以電化學發(fā)光生物傳感器檢測dna甲基轉移酶的方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及的一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法，將S1含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA序列自組裝在金電極的表面，組成電化學發(fā)光生物傳感器；將修飾電極用甲基轉移酶甲基化，再用甲基化限制性內切酶酶切，淋洗后，用S2帶氨基的互補DNA進行雜交，再將氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物通過EDC-NHS的耦合連接到電極上進行電化學發(fā)光檢測，以此來實現對甲基轉移酶的測定。本發(fā)明采用氧化石墨烯提供相對大的比表面積用于負載鄰菲啰啉釕，且氧化石墨烯與鄰菲啰啉釕是非共價結合，能有效地負載和易于操作并且能保持氧化石墨的電子結構，以此為發(fā)光材料使本發(fā)明的傳感器對甲基轉移酶有很高的靈敏度。
【專利說明】以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學發(fā)光生物傳感器，具體涉及一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法及應用。
【背景技術】
[0002]DNA甲基化在許多生物過程中有重要的作用，包括轉錄，基因組印記，細胞分化，染色質結構和胚胎形成。研究發(fā)現許多人類的疾病與異常基因甲基化有關。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNA MTase)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化可以發(fā)生在GATC和CCA/TGG上，即腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位。這種異常的DNA甲基轉移酶的活性與癌癥的發(fā)病機制有關，這種關系提供了一個在疾病的診斷和治療的潛在目標。此外，DNA MTase是用于治療癌癥的藥理學家族的新成員。因此，一種靈敏、快速的檢測DNA甲基化及DNA MTase活性的方法無疑對癌癥的早期診斷提供了強有力的手段，為研究基因調控的基本機制提供了見解，同時為研發(fā)新的抗癌藥物提供了依據。用于DNA甲基化轉移酶活性的測定的傳統(tǒng)的方法依賴放射性同位素標記的基底，基于PCR的不同技術，毛細管電泳和高效液相色譜。這些方法時間密集，耗費DNA，需要費力的處理和特殊的同位素標記。
[0003]電化學發(fā)光(電致化學發(fā)光)，簡稱ECL，是通過電極對含有化學發(fā)光物質的體系施加一定的電壓或通過一定的電流，電極氧化還原產物之間或電極氧化還原產物與體系其它共存物質之間發(fā)生化學反應并生成某種不穩(wěn)定的中間態(tài)物質，該物質分解而產生的化學發(fā)光現象。電化學發(fā)光技術是電化學與化學發(fā)光相結合的檢測技術，該技術既集成了發(fā)光與電化學分析技術的優(yōu)點，又具有二者結合產生的可控性、選擇性、重現性好、靈敏度高、檢測限低及動力學響應范圍寬等新優(yōu)勢。

【發(fā)明內容】

[0004]針對測定DNA甲基轉移酶的現有技術靈敏度不高、測定方法復雜等缺陷，本發(fā)明旨在提供一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法及應用。
[0005] 申請人:擬設計含有甲基化特定位點的發(fā)夾DNA捕獲探針，利用限制性內切酶對識別位點甲基化敏感的特性，以不同的甲基轉移酶為例，建立快速甲基轉移酶活性的分析方法。同時，用此方法考察不同抗癌藥物對于甲基化轉移酶活性的影響，建立了一種在分子水平進行藥物篩選的新思路。本發(fā)明充分利用了核酸甲基化轉移酶、限制性內切酶和核酸分子探針的性質和功能，進一步發(fā)展了核酸分子技術在DNA-蛋白質(酶)相互作用研究中的應用，為研究生命活動過程提供了新的手段和方法。
[0006]鄰菲啰啉釕(Ru (Phen)32+)是常用的電化學發(fā)光物質，由于其良好的性能即在中性水溶液中能夠穩(wěn)定存在并且具有高靈敏度，因此在電化學發(fā)光傳感器中得到了廣泛的研究。近年來，納米材料成為人們研究的熱點領域，因此各種納米材料被用來負載Ru (Phen)32+和釕聯(lián)吡啶(Ru(bpy)32+)。氧化石墨烯(GO)是單層的氧化石墨構成的，因為具有高的表面體積比、在水中和有機溶劑中高的可分散性和它表面結合的廣泛的活性官能團，使得基于氧化石墨烯的材料在生物傳感的研究和應用有獨特的吸引力。最近石墨烯組裝Ru(bpy)32+復合物已經被報道，例如，利用全氟磺酸將Ru(bpy)32+固定在石墨烯上用于TPA的電化學發(fā)光檢測顯示了很好的靈敏性和穩(wěn)定性。氧化石墨烯組裝硫堇放大信號電化學檢測DNA甲基轉移酶的應用也已經有報道(Wen Li, Ping ffu, Hui Zhang, and Chenxin Ca1.AnalyticalChemistry, 2012，84，7583-7590)。