一種坦布蘇病毒雙抗體夾心elisa檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法；本發(fā)明包括單克隆抗體制備、酶標(biāo)抗體的選擇和ELISA檢測程序等步驟；本發(fā)明建立的坦布蘇病毒夾心ELISA檢測方法具有快速、穩(wěn)定、特異性高、靈敏度高，使用本發(fā)明只需使用棉拭子采集氣管或泄殖腔分泌物或其它含有坦布蘇病毒的樣品，即可快速檢測樣品中是否含有坦布蘇病毒；本發(fā)明適合應(yīng)用于鴨場對鴨群是否感染坦布蘇病毒的大批量檢測。本發(fā)明首次用血清學(xué)方法進行坦布蘇病毒的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明更適合于基層進行大規(guī)模的病原檢測，是一種簡便，快速，特異的雙抗體夾心ELISA方法。
【專利說明】—種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法
(-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法,屬于病原檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]坦布蘇病毒感染是我國于2010年新發(fā)生的一種傳染性疾病，2010年春夏之交，江浙地區(qū)突然出現(xiàn)鴨產(chǎn)蛋下降，之后迅速波及福建、廣東、廣西、安徽、江蘇、江西、河南、山東、河北和北京等地的鴨場，經(jīng)過病原分離和系統(tǒng)的實驗室診斷，該病的病原為黃病毒屬中的坦布蘇病毒(Tembusu virus, TMUV)。
[0003]黃病毒屬(Flavivirus)是一大群具有包膜的單正鏈RNA病毒，黃病毒科(Flaviviridae)包括3個病毒屬，即黃病毒屬(flavivirus)、痕病毒屬(pestivirus)和丙型肝炎病毒屬(hepacivirus)，共有60多種病毒。目前，研究表明，引起鴨感染發(fā)病的為黃病毒科、黃病毒屬中的的坦布蘇病毒。
[0004]本病夏秋季發(fā)生更嚴(yán)重，蛋鴨、肉鴨生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生；危害多個品種，包括蛋鴨中的紹興鴨、縉云麻鴨、山麻鴨、金定鴨、康貝爾鴨、臺灣白改鴨，肉種鴨中的櫻桃谷鴨和北京鴨，野鴨等；該病發(fā)病率高，死亡率較低，一般在5%以下，有繼發(fā)感染時也可高達(dá)30%。10?25日齡肉鴨和產(chǎn)蛋鴨更易感。鵝、雞也有發(fā)病的報道。該病一年四季均可發(fā)生，但夏秋季節(jié)多發(fā)，冬季也能發(fā)生。發(fā)病率80%以上，死亡率在2%?10%，TMUV屬蚊傳蟲媒病毒，可能會經(jīng)蚊子傳播；已從鴨場內(nèi)死亡麻雀體內(nèi)檢出TMUV，提示病毒可經(jīng)鳥類傳播；帶毒蚊子和麻雀可導(dǎo)致病原在不同鴨場間的傳播。病鴨組織樣品中，卵泡膜的檢出率最高，達(dá)93%，提示TMUV是否會經(jīng)卵垂直傳播，應(yīng)該進行研究和引起重視。從泄殖腔拭子也可分離到病毒，表明該病毒可經(jīng)糞便排毒，從而污染環(huán)境、飼料、飲水、器具、運輸工具等。帶毒鴨在不同地區(qū)的調(diào)運(或者污染的運輸工具)極易成為本病大范圍和快速傳播的渠道。飼養(yǎng)管理不良，氣候突變能促進該病的發(fā)生。
[0005]目前，針對鴨坦布蘇病毒已建立的檢測方法主要是分子生物學(xué)檢測方法，如套式RT-PCR、LAMP、地高辛、熒光定量PCR等，尚無血清學(xué)方法檢測坦布蘇病毒的相關(guān)報道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，以便于更簡便、快速地對大量樣品進行TMUV病毒的檢測，本發(fā)明提供了一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法。
[0007]本發(fā)明首次用血清學(xué)方法進行坦布蘇病毒的檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明更適合于基層進行大規(guī)模的病原檢測，是一種簡便，快速，特異的雙抗體夾心ELISA方法。
[0008]一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，包括以下步驟:
[0009]1、單克隆抗體制備
[0010]使用坦布蘇病毒作為抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，待抗體效價達(dá)到IO4以上三天后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞采用PEG法進行細(xì)胞融合，間接ELISA法檢測抗體并篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞制備的腹水單克隆抗體用辛酸-硫酸銨方法純化，用I XpH9.6碳酸鹽緩沖液將單抗溶液稀釋為2 μ g/mL。
