°C冰箱儲(chǔ)存；
b.將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；插入含有I mM鐵氰化鉀探針分子的0.1 M氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、鉬為對(duì)電極、飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對(duì)裸玻碳電極進(jìn)行表征；再將電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用。
[0019]在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂4 μ L步驟a得到的儲(chǔ)備液，從而制得膽固醇氧化酶離子液體包裹的金納米粒子修飾的玻碳電極(ChOx-1L-AuNPs/GCE)。
[0020]下面，本發(fā)明對(duì)合成的離子液體包裹金納米粒子進(jìn)行表征及修飾電極對(duì)膽固醇進(jìn)行檢測(cè):
本發(fā)明采用紫外分光光度計(jì)和透射電子顯微鏡表征離子液體包裹的金納米粒子；在電化學(xué)工作站的技術(shù)選項(xiàng)中選擇循環(huán)伏安技術(shù)和差示脈沖伏安技術(shù)，飽和甘汞電極為參比電極，鉬柱為對(duì)電極，直徑3mm的修飾玻碳電極為工作電極。循環(huán)伏安技術(shù)的電位窗設(shè)置為-0.6V-0.2V。
[0021]圖1為疏水性離子液體相的紫外吸收光譜。圖中:a.滴加硼氫化鈉之前疏水性離子液體[BMIM][PF6]相b.滴加硼氫化鈉之后疏水性離子液體相的紫外吸收光譜。對(duì)比圖1中曲線(a，b)可以明顯看到在540nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的吸收峰，其為金納米粒子在離子液體中的特征吸收峰。同時(shí)，由插圖觀察到滴加硼氫化鈉之前離子液體相的顏色為黃色，加硼氫化鈉之后的溶膠顏色為藍(lán)黑色，說明離子液體中有金納米粒子生成。
[0022]圖2為疏水性離子液體包裹的金納米粒子溶膠的透射電鏡圖，其中圖(A)為疏水性離子液體包裹的金納米粒子溶膠的低倍透射電鏡圖，從圖中可以清晰的看到金納米粒子的直徑約為15nm，而且金納米顆粒為非常規(guī)則的小圓球。這是由于離子液體和金納米顆粒之間的相互作用使得金納米顆粒在離子液體中有高的分散性和穩(wěn)定性。圖(B)為疏水性離子液體包裹的金納米粒子溶膠的高倍透射電鏡圖，可以進(jìn)一步說明合成的金納米顆粒晶格間距為2.35nm,對(duì)應(yīng)于金的111面。
[0023]圖3不同修飾(玻碳)電極在含有0.5 mM 二茂鐵的溶液中的電化學(xué)循環(huán)伏安圖。裸的玻碳電極對(duì)二茂鐵的信號(hào)響應(yīng)為a曲線所示；在裸玻碳電極表面上滴涂4μ L的[ΒΜΙΜ][PF6]后，IL/GCE對(duì)二茂鐵的信號(hào)響應(yīng)為b曲線所示，其氧化還原峰電流為3.5 μ A，相比a曲線二茂鐵的氧化還原峰對(duì)稱性變好，峰電位差減小，而且氧化還原峰電流明顯增大，其原因?yàn)閷?dǎo)電性的離子液體滴涂到電極表面加速了電子轉(zhuǎn)移；但當(dāng)在裸玻碳電極表面滴涂4yL的IL- capped AuNPs后，峰電流信號(hào)相比b曲線增大到5.5 μ A (如c曲線所示),說明金納米粒子的存在可以明顯的提高修飾電極的導(dǎo)電性，還說明IL-capped AuNPs復(fù)合物對(duì)疏水性的分析物有更好的化學(xué)響應(yīng)。
[0024]圖 4 為 ChOx-1L-capped AuNPs/GCE 對(duì) 0，0.1, 0.4，0.6，3.0, 5.0, 8.0,10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M濃度的膽固醇檢測(cè)DPV圖。氧氣存在的條件下，膽固醇氧化酶在電極表面發(fā)生直接電化學(xué)反應(yīng)及其用于膽固醇檢測(cè)，化學(xué)反應(yīng)式如下:
化學(xué)反應(yīng)(I)為，膽固醇氧化酶的氧化還原反應(yīng)，其在修飾電極表面發(fā)生了直接電子轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)了一對(duì)氧化還原峰。隨著膽固醇的逐漸加入，ChOx(FAD)和溶液中的膽固醇發(fā)生反應(yīng)，如化學(xué)式(3)所示，導(dǎo)致ChOx (FAD)的濃度降低，還原峰電流逐漸減小，說明膽固醇氧化酶對(duì)膽固醇有電化學(xué)響應(yīng)。圖4說明膽固醇氧化酶的還原峰電流越小，則修飾玻碳電極對(duì)膽固醇檢測(cè)越靈敏。
[0025]圖5膽固醇濃度與電流的關(guān)系，插圖為膽固醇的還原峰電流與其濃度和峰電流的比值線性關(guān)系圖。由圖5可以看出，對(duì)膽固醇檢測(cè)的線性范圍為IX l(T7to 5X10-5 mol/L,檢出限為3.3 X 10_8mOl/L。相對(duì)于表I所列的現(xiàn)有電極，
本發(fā)明制備的離子液體包裹金納米粒子修飾的玻碳電極用于膽固醇檢測(cè)線性范圍寬，檢出限低。
【權(quán)利要求】
1.一種離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極的制備方法，其步驟是: a.將[BMM][PF6]和HAuCl4水溶液等體積混合，加入0.01mol/L的檸檬酸三鈉，之后攪拌3 min,慢慢逐滴滴加5 mmol/L的硼氫化鈉到混合溶液中,攪拌15 min,靜置20 min得到分層的離子液體包裹的金納米粒子溶膠和水溶液，將水吸出，用蒸餾水洗滌溶膠三次，以除去剩余的檸檬酸三鈉； 將膽固醇氧化酶分散到離子液體包裹的金納米粒子溶膠中，水溫控制在25°C?40°C，以免酶失活，超聲30min，直到分散均勻，呈穩(wěn)定的黃黑色分散液，4°C冰箱儲(chǔ)存； b.將玻碳電極依次用0.3 μ m、0.05 μ m的三氧化二鋁懸濁液拋光成鏡面，再依次經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為95 %的乙醇、二次蒸餾水超聲清洗后，得到處理后的玻碳電極；將玻碳電極插入含有ImM鐵氰化鉀探針分子的0.1M氯化鉀電解質(zhì)溶液中，并采用以玻碳電極為工作電極、鉬為對(duì)電極、飽和的甘汞電極為參比電極的三電極體系進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，對(duì)裸玻碳電極進(jìn)行表征；再將電極取出用二次蒸餾水沖洗并吹干，備用； c.在上述處理好的裸玻碳電極上滴涂步驟a得到的儲(chǔ)備液，從而制得膽固醇氧化酶離子液體包裹的金納米粒子修飾的玻碳電極。
2.用權(quán)利要求1制備離子液體包裹金納米粒子修飾玻碳電極對(duì)膽固醇的檢測(cè)方法，其步驟是: a.以膽固醇氧化酶-離子液體包裹的金納米粒子修飾的玻碳電極為工作電極、鉬柱為對(duì)電極、飽和的甘汞電極為參比電極組成三電極體系，并將其共同浸入含有0，0.1，0.4，`0.6, 3.0, 5.0, 8.0, 10.0, 20.0, 30.0 和 50.0 μ M 的膽固醇的 0.2M pH 為 7.0 的磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行差示脈沖掃描，得到不同濃度膽固醇的差示脈沖伏安曲線圖； b.采用 origin 軟件作圖，繪制 ChOx-1L-AuNPs/GCE 在濃度為 0，0.1, 0.4，0.6，`3.0，5.0，8.0，10.0, 20.0, 30.0和50.0 μ M膽固醇中的差示脈沖伏安曲線和膽固醇的還原峰電流和其濃度與峰電流的比的線性關(guān)系圖。
【文檔編號(hào)】G01N27/48GK103940874SQ201410123445
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】劉秀輝, 董明君, 劉盼盼, 李嘉偉, 盧小泉 申請(qǐng)人:西北師范大學(xué)