與電化學發(fā)光試劑 Ru(bpy)32+相比，Ru(phen)32+具有更好的吸附性，氧化石墨烯帶有負電荷且其基面上還含有很多η共軛芳香基團，因此易于通過靜電作用、堆積作用與Ru(Phen)32+強烈結合并具有出色的長期穩(wěn)定性(Scott Gilje,Song Han,Minsheng Wang, Kang L.Wang, and Richard B.Kaner, NanoLetters, 2007，7，3394-3398;Yali Yuan, Haijuan Li, Shuang Han, Lianzhe Hu, SaimaParveen, Haoran Cai, and Guobao Xu.Anal.Chim.Acta, 2012, 720, 38 - 42.)。因此，基于氧化石墨烯對鄰菲啰啉釕高負載能力、良好的生物相容性和穩(wěn)定性，我們設計一種基于氧化石墨烯負載電化學發(fā)光活性物質對甲基酶活性的分析方法。
[0007]本發(fā)明提供一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法，包括如下步驟:
[0008]I)將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上；所述SI為含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA ；
[0009]2)以待測甲基轉移酶(Dam MTase)對步驟I)固定在電極上的SI進行甲基化；
[0010]3)用甲基化限制性內切酶(Dpn I)酶切步驟2)甲基化后的SI ；
[0011]4)以S2與步驟3)酶切后保留在電極上的SI雜交；所述S2為帶氨基的互補DNA ；
[0012]5)把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物(Ru (phen) 32+/G0)通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上；
[0013]6)對步驟5)的電極進行電化學發(fā)光檢測，由此測定待測的甲基轉移酶活性。
[0014]其中，所述SI的序列如下:
[0015]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3，(如 SEQ IDN0.1所示)。
[0016]其中，所述S2的序列如下:
[0017]5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0018]其中，步驟I)所述將SI通過金巰鍵固定在金電極上，具體步驟為:將金電極浸入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇(MCH)封閉，用PBS溶液淋洗金電極。
[0019]其中，步驟I)所述金電極為按如下方法預處理后的金電極:
[0020]在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈，然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?1.6V (vs.Ag / AgCl)電位范圍內以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗電極，并用隊吹干保存?zhèn)溆?。[0021]其中，步驟I)所述金電極的直徑優(yōu)選為2mm。
[0022]其中，步驟2)所述進行甲基化，所用反應體系為500yLlXDam buffer (50mMpH7.5 的 Tris-HCl，IOmM NaCl，IOmM EDTA，5mM 巰基乙醇)和 160mM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和待測甲基轉移酶。
[0023]其中，步驟2)所述進行甲基化，所用反應條件為37°C保溫60min。
[0024]其中，步驟3)所述酶切，所用反應體系為500 μ LlXNEB buffer4 (50mM KAc,20mMTris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT，pH7.9)和 80U Dpn I。
[0025]其中，步驟3)所述酶切，所用反應條件為37°C保溫2h。
[0026]其中，步驟4)所述雜交，所用反應體系為5yL2.ΟμΜ S2帶氨基的互補DNA，IOmMTris-HCl buffer,pH7.4。
[0027]其中，步驟5)所述氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物，通過如下方法制備:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg鄰菲啰啉釕的5 mL水溶液中，超聲15分鐘，室溫攪拌過夜，超聲5分鐘，每分鐘8000轉離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，去離子水和無水乙醇洗滌，干燥，得到氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物。