[0011]2、酶標(biāo)抗體的選擇
[0012]利用高碘酸鈉法對步驟I)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液進行HRP標(biāo)記，并利用ELISA法對HRP標(biāo)記的單抗溶液進行活性鑒定。鑒定步驟:將步驟I)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液包被96孔ELISA板，以坦布蘇病毒為抗原，以酶標(biāo)(HRP)抗體為標(biāo)記抗體,進行ELISA試驗，測定各孔反應(yīng)液OD45tlnm值。以O(shè)D45tlnm值最高的為酶標(biāo)抗體。
[0013]3、ELISA 檢測程序
[0014]el包被將步驟I)中濃度為2 μ g/mL的單抗溶液按照100 μ L/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；
[0015]e2洗板包被的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入PBST稀釋液，震蕩洗滌5min，重復(fù)四
次，甩干。
[0016]e3封閉e2甩干的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入PBST封閉液封閉，37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干。
[0017]e4加樣將待檢樣品按照100 μ L/孔加入封閉后甩干的酶標(biāo)板，置于37°C孵育lh，震蕩洗漆5min,重復(fù)四次,甩干。
[0018]e5檢測抗體將步驟2)中酶標(biāo)抗體用PBST稀釋液按照體積比1:1000稀釋后，按照100 μ L/孔加入酶標(biāo)板，37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干。
[0019]e6TMB顯色加入TMB顯色液，每孔100 μ L，37°C避光顯色15min。
[0020]e7終止每孔加入50 μ L3M H2SO4終止液終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取各孔反應(yīng)液OD45tlnm的值。
[0021]f、陰陽性臨界值的確定
[0022]根據(jù)公式:陰陽性臨界值=陰性樣本OD450平均值+3SD (標(biāo)準(zhǔn)偏差)，得到陰陽性臨界值。當(dāng)OD45tlnm在0.2以上，可判斷為陽性，即待檢樣品中含有坦布蘇病毒。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024]本發(fā)明建立的坦布蘇病毒夾心ELISA檢測方法具有快速、穩(wěn)定、特異性高、靈敏度高，使用本發(fā)明只需使用棉拭子采集氣管或泄殖腔分泌物或其它含有坦布蘇病毒的樣品，即可快速檢測樣品中是否含有坦布蘇病毒；本發(fā)明適合應(yīng)用于鴨場對鴨群是否感染坦布蘇病毒的大批量檢測。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是制備的單克隆抗體純化后western bloting圖。
[0026]其中M泳道為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；第1、2和3泳道為單克隆抗體；N泳道為陰性對照。說明制備的單克隆抗體具有很好的特異性。
(五)【具體實施方式】
[0027]本發(fā)明中所用試劑及其組分如下:
[0028]包被緩沖液:1X 碳酸鹽緩沖液(lOOmL，pH=9.6) =Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸餾水溶解并定容至lOOmL，pH值9.5-9.7，4°C保存；[0029]PBS 溶液:NaC14.25g, NaH2PO4.2H200.178g, Na2HPO4.12H201.386g，用蒸餾水溶解并定容至 500mL, pH 值 7.1-7.3 ；
[0030]PBST 稀釋液:每 IL PBS 加入 Tween-200.5mL,充分混勻；
[0031]PBST封閉液:將5g drymilk溶解于IOOmL PBST稀釋液中，短期保存于4°C，長期保存于_20°C。
[0032]TMB 顯色液:
[0033]Buffer A:稱取66.5063g檸檬酸鉀，用800mL四蒸水溶解并用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，加入314 μ L H2O2，用水定容至1L。4°C保存;
[0034]Buffer B:稱取0.2956g四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，0.0633g四丁基硼氫化銨(TBABH)溶于30mL 二甲基乙酰胺(DMA)，4°C避光保存；
