一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法，包括步驟為：將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)離子對(duì)反相色譜進(jìn)行分離，再進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)，隨之進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析得到完全酶解產(chǎn)物的組成。通過(guò)上述方式，本發(fā)明采用離子對(duì)反向色譜與柱后熒光衍生聯(lián)用的方法，既為無(wú)紫外吸收的低分子量肝素提供可檢測(cè)的熒光基團(tuán)，又可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的熒光檢測(cè)，對(duì)低分子量肝素仿制藥的研發(fā)、生產(chǎn)控制和保障藥品安全具有極大的實(shí)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種低分子量肝素完全酶解產(chǎn)物的離子對(duì)反相色譜與柱后衍生結(jié)合的檢測(cè)方法，屬于藥物、原料藥、原料檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素是一種高度硫酸化的線性糖胺聚糖，廣泛存在于動(dòng)物器官和組織中，通過(guò)與眾多蛋白結(jié)合而在生物活性和生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。肝素具有抗凝、抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等生物學(xué)功能，并作為一種天然的抗凝血和抗血栓藥物，廣泛應(yīng)用于臨床疾病治療，但在長(zhǎng)期使用過(guò)程中，會(huì)引發(fā)諸如骨質(zhì)疏松、血小板減少等副作用。低分子量肝素是肝素分級(jí)或由化學(xué)法、酶法降解而得到的分子量較小的片段，具有與普通肝素相同的二糖組成單元以及與抗凝血活性相關(guān)的五糖序列。低分子量肝素作為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究開(kāi)發(fā)的新型抗血栓藥物，與肝素相比，具有體內(nèi)生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、副反應(yīng)少、抗血栓作用強(qiáng)、使用方便和安全等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又可減輕或避免肝素的不良作用。
[0003]高效液相色譜是肝素分析的重要手段，具有分離效率高、分析時(shí)間短、樣品需要量少、檢測(cè)限低等特點(diǎn)。目前上市的三種主要低分子量肝素為依諾肝素鈉、那屈肝素鈣和達(dá)肝素鈉，其中的依諾肝素鈉因其特殊的非還原端結(jié)構(gòu)在232nm下有特征性紫外吸收，而另外兩種低分子量肝素既無(wú)強(qiáng)紫外吸收，又無(wú)熒光基團(tuán)，故在其色譜檢測(cè)前通常需要先進(jìn)行衍生化，使之具有紫外吸收、熒光特性或其它一些可測(cè)定的物理化學(xué)性質(zhì)。
[0004]熒光衍生與液相色譜結(jié)合具有高靈敏度、低檢測(cè)限、簡(jiǎn)便可靠等特點(diǎn)，在糖類(lèi)物質(zhì)的研究中應(yīng)用廣泛。在肝素寡糖的分離過(guò)程中，由于硫酸基團(tuán)的存在和寡糖本身不帶有發(fā)色基團(tuán)，使寡糖的分離和檢測(cè)較為困難，需要對(duì)其進(jìn)行衍生使其帶上紫外或熒光基團(tuán)，不僅可以提高檢測(cè)的靈敏度，而且使寡糖帶上的疏水基團(tuán)能降低寡糖的極性，有利于其在反相色譜柱上分離。高效液相色譜中熒光檢測(cè)器的靈敏度要比紫外檢測(cè)器高出幾個(gè)數(shù)量級(jí)，更適合痕量分析。
[0005]柱前熒光衍生是在樣品分離之前進(jìn)行熒光衍生，再根據(jù)衍生物性質(zhì)進(jìn)行色譜分離和檢測(cè)。此種方法的缺點(diǎn)是操作過(guò)程比較繁瑣，容易影響分析的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，衍生反應(yīng)的副產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)色譜分離造成較大干擾，影響分析結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、分析結(jié)果準(zhǔn)確。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是:提供一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法，步驟為:將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物；將所述完全酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離子對(duì)反相色譜進(jìn)行分離，再進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)，最后進(jìn)行熒光檢測(cè),分析完全酶解產(chǎn)物組成。
[0008]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述降解過(guò)程為用肝素酶1、11和III在20?30°C下降解46?50 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過(guò)濾后真空減壓干燥得到完全酶解產(chǎn)物。
[0009]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述離子對(duì)反相色譜法的過(guò)程為在流速為I?5mL/min下用第一流動(dòng)相和第二流動(dòng)相洗脫,在流速為0.1?0.8mL/min下用第三流動(dòng)相和第四流動(dòng)相進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)。
[0010]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述第一流動(dòng)相的配制過(guò)程為將烷基銨類(lèi)試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類(lèi)試劑濃度為2?10禮、氯化鈉濃度為0.1?0.5M的第一流動(dòng)相，所述第一流動(dòng)相的pH值為5.0?6.5。
[0011]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述第二流動(dòng)相的配制過(guò)程為將烷基銨類(lèi)試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類(lèi)試劑濃度為2?10禮、氯化鈉濃度為0.4?1.5M的第一流動(dòng)相，所述第二流動(dòng)相的pH值為5.0?6.5。