[0028]其中，所述氧化石墨烯以Hmnmers法制備。Hmnmers法制備的具體步驟優(yōu)選為在冰水浴中，將59g石墨粉和2.59g硝酸鈉與115mL的濃硫酸混合均勻，攪拌中緩慢加入15gKMnO4，保持2V以下持續(xù)反應I h，將其轉移至35°C水浴，反應30min逐步加入250mL去離子水，溫度升至98°C繼續(xù)反應15min后，可明顯觀察到混合物由棕褐色變成亮黃色，進一步連續(xù)加水稀釋，并用質量百分含量30%的H2O2，溶液處理，中和未反應的高錳酸鉀，將上述溶液趁熱抽濾除去大部分的水和強酸等，再將濾餅放入透析袋中，在體積百分含量的5%HCI溶液中洗滌，以除去金屬離子，再在蒸餾水中反復洗滌直到成中性，抽濾并將濾餅放入烘箱中80°C充分干燥得到氧化石墨烯。
[0029]其中，步驟5)把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上，具體為把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC, IOmM NHS in Tris-HCl buffer，pH7.4)活化 30min，把步驟 4)雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物溶液中180min，S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反應，使得氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物共價連接到步驟
4)雜交后的電極上。
[0030]其中，步驟6)所述進行電化學發(fā)光檢測，檢測液為含有0.02mol/LTPA的0.1mol/L PBS 溶液 2.0mL。
[0031]其中，步驟6)所述進行電化學發(fā)光檢測，在室溫下進行，將電解池置于暗盒中，連接好三電極體系，在O?+1.25V的電位范圍內，以100mV/S的掃速進行循環(huán)伏安掃描，記錄其ECL信號并進行定量分析。
[0032]本發(fā)明的另一目的是提供所述電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法的應用。
[0033]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0034]與現有技術相比，本發(fā)明涉及的電化學發(fā)光生物傳感器具有如下的優(yōu)點和顯著地進步:采用氧化石墨烯提供相對大的比表面積用于負載鄰菲啰啉釕，并且氧化石墨烯對鄰菲啰啉釕的負載采用的是非共價結合，相比于共價結合，非共價結合通過超分子反應如η-H堆積能有效地負載和易于操作并且能保持氧化石墨的電子結構。另外，根據實驗發(fā)光強度可以看出，氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物可以作為發(fā)光材料，并且對于沒有甲基轉移酶或者剪切酶的情況下，發(fā)光強度遠遠低于有甲基轉移酶和剪切酶的情況，這說明該傳感器對甲基轉移酶檢測有很高的選擇性。因此，本發(fā)明設計的基于氧化石墨烯電化學發(fā)光傳感器在構建對一些工具酶的研究方法中體現出良好地發(fā)展前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法的流程圖。
[0036]圖2為不同修飾電極的電化學阻抗圖(EIS)圖。其中，a為裸金電極；b為SI修飾電極；c SMCH/S1修飾電極；dSMCH/Sl修飾電極先后經Dam和Dpn I處理后的電極；e為Ru (phen) 32+/G0/S2/MCH/Sl 修飾電極。
[0037]圖3為不同修飾階段的電極經不同處理后的電化學發(fā)光曲線圖。其中，a為Img/mL Ru (phen) 32+/G0 和 0.02M TPA ；b 為 SI 修飾電極經 Dam、DpnI 和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；c 為SI 修飾電極經 DpnI 和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；d 為 SI 修飾電極直接和 S2、Ru (phen) 32+/G0 ；e為 S3 修飾電極經 Dam、DpnI 和 S2、Ru (phen) ^2+/GO0
[0038]圖4為發(fā)夾DNA的甲基化時間優(yōu)化結果圖。
[0039]圖5為Ru (phen) 32+/G0濃度優(yōu)化結果圖。
[0040]圖6為Ru (phen) 32+/G0的耦合時間優(yōu)化結果圖。
[0041]圖7為實施例1中氧化石墨烯(GO)和Ru (phen) 32+/G0的表征圖。其中，A為GO的透射電鏡圖，B為Ru (phen) 32+/G0的透射電鏡圖，C為GO和Ru (phen) 32+/G0的拉曼光譜，D為Ru (phen) 32+/GO 的能譜圖。
[0042]圖8為實施例1中不同濃度甲基轉移酶的ECL信號測定結果圖。其中，A為不同濃度甲基轉移酶的ECL信號響應，曲線a-j分別是濃度0，0.05，0.1, 0.2，0.5，1.0, 5.0, 10，20，40U/mL ;B為甲基轉移酶濃度與ECL信號的線性關系圖。