[0035]使用時，將Buffer A和Buffer B以體積比39:1的比例混合,現(xiàn)配現(xiàn)用；
[0036]3M H2S04終止液:將濃H2SO4以體積比1:5的比例加入蒸餾水中，混勻冷卻至室溫即為3M硫酸溶液。
[0037]本發(fā)明所有使用的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞可市購得到，坦布蘇病毒分離株可根據(jù)文獻《中國家禽》2011年17期《鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學(xué)特性研究》分離得到。
[0038]實施例1
[0039]將坦布蘇病毒感染鴨的腦組織加0.3mL生理鹽水研磨，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后，根據(jù)文獻《中國家禽》2011年17期《鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學(xué)特性研究》中的方法得到坦布蘇病毒分離株；取上清經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF雞胚，每枚0.2mL,37°C孵育，棄掉24h內(nèi)死胚，收集24?96小時內(nèi)死胚或者活胚尿囊液，12000r/min,高速離心30min,取上清,80000r/min,超速離心2h,棄去上清,加入PBS溶解沉淀,得到純化的坦布蘇病毒(TMUV)。TMUV作為免疫用抗原，將其分裝保存于_80°C備用。
[0040]2、單抗的制備與純化用I)中純化的坦布蘇病毒作為免疫抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，80 μ g/只。第一次免疫加弗氏完全佐劑，第二、三、四次免疫加弗氏不完全佐劑。免疫方式為前兩次腹部皮膚多點注射，第三、四次腹腔注射。第四次免疫后14天，尾靜脈采血檢測效價并建立檢測抗體的TMUV-ELISA和E-ELISA方法。選擇抗體效價在IO4以上的小鼠，細(xì)胞融合前第3天使用單純坦布蘇病毒為抗原對小鼠進行加強免疫，劑量為100 μ g/只；三天后將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞采用PEG法進行細(xì)胞融合；待融合細(xì)胞長滿96孔板底部1/3面積以上時，用TMUV-ELISA和E-ELISA篩選融合細(xì)胞，選擇TMUV-ELISA和E-ELISA均為陽性的融合細(xì)胞用有限稀釋法進行克隆化，直至陽性率為100%,即得到雜交瘤細(xì)胞。對能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞進行腹水制備單抗，用E-ELISA測定效價。單抗用辛酸-硫酸銨方法純化，用I XPH9.6碳酸鹽緩沖液將純化后的單抗稀釋為 2 μ g/mL。
[0041]3、酶標(biāo)抗體的選擇將步驟2)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液利用高碘酸鈉法進行HRP標(biāo)記，并利用ELISA對標(biāo)記好的單抗進行活性鑒定。將步驟2)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液包被酶標(biāo)板，以坦布蘇病毒(TMUV)為抗原，以酶標(biāo)(HRP)抗體為標(biāo)記抗體，進行ELISA試驗。測定各孔OD45tlnm值，以O(shè)D45tlnm值最高的為酶標(biāo)抗體。
[0042]4、最佳反應(yīng)條件酶標(biāo)抗體工作濃度是1: 1000，封閉液為含5%脫脂奶粉的PBST，抗原、標(biāo)記抗體最佳工作時間為lh, TMB顯色時間為15min。[0043]5、交叉反應(yīng)性用本發(fā)明建立的方法對DPV、AIV、NDV、IBDV、EDS_76、TMUV陽性血清及陰性血清進行檢測，該方法只與TMUV陽性血清反應(yīng)呈陽性，說明該方法具有很好的特異性。
[0044]6、檢測程序
[0045]6.1包被將步驟I)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液按照100 μ L/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜；
[0046]6.2洗板步驟6.1中包被的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入PBST稀釋液，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干；
[0047]6.3封閉步驟6.2中甩干的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入含1% (體積比)牛血清蛋白(BSA)的PBST封閉液封閉，37°C孵育Ih，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干；