[0012]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述第三流動(dòng)相的配制過(guò)程為將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，得到2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為1%?5%的第三流動(dòng)相。
[0013]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述第四流動(dòng)相的配制過(guò)程為將氫氧化鈉溶解于去離子水中，得到氫氧化鈉濃度為0.2?1.0M的第四流動(dòng)相。
[0014]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述熒光檢測(cè)的條件為激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 410nm。
[0015]在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述分析過(guò)程是以8種肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物和樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進(jìn)行歸屬，以低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品為參照，比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間的異同點(diǎn)，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成，其中 8 種二糖標(biāo)準(zhǔn)品分別為 ΛUA-GIcNAc、ΔUA-GlcNS, ΛUA_GlcNAc6S、ΛUA2S_GlcNAc、ΔUA-GlcNS6S, AUA2S_GlcNS、 ΛUA2S_GlcNAc6S、 ΛUA2S_GlcNS6S。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法，采用離子對(duì)反向色譜與柱后熒光衍生聯(lián)用的方法，既為無(wú)紫外吸收的低分子量肝素提供可檢測(cè)的熒光基團(tuán)，又可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的熒光檢測(cè)，譜圖中樣品響應(yīng)值更高，具有樣品前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、分析自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)低分子量肝素仿制藥的研發(fā)、生產(chǎn)控制和保障藥品安全具有極大的實(shí)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明中的8個(gè)肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物的熒光檢測(cè)圖；
圖2是本發(fā)明中的依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)圖；
圖3是本發(fā)明中的依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)圖；
圖4是本發(fā)明中的8個(gè)肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物、依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物和依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)對(duì)比圖；
圖5是本發(fā)明中的達(dá)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)圖；
圖6是本發(fā)明中的達(dá)肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)圖； 圖7是本發(fā)明中的8個(gè)肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品混合物、達(dá)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物和達(dá)肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物的熒光檢測(cè)對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0019]提供一種低分子量肝素完全酶解產(chǎn)物的檢測(cè)方法，包括步驟為:
(I)將低分子量肝素鈉用肝素酶1、II和III在25°C下降解48 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過(guò)濾后真空減壓干燥，然后用去離子水配制成lmg/mL的待測(cè)溶液。
[0020](2)第一流動(dòng)相的配制:將四丁基硫酸氫銨、氯化鈉溶解于體積百分比為8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氫銨濃度為5mM、氯化鈉濃度為0.1M的第一流動(dòng)相，并將pH調(diào)至
5.5o
[0021]第二流動(dòng)相的配制:將四丁基硫酸氫銨、氯化鈉溶解于體積百分比為8%的乙腈溶液中，制得四丁基硫酸氫銨濃度為5mM、氯化鈉濃度為0.5M的第二流動(dòng)相，并將pH調(diào)至
5.5o
[0022]第三流動(dòng)相的配制:將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，制得2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為2%的第三流動(dòng)相。
[0023]第四流動(dòng)相的配制:將氫氧化鈉溶解于去離子水中，制得氫氧化鈉濃度為0.65M的第四流動(dòng)相。
[0024]反相色譜條件:采用填料粒徑為5 μ m、色譜柱內(nèi)徑為4.6mm、色譜柱長(zhǎng)度為250mm的Supelco Discovery C18反相色譜柱；在流速為lmL/min,洗脫梯度為0_30min, 100-20%第一流動(dòng)相，0_80%第二流動(dòng)相；30_60 min, 20-0%第一流動(dòng)相，80-100%第二流動(dòng)相；在流速為0.lmL/min，用第三流動(dòng)相和第四流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)；所述熒光檢測(cè)的條件為激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,發(fā)射波長(zhǎng)為410nm。