[0043]圖9為實施例2中不同慶大霉素濃度影響甲基轉移酶活性的測定結果圖。其中，A為不同慶大霉素濃度處理后ECL信號響應，B為不同濃度慶大霉素與相對活性曲線圖，慶大霉素的濃度分別是 0，0.1, 0.3，0.5，0.8，1.0, 2.0 μ Μ。
【具體實施方式】
[0044]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0045]本發(fā)明涉及的一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法，將SI含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA序列自組裝在金電極的表面，組成電化學發(fā)光生物傳感器；將修飾電極用甲基轉移酶甲基化，再用甲基化限制性內切酶切割，淋洗后，用S2帶氨基的互補DNA進行雜交，再將氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物通過EDC-NHS的耦合連接到電極上進行電化學發(fā)光檢測，以此來實現對甲基轉移酶的測定。
[0046]本發(fā)明是一種以電 化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法，具體的實驗原理如圖1所示，包括以下步驟:
[0047]I)將金電極(即裸金電極)侵入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，得到SI修飾電極，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗，得到MCH/S1修飾電極。金電極需預先進行如下處理:在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈，然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?1.6V (vs.Ag / AgCl)電位范圍內以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗，并用N2吹干保存?zhèn)溆谩?br> [0048]2)對發(fā)夾DNA進行甲基化，其中甲基化體系500 μ L包括50mM Tris-HCl pH7.5，IOmM NaCl, IOmM EDTA, 5mM 疏基乙醇(2-mercaptohexanol), 160mM SAM 和不同濃度的待測甲基轉移酶Dam MTase，37°C保溫60min。
[0049]3)將甲基化的修飾電極用限制性內切酶Dpn I酶切，其中酶切體系500 μ L包括IXNEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT, ρΗ7.9)和 80U Dpn I,37°C保溫2h。得到的電極為MCH/S1修飾電極先后經Dam和Dpn I處理后的電極。
[0050]4)將酶切過的修飾電極浸沒在5 μ L包含2.0 μ M S2DNA探針(inlOmM Tris-HClbuffer, pH7.4)，使保留在電極上的DNA末端與S2DNA雜交。
[0051]5)利用Hmnmers法制備出氧化石墨烯,再進一步合成氧化石墨烯負載鄰菲口羅啉釕復合物(Ru (phen) 32+/GO )；
[0052]Ru (phen) 32+/G0 使用前在 EDC-NHS 混合溶液中(5禮 EDC，IOmM NHS in Tris-HClbuffer, pH7.4))活化 30min ;把雜交后的電極浸沒在 500 μ Llmg/mL 的 Ru (phen) 32+/G0 溶液中 180min，得到 Ru (phen) 32+/G0/S2/MCH/Sl 修飾電極。
[0053]6)將修飾好的電極進行電化學發(fā)光測量，測量體系2.0mL0.10MPBS(pH7.4)包含
0.02M 三丙胺(TPA)。
[0054]針對上述不同修飾階段的電極繪制電化學阻抗圖，見圖2。
[0055]為實驗上述不同修飾階段的電極經不同處理后的電化學發(fā)光行為，設置了 5個處理:a 金電極經 0.1OM PBS (pH7.4)包含 lmg/mL Ru (phen) 32+/G0 和 0.02M TPA 處理；b MCH/SI修飾的電極先后經100U/mL Dam, 50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復合物耦合；c MCH/S1修飾的電極直接經50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復合物耦合；d MCH/S1修飾的電極與S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復合物耦合；e MCH/S3修飾的電極分別經100U/mL Dam, 50U/mL Dpn I處理，S2雜交和Ru (phen) 32+/G0復合物耦合。ECL測量在
0.10M PBS (pH7.4)包含 0.02M TPA 中進行；掃描速度:0.lV/s，掃描范圍:0-+1.25V。