[0048]6.4加樣待檢樣品按照100 μ L/孔加入6.3孵育后的酶標(biāo)板，置于37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干；
[0049]6.5檢測抗體將步驟3)中酶標(biāo)抗體用含1%BSA的PBST稀釋液按照體積比1:1000稀釋，按照IOOyL/孔加入酶標(biāo)板，37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干；
[0050]6.6TMB顯色加入新鮮配制的TMB顯色液,每孔100 μ L, 37°C避光顯色15min ；
[0051]6.7終止、讀數(shù)每孔加入50 μ L3M H2SO4終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取各孔反應(yīng)液0D450nm的值。
[0052]7、陰陽性判定根據(jù)
【發(fā)明內(nèi)容】
中f步驟計算得到的陰陽性臨界值進行判定。
[0053]反應(yīng)液OD45tlnm在0.2以上，判斷為陽性，即待檢樣品中含有坦布蘇病毒；
[0054]反應(yīng)液OD45tlnm在0.18?0.2之間，判斷為疑似，按照步驟6重新檢測；
[0055]反應(yīng)液OD45tlnm低于0.18，判斷為陰性，即待檢樣品中不含有坦布蘇病毒。
[0056]本發(fā)明僅用于坦布蘇病毒的檢測。
【權(quán)利要求】
1.一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 1)單克隆抗體制備 使用坦布蘇病毒作為抗原免疫6周齡雌性BALB/c小鼠，待抗體效價達(dá)到IO4以上三天后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞采用PEG法進行細(xì)胞融合，間接ELISA法檢測抗體并篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞制備的腹水單克隆抗體用辛酸-硫酸銨方法純化，用IXpH9.6碳酸鹽緩沖液將單抗溶液稀釋為2 μ g/mL ； 2)酶標(biāo)抗體的選擇 利用高碘酸鈉法對步驟I)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液進行HRP標(biāo)記，并利用ELISA法對HRP標(biāo)記的單抗溶液進行活性鑒定；鑒定步驟:將步驟I)中稀釋為2 μ g/mL的單抗溶液包被96孔ELISA板，以坦布蘇病毒為抗原，以酶標(biāo)HRP抗體為標(biāo)記抗體，進行ELISA試驗，測定各孔反應(yīng)液 OD450nm 值;以 OD450mm 值最聞的為酶標(biāo)抗體； 3)ELISA檢測程序 el包被將步驟I)中濃度為2 μ g/mL的單抗溶液按照100 μ L/孔包被96孔酶標(biāo)板，4°C過夜； e2洗板包被的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入PBST稀釋液，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干; e3封閉e2甩干的酶標(biāo)板按照200 μ L/孔加入PBST封閉液封閉，37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干； e4加樣將待檢樣品按照100 μ L/孔加入封閉后甩干的酶標(biāo)板，置于37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干； e5檢測抗體將步驟2)中酶標(biāo)抗體用PBST稀釋液按照體積比1:1000稀釋后，按照.100 μ L/孔加入酶標(biāo)板，37°C孵育lh，震蕩洗滌5min，重復(fù)四次，甩干；e6TMB顯色加入TMB顯色液，每孔100 μ L，37°C避光顯色15min ；e7終止每孔加入50 μ L3M H2SO4終止液終止顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取各孔反應(yīng)液OD450nm 的值； f、陰陽性臨界值的確定 根據(jù)公式:陰陽性臨界值=陰性樣本OD450平均值+標(biāo)準(zhǔn)偏差3SD，得到陰陽性臨界值；當(dāng)OD45tlnm在0.2以上，判斷為陽性，即待檢樣品中含有坦布蘇病毒。
【文檔編號】G01N33/569GK103869066SQ201410123528
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】刁有祥, 陳浩, 唐熠, 高緒慧, 提金鳳 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)