[0025]系統(tǒng)適用性:二糖標(biāo)準(zhǔn)品各色譜峰的拖尾因子不大于1.5 ;標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣5次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0% ;二糖標(biāo)準(zhǔn)品的理論塔板數(shù)應(yīng)不小于3000。
[0026]進(jìn)樣:8種肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣5次，其中8種二糖標(biāo)準(zhǔn)品分別為AUA-GlcNAc、Δ UA-GlcNS, Λ UA-GlcNAc6S、Λ UA2S_GlcNAc、AUA_GlcNS6S、AUA2S_GlcNS、AUA2S-GlcNAc6S、Δ UA2S-GlcNS6S ;依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物連續(xù)進(jìn)樣3次，依諾肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物進(jìn)樣3次；達(dá)肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物連續(xù)進(jìn)樣3次，達(dá)肝素鈉樣品完全酶解產(chǎn)物分別進(jìn)樣3次。
[0027](3 )采用柱后熒光衍生方法，所述柱后衍生反應(yīng)是在色譜系統(tǒng)內(nèi)部進(jìn)行的，反應(yīng)原理為2-氰基乙酰胺與寡糖的醛基在弱堿環(huán)境下共熱，產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，流經(jīng)帶有熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀，檢測(cè)器在激發(fā)波長(zhǎng)為346nm、發(fā)射波長(zhǎng)為410nm的條件下進(jìn)行檢測(cè)。
[0028]請(qǐng)參閱圖1?7，以8種肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物以及樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進(jìn)行歸屬，以低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物為參照，比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間的異同點(diǎn)，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成。
[0029]以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的【技術(shù)領(lǐng)域】，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種基于柱后衍生的低分子量肝素完全降解產(chǎn)物檢測(cè)方法，其特征在于，步驟為:將低分子量肝素降解得到完全酶解產(chǎn)物；將所述完全酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)離子對(duì)反相色譜進(jìn)行分離，再進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)，最后進(jìn)行熒光檢測(cè)，分析完全酶解產(chǎn)物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述降解過(guò)程為用肝素酶1、II和III在20?30°C下降解46?50 h，降解產(chǎn)物經(jīng)超濾膜過(guò)濾后真空減壓干燥得到完全酶解產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述離子對(duì)反相色譜法的過(guò)程為在流速為I?5mL/min下用第一流動(dòng)相和第二流動(dòng)相洗脫,在流速為0.1?0.8mL/min下用第三流動(dòng)相和第四流動(dòng)相進(jìn)行柱后熒光衍生反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一流動(dòng)相的配制過(guò)程為將烷基銨類(lèi)試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類(lèi)試劑濃度為2?10mM、氯化鈉濃度為0.1?0.5M的第一流動(dòng)相，所述第一流動(dòng)相的pH值為5.0?6.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二流動(dòng)相的配制過(guò)程為將烷基銨類(lèi)試劑和氯化鈉溶于乙腈或甲醇中得到烷基銨類(lèi)試劑濃度為2?10mM、氯化鈉濃度為0.4?1.5M的第一流動(dòng)相，所述第二流動(dòng)相的pH值為5.0?6.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第三流動(dòng)相的配制過(guò)程為將2-氰基乙酰胺溶解于去離子水中，得到2-氰基乙酰胺質(zhì)量百分比為1%?5%的第三流動(dòng)相。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第四流動(dòng)相的配制過(guò)程為將氫氧化鈉溶解于去離子水中，得到氫氧化鈉濃度為0.2?1.0M的第四流動(dòng)相。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光檢測(cè)的條件為激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,發(fā)射波長(zhǎng)為410nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述分析過(guò)程是以8種肝素二糖標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，對(duì)低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品完全酶解產(chǎn)物和樣品完全酶解產(chǎn)物的色譜峰進(jìn)行歸屬，以低分子量肝素標(biāo)準(zhǔn)品為參照，比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品之間的異同點(diǎn)，分析樣品完全酶解產(chǎn)物組成，其中8種二糖標(biāo)準(zhǔn)品分別為Λ UA-GIcNAc、Δ UA-GlcNS、Δ UA-G1 cNAc6S、AUA2S-GlcNAc、 ΔUA-GlcNS6S, AUA2S_GlcNS、 ΛUA2S_GlcNAc6S、 ΛUA2S_GlcNS6S。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103852542SQ201410123609
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】白樺 申請(qǐng)人:蘇州英諾凱生物醫(yī)藥科技有限公司