[0056]其中，SI為含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA序列:5’-HS-(CH2)6_TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA TCGCAAT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0057]S2 為帶氨基的互補 DNA 序列:5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA_3’(如 SEQ ID N0.2所示)
[0058]S3為不含有甲基化位點GATC的對照發(fā)夾DNA序列:5’-HS_ (CH2) 6_TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTCGA CTG CAAT-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)
[0059]具體結果見如圖3，采用SI含有甲基化位點GATC的對照發(fā)夾DNA的處理b電化學發(fā)光行為明顯，而采用S3不含有甲基化位點GATC的對照發(fā)夾DNA的處理e檢測到非常弱電化學發(fā)光行為。且氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物作為發(fā)光材料在沒有甲基轉酶或者剪切酶的情況下發(fā)光強度遠低于有甲基轉移酶和剪切酶的情況，因此本發(fā)明的傳感器對甲基轉移酶檢測有很聞的選擇性。
[0060]發(fā)明人還對本發(fā)明中的檢測條件進行了優(yōu)化，具體如下:
[0061](I)發(fā)夾DNA的甲基化時間。對甲基化處理設置0-120分鐘的不同的時間長度(20U/mL Dam, lmg/mL Ru (phen) 32+/G0, Ru (phen) 32+/G0和 S2 探針稱合 300min,其他參照上述步驟1)-6)進行)，在實驗結果如圖4所示，在甲基化時間60min時能達到發(fā)光強度的99%，在120min時達到最大，為了節(jié)省整個測試過程的時間，我們選擇甲基化時間為60min。
[0062](2) Ru (phen) 32+/G0 濃度。對 Ru (phen) 32+/G0 濃度設置 0-3.0mg/mL 的不同的濃度梯度(20U/mL Dam甲基化60min, Ru (phen) 32+/G0和S2探針稱合300min,其他參照上述步驟O-6)進行)，實驗結果如圖5所示，Ru (phen) 32+/G0濃度在O到0.5mg/mL時電化學發(fā)光強度增加的很快，在lmg/mL是達到最大值,因此，我們選擇Ru (phen) 32+/G0濃度為lmg/mL。
[0063](3) Ru (phen) 32+/GO的I禹合時間。對Ru (phen) 32+/GO f禹合時間設置不同的長度(20U/mL Dam甲基化60min, lmg/mL Ru (phen) 32+/G0,其他參照上述步驟I) -6)進行),實驗結果如圖6所示，耦合時間在10到IOOmin時電化學發(fā)光強度增加的很快，在180min是達到最大信號值，因此，我們選擇耦合時間為180min。
[0064]實施例1電化學發(fā)光生物傳感器檢測甲基轉移酶濃度
[0065]1.實驗部分
[0066]1.1儀器和試劑
[0067]MP1- E型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI660D型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司);TGL - 16G型離心機(上海安亭科學儀器廠);KH3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Mill1-Q型超純水儀(美國Millipore公司)；實驗采用三電極系統(tǒng):修飾有發(fā)夾DNA的金電極工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0068]石墨粉(99.998%)，三-(2_羧乙基)磷酸鹽酸鹽(TCEP，98%)，N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，乙基{3- (二甲氨基)丙基}碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，三丙胺(TPA)，6-巰基己醇(MCH)，鄰菲啰啉釕(Ru(phen)32+)，以上試劑都購自西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)有限公司，使用時無需二次純化。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，E.coli甲基轉移酶Dam，E.coli限制性內切酶Dpn I購買于北京紐英倫生物技術有限公司。寡聚核苷酸鏈購自上海生物工程有限公司，堿基序列如下:
[0069]SI (含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA):
[0070]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTC GATCGCAAT-3，(如 SEQ IDN0.1所示)
[0071]S2 (帶氨基的互補DNA):
[0072]5’-NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0073]S3 (不含有甲基化位點GATC的對照發(fā)夾DNA):
[0074]5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGACTGAGAATGCTTTTGCATTCTC GACTG CAAT-3，(如 SEQ IDN0.3所示)
[0075]1.2實驗步驟
[0076]1.2.1氧化石墨烯以及Ru (phen) 32+/G0復合物的合成
[0077]冰水浴中，將59g石墨粉和2.59g硝酸鈉與115mL的濃硫酸混合均勻，攪拌中緩慢加入15g KMnO4，保持2°C以下持續(xù)反應I h，將其轉移至35°C水浴，反應30min逐步加入250mL去離子水，溫度升至98 °C繼續(xù)反應15min后，可明顯觀察到混合物由棕褐色變成亮黃色，進一步連續(xù)加水稀釋，并用質量百分含量30%的H2O2，溶液處理，中和未反應的高錳酸鉀，將上述溶液趁熱抽濾除去大部分的水和強酸等，再將濾餅放入透析袋中，在體積百分含量的5%HCI溶液中洗滌，以除去金屬離子，再在蒸餾水中反復洗滌直到成中性，抽濾并將濾餅放入烘箱中80°C充分干燥得到氧化石墨烯。
[0078]把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg的鄰菲P羅啉釕的5mL的水溶液中，對混合溶液超聲15分鐘后，在室溫下攪拌過夜。之后對混合溶液超聲5分鐘，用每分鐘8000轉離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，接著用去離子水和無水乙醇進行洗滌，最后在真空干燥箱中干燥，得到 Ru(phen)32+/G0。
[0079]制得的氧化石墨烯(GO)和Ru (phen) 32+/G0復合物的表征圖見圖7。
[0080]圖7A為GO的透射電鏡圖(TEM)，B為Ru (phen) 32+/G0的透射電鏡圖(TEM)，圖中合成的氧化石墨烯及其復合物層數很少，呈半透明并且有一些褶皺。圖7C為GO和Ru(Phen)32VGO的拉曼光譜，從圖中可以看出樣品的D和G峰，ID/IG的比率經?？梢杂米髡故臼奶紭悠飞系幕瘜W修飾水平。GO和Ru(phen)327G0的ID/Ie比率分別是0.78和
0.81，這個增加的比率反映了無序程度的增加，因為氧化石墨烯上的供體原子導致的。此夕卜，圖7D為Ru(phen)327G0的能譜圖，由圖中可以看出這個復合物由三種元素構成，說明Ru (phen) 32+/GO復合物的合成成功。
[0081]1.2.2電化學發(fā)光生物傳感器的構建
[0082]1.金電極的處理。金電極(Φ=2πιπι)在麂皮上分別用0.3和0.05 μ m的氧化鋁粉末仔細拋光打磨至鏡面，再用水、無水乙醇分別超聲洗滌2min，以除去電極表面粘附的氧化鋁粉末，最后用Mill1-Q水淋洗干凈。然后將電極置于0.lmol/L H2SO4溶液中在-0.2?
1.6V(vs.Ag/AgCl)電位范圍內以100mV/s的掃速掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖，隨后用Mill1-Q水淋洗，并用N2吹干保存?zhèn)溆谩?br> [0083]2.電化學發(fā)光生物傳感器的制備。將處理過的金電極侵入到2 μ MSl的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗金電極。從而制得電化學發(fā)光生物傳感器。
[0084]1.2.3電化學發(fā)光檢測DNA甲基轉移酶
[0085]對發(fā)夾DNA進行甲基化，其中甲基化體系500 μ L包括50mM Tris-HCl pH7.5, IOmMNaCl, IOmM EDTA, 5mM2-mercaptohexanol, 160mM SAM 和不同濃度的 Dam MTase,37°C保溫60min ;將甲基化的修飾電極用限制性內切酶Dpn I酶切，其中酶切體系500 μ L包括I XNEBbuffer4 (50mM KAc,20mM Tris-Ac, 10 mM Mg (Ac) 2, ImM DTT，ρΗ7.9)和 80U Dpn I，37°C保溫2h ;將酶切過的修飾電極浸沒在5 μ L包含2.0 μ M S2DNA探針(inlOmM Tris-HCl buffer,pH7.4)，使保留在電極上的DNA末端與S2DNA雜交。把雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的Ru(phen)327G0溶液中ISOmin ;將修飾好的電極進行電化學發(fā)光測量，測量體系
2.0mL0.10M PBS (pH7.4)包含0.02M TPA，將電解池置于暗盒中，連接好三電極，在0-+1.25的電位范圍內，以0.lV/s的掃速進行循環(huán)伏安掃描記錄其ECL信號并進行定量分析，結果見圖8。[0086]1.3結果與討論
[0087]本發(fā)明在優(yōu)選的最佳的實驗條件下，研究了不同濃度的甲基轉移酶與電化學發(fā)光強度的關系，得到了甲基轉移酶的標準曲線，線性范圍及線性方程。
[0088]在最佳的實驗條件下，當甲基轉移酶的濃度在0.05U/mL至40U/mL范圍內，隨著甲基轉移酶Dam濃度的增加，電化學發(fā)光信號逐漸增強，其線性方程為1=912.32+545.78IgC (C 的單位 U/mL), r = 0.9976。
[0089]與已報道的用于檢測MTase活性的方法比較，結果見表1:本發(fā)明的方法線性范圍更寬，檢出限更低(0.02U/mL，S/N=3)。0.5U/mL的甲基轉移酶的相對標準偏差是
4.65%(n=5)。表明此方法有較好的靈敏度和重現性。
[0090]表1不同檢測甲基轉移酶方法的檢出限
[0091]
【權利要求】
1.一種以電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上；所述SI為含有甲基化位點GATC的發(fā)夾DNA序列； 2)以待測甲基轉移酶對步驟I)固定在電極上的SI進行甲基化； 3)用甲基化限制性內切酶酶切步驟2)甲基化后的SI； 4)以S2與步驟3)酶切后保留在電極上的SI雜交；所述S2為帶氨基的互補DNA； 5)把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上； 6)對步驟5)的電極進行電化學發(fā)光檢測，由此測定待測的甲基轉移酶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述SI的序列如下:
5，-HS-(CH2)6-TACTGATTGCGATCGAGAATGCTTTTGCATTCTCGATCGCAAT-3，(如 SEQ ID N0.1所示)； 所述S2的序列如下:
5’ -NH2-(CH2) 6-TCGCAATCAGTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述將SI通過金巰鍵自組裝固定在金電極上，具體步驟為:將金電極浸入到2 μ M SI的500uL的緩沖溶液中37°C固定4小時，在金電極表面形成自組裝膜，用PBS溶液淋洗去除非特異性吸附的SI，再用ImM的6-巰基己醇封閉，用PBS溶液淋洗金電極。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述進行甲基化，所用反應體系為500 μ LlXDam buffer (50mM pH7.5 的 Tris-HCl，IOmM NaCl, IOmM EDTA，5mM 巰基乙醇)和160mMS-腺苷甲硫氨酸和待測甲基轉移酶。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述進行甲基化，所用反應條件為37°C 保溫 60min。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述酶切，所用反應體系為500 μ LlXNEB buffer4(50mM KAc,20mM Tris-Ac, IOmM Mg(Ac)2, ImM DTT，ρΗ7.9)和 80U Dpn I。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述雜交，所用反應體系為5 μ L2.0 μ M S2 帶氨基的互補 DNA，IOmM Tris-HCl buffer, pH7.4。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)所述氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物，通過如下方法制備:把3mg氧化石墨烯加入到含有0.5mg鄰菲P羅啉釕的5mL水溶液中，超聲15分鐘，室溫攪拌過夜，超聲5分鐘，每分鐘8000轉離心10分鐘去除多余的鄰菲啰啉釕，去離子水和無水乙醇洗滌，干燥，得到氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物通過EDC-NHS的耦合連接到步驟4)雜交后的電極上，具體為把氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物使用前在EDC-NHS混合溶液中(5mM EDC，IOmM NHS in Tris-HCl buffer,pH7.4)活化30min，把步驟4)雜交后的電極浸沒在500 μ Llmg/mL的氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物溶液中180min，S2上的氨基和氧化石墨烯活化的羧基反應，使得氧化石墨烯負載鄰菲啰啉釕復合物共價連接到步驟4)雜交后的電極上。
10.權利要求1-9任一項所述電化學發(fā)光生物傳感器檢測DNA甲基轉移酶的方法的應用。
【文檔編號】G01N21/69GK103901020SQ201410128514
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權日:2014年3月31日
【發(fā)明者】李延, 閆曌 申請人:西